快速鑒定瓜類疫病抗性方法的建立及黃瓜種質(zhì)資源鑒定

王 瑞，林毓娥，杜 虎，金慶敏，楊曉珊，吳廷全

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所/廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】瓜類疫病是由瓜類疫霉（Phytophthora melonisKatsura）引起的毀滅性病害[1]，可以侵染黃瓜、冬瓜、節(jié)瓜、南瓜等瓜類作物[2]。瓜類疫病在全國(guó)各地均有發(fā)生，特別是華南地區(qū)春、夏季節(jié)雨水多、濕度大，易引起疫病的爆發(fā)和傳播。該病一旦發(fā)生，化學(xué)藥劑難以控制，損失嚴(yán)重，一般年份減產(chǎn)30%，病害流行年份則幾乎絕收，對(duì)瓜類生產(chǎn)和育種構(gòu)成嚴(yán)重威脅。目前尚未有有效化學(xué)手段防治該病害，發(fā)掘瓜類抗性基因資源、培育抗性品種是控制這一病害最有效的策略，因此建立快速鑒定瓜類疫病抗性方法尤為重要?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】早在1981年翁祖信等[3]就提出菌絲塊活體接種黃瓜幼苗的方法，1983年又提出用孢子懸浮液接種活體黃瓜幼苗，均可引起植株發(fā)病。賴?yán)蛴竦萚4]采用涂抹濃度為102個(gè)孢子/mL的菌液法對(duì)135份山東黃瓜品種資源進(jìn)行抗疫病鑒定，篩選到21份抗性品種材料。王平勇等[5]利用1×106/mL的孢子懸浮液灌根接種166份甜瓜材料，篩選到14份抗疫病甜瓜材料。柴喜榮等[6]利用5×103個(gè)孢子/mL濃度的孢子懸浮液灌根接種黃瓜材料，沒有篩選到抗性材料，并對(duì)其接種后防御相關(guān)酶進(jìn)行研究。周克琴、劉學(xué)敏等均對(duì)南瓜疫病抗性苗期接種方法進(jìn)行了研究[7-8]。以上方法能夠篩選到一定的抗病材料，但無論是活體接種[9]、灌根、噴霧還是注射接種，都容易將病原菌帶到田間引起集中爆發(fā)，不利于疫病的防治工作；同時(shí)，疫病致死率高，不容易保存中間材料及感病材料，極大影響了抗性基因的相關(guān)研究工作[10]。此外，常規(guī)鑒定方法對(duì)發(fā)病條件要求苛刻，需要提供穩(wěn)定的溫度和濕度，一般光照培養(yǎng)箱難以滿足大量材料的鑒定?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】基于以上問題，本研究以黃瓜為例，擬建立一個(gè)快速、精準(zhǔn)、高通量、安全有效的疫病抗性鑒定技術(shù)體系。選擇兩個(gè)抗感差異明顯的黃瓜材料為研究對(duì)象，探討葉片離體接種方法的條件，并通過與灌根法、噴霧法、浸泡法進(jìn)行比較，最終建立室內(nèi)離體快速鑒定瓜類疫病的技術(shù)體系；同時(shí)利用離體葉片接種法對(duì)40份黃瓜資源進(jìn)行疫病抗病性鑒定，以期為瓜類的抗病育種奠定基礎(chǔ)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】建立離體接種快速鑒定瓜類疫病技術(shù)體系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試黃瓜抗性材料JSH和感病材料B80，以及用于抗性篩選40份黃瓜種質(zhì)資源材料，均由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所林毓娥研究員提供。試驗(yàn)于2018年12月20日至2019年1月15日在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 孢子懸浮液的制備 將10% V8培養(yǎng)液倒入滅菌培養(yǎng)皿（直徑9 cm）中，每皿15～20 mL。將新鮮培養(yǎng)的疫霉菌菌絲塊（大小約2 mm×2 mm）8～10塊移入培養(yǎng)液中，在25 ℃、黑暗條件下培養(yǎng)2～3 d。待菌絲叢形成后，傾去培養(yǎng)液，用15～20 mL滅菌水沖洗懸浮菌絲叢2次，置于25 ℃、黑暗中培養(yǎng)，直至孢子大量產(chǎn)生[11]。用紗布過濾菌絲，用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定孢子濃度，并稀釋到所需濃度。

1.2.2 接種方法 （1）灌根法：黃瓜待測(cè)材料及抗、感對(duì)照材料播種于10 cm×10 cm盆缽中，置于光照培養(yǎng)箱（白天28 ℃、晚上26 ℃，濕度均為85%）中培養(yǎng)20 d，瓜類疫霉菌孢子懸浮液調(diào)整至102、103、104個(gè)孢子/mL，每個(gè)盆缽灌根30 mL，置于光照培養(yǎng)箱中溫度28 ℃、濕度90%、黑暗培養(yǎng)24 h，之后在白天30 ℃、晚上28 ℃、濕度90%條件下繼續(xù)培養(yǎng)，3 d后調(diào)查發(fā)病情況。

（2）噴霧法：將培養(yǎng)20 d的黃瓜材料置于密閉容器內(nèi)，分別噴霧102、103、104孢子懸浮液，每個(gè)濃度處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3 d后觀察發(fā)病情況。

（3）浸根法：將培養(yǎng)20 d的黃瓜植株根部土壤洗凈，分別浸泡在102、103、104孢子懸浮液中，置于光照培養(yǎng)箱（白天28 ℃、晚上26 ℃，濕度均為90%）中，每個(gè)濃度處理3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10株，24 h后觀察發(fā)病情況。

（4）菌塊離體接種法：利用V8、PDA或皮氏培養(yǎng)基（固體）在28 ℃條件下黑暗培養(yǎng)瓜類疫霉菌3～4 d，將黃瓜待測(cè)材料及抗、感對(duì)照材料播種于盆缽中，置于光照培養(yǎng)箱（白天28 ℃、晚上26 ℃，濕度均為85%）中培養(yǎng)7 d。用打孔器或改造后的移液器槍頭切取菌圈周圍最新鮮的微菌塊（直徑約2 mm），取黃瓜子葉，將其背面向上置于培養(yǎng)皿中的濕潤(rùn)濾紙上，將微菌塊菌絲向下放置于黃瓜子葉上；將接種疫霉菌后的黃瓜子葉置于28 ℃培養(yǎng)皿中黑暗培養(yǎng)24 h，將黃瓜子葉從培養(yǎng)皿中取出并拍照，利用Photoshop軟件[12]準(zhǔn)確測(cè)量病斑面積，并將其與感病對(duì)照進(jìn)行比較，病斑面積占感病對(duì)照病斑面積的0～5%（含5%）為（高抗HR）材料、占5%～20%（含20%）為（抗病R）材料、占20%～40%（含40%）為（感病S）材料、占40%以上為（高感HS）材料

1.2.3 黃瓜抗病種質(zhì)資源的篩選 用本研究建立的菌塊離體接種方法對(duì)40份黃瓜資源進(jìn)行抗性鑒定，同時(shí)將其種植于田間常年多發(fā)疫病地塊，調(diào)查自然發(fā)病結(jié)果，用于比較室內(nèi)人工接種實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel和方差分析軟件進(jìn)行處理和作圖，采用單因素方差分析和兩因素隨機(jī)區(qū)組法進(jìn)行差異顯著性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種方法的篩選

2.1.1 浸根法 將植株根部浸泡在孢子懸浮液中，浸泡24 h即可發(fā)病，102個(gè)孢子/mL濃度接種處理感病材料B80有6株萎蔫，根部開始出現(xiàn)水燙狀、溢縮，全部萎蔫發(fā)病率達(dá)98%；抗性材料JSH幾乎無感病癥狀，發(fā)病率為2.22%。103個(gè)孢子/mL濃度接種處理B80根部全部溢縮、萎蔫嚴(yán)重，發(fā)病率100%；JSH出現(xiàn)萎蔫癥狀，5株子葉發(fā)黃、根部無變化，發(fā)病率17.78%。104個(gè)孢子/mL濃度接種處理JSH和B80均全部萎蔫，其中B80根部開始腐爛、發(fā)病率100%，JSH根部溢縮、枯萎，發(fā)病率100%（圖1）。

圖1 浸泡法接種黃瓜抗感材料發(fā)病率Fig.1 Incidence rate of infested cucumber cultivars by soaking method

2.1.2 噴霧法 噴霧法接種JSH、B80 材料48 h后，104個(gè)孢子/mL濃度接種處理B80全部植株萎蔫，莖呈水燙狀，根部腐爛，發(fā)病率100%；JSH接種后表現(xiàn)為2/3植株呈水燙萎蔫狀，葉片呈黃色病斑發(fā)病率91%。103個(gè)孢子/mL濃度接種處理JSH的發(fā)病率為46%株，B80的發(fā)病率為100%。102個(gè)孢子/mL濃度接種處理JSH、B80無發(fā)病，但在72 h后JSH植株發(fā)病率為5.55%，B80植株發(fā)病率為97%（圖2）。

2.1.3 灌根法 用孢子懸浮液灌根接種10 d苗齡的JSH、B80，接種后3 d開始出現(xiàn)發(fā)病狀態(tài)。其中，102個(gè)孢子/mL濃度接種處理B80發(fā)病率為100%，JSH發(fā)病率為2%。103個(gè)孢子/mL濃度接種處理JSH發(fā)病率為19%，B80發(fā)病率為100%。104個(gè)孢子/mL濃度接種處理JSH發(fā)病率67%，B80發(fā)病率100%（圖3）。

圖3 灌根法接種黃瓜抗感材料發(fā)病率Fig.3 Incidence rate of infested cucumber cultivars by root pouring method

2.1.4 菌塊離體接種法 將菌塊放置于離體子葉進(jìn)行接種，接種后24 h即可發(fā)病，在24～36 h調(diào)查結(jié)果比較好，這個(gè)時(shí)間能夠明確分辨出抗感差異?？剐圆牧螶SH部分葉片只在菌塊覆蓋部位出現(xiàn)點(diǎn)狀失綠病斑，甚至無病斑，而感病材料B80的葉片1/3～1/2葉片出現(xiàn)失綠病斑，嚴(yán)重時(shí)整片葉子開始腐爛（圖4）。

圖4 菌塊接種法接種JSH和B80 24 h后結(jié)果Fig.4 Result of inoculation of JSH and B80 for 24 hours by mycelial pellet inoculation

2.2 黃瓜抗病種質(zhì)資源篩選結(jié)果

采用菌塊離體接種鑒定方法，對(duì)40份黃瓜材料進(jìn)行抗疫病鑒定。結(jié)果（表1）發(fā)現(xiàn)，根據(jù)抗病種質(zhì)資源病斑面積占感病對(duì)照病斑面積比例，PE40、PE119、PE120、PE185為相對(duì)抗病品種，占所測(cè)品種的10%，其余90%品種均感病或者高感疫病。所測(cè)40份黃瓜育種材料中，除抗病對(duì)照J(rèn)SH外，沒有高抗疫病的種質(zhì)資源，該鑒定結(jié)果與田間自然發(fā)病條件結(jié)果相似，這也與以往學(xué)者“黃瓜資源抗疫病材料匱乏，華南型吊瓜類型比刺瓜類型較抗疫病”的研究結(jié)果相似。

表1 不同黃瓜種質(zhì)資源抗病性鑒定結(jié)果Table 1 Result of identification of phytophthora blight resistance of different cucumber germplasm resources

3 討論

接種鑒定是抗病育種的一個(gè)重要手段，因此建立一套方便、快捷、準(zhǔn)確、高效的室內(nèi)鑒定方法勢(shì)必能讓抗病育種工作事半功倍。對(duì)于卵菌引起的病害常用接種鑒定方法已有較多研究[11-14]，有報(bào)道認(rèn)為點(diǎn)滴法、灌根法、噴霧法、菌液浸泡法、注射法、涂抹法等均能在一定程度上鑒定出材料的抗感性差異，但均采用活體接種，不能保存感病材料和中間材料，不能滿足構(gòu)建群體的試驗(yàn)要求。其中，常用的灌根法接種接近田間發(fā)病狀態(tài)[15]，但是發(fā)病不穩(wěn)定，需要多次重復(fù)試驗(yàn)才能得出可靠結(jié)果；噴霧法接種發(fā)病時(shí)間較長(zhǎng)、發(fā)病較重，而且噴霧不均勻、噴霧量控制要求較嚴(yán)格，否則無法鑒別出抗感品種；浸根法接種植株發(fā)病快，但需要洗根，只適合少量材料的接種鑒定工作。以上3種方法及注射法、涂抹法接種都需要誘導(dǎo)大量疫霉菌孢子，而瓜類疫霉菌孢子難以誘發(fā)，這增加了孢子培養(yǎng)和孢子懸浮液制備的工作量，浪費(fèi)人力和物力；同時(shí)，以上活體接種不能保存遺傳分析過程中的感病材料，這給抗病育種工作造成很多困擾。菌塊接種法在南瓜上已有研究[8]，但是采用活體接種無法避免材料損害問題。離體接種法在很多病害和作物上已有大量研究[16-17]；任莉等[18]比較了離體葉片接種、離體莖段接種（牙簽法）、活體莖稈接種（牙簽法）、活體葉柄接種（吸頭法）4種接種方法，測(cè)定5種油菜資源對(duì)菌核病的抗病性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)利用移液管介導(dǎo)的葉柄接種是一種便捷可靠的油菜菌核病抗性鑒定方法；齊振宇等[19]采用人工氣候箱活體接種和離體葉片圓盤接種兩種方法對(duì)6個(gè)甜瓜白粉病病原菌生理小種鑒別寄主進(jìn)行白粉病接種試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)離體葉片圓盤接種法發(fā)病時(shí)間短，圓盤周圍有傷口容易被雜菌污染，從而影響了甜瓜白粉病病原菌的生長(zhǎng)，因此不能準(zhǔn)確分辨出材料的抗感差異；劉淼等[10]探討了離體葉片接種法鑒定野生大豆抗病性的準(zhǔn)確性和可靠性，結(jié)果表明離體葉片接種法與下胚軸接種法之間的相關(guān)呈極顯著，且兩種方法差異不顯著，證明離體葉片接種法接種大豆疫霉根腐抗性準(zhǔn)確可行；姚協(xié)豐等[20]研究了甜瓜鏈格孢葉斑病活體和離體接種方法，最后確定離體接種可以有效鑒定甜瓜資源的抗性。可見，離體接種方法在抗性鑒定中應(yīng)用廣泛，根據(jù)鑒定材料和病原菌的不同，鑒定效果也有差異。本研究建立的菌塊接種法，利用微小菌塊放置于離體黃瓜子葉背面，于光照培養(yǎng)箱適宜溫度培養(yǎng)，接種培養(yǎng)24 h即可發(fā)病。發(fā)病速度快，調(diào)查時(shí)間就顯得尤為重要，應(yīng)該在抗感對(duì)照差異明顯時(shí)及時(shí)記錄發(fā)病數(shù)據(jù)。另外，由于瓜類疫霉菌孢子誘導(dǎo)程序復(fù)雜，菌塊接種無需誘孢，而且對(duì)菌塊需求量少，利用培養(yǎng)基能夠快速、大量培養(yǎng)菌塊，大大節(jié)省了檢測(cè)過程的病原菌制備時(shí)間。

4 結(jié)論

本研究利用Photoshop軟件計(jì)算病斑面積，將感病對(duì)照與鑒定材料同時(shí)拍照，利用Photoshop軟件即能精確計(jì)算病斑面積，將病斑大小量化，易于比較。本研究建立的方法將病斑占比作為發(fā)病程度標(biāo)準(zhǔn)，綜合對(duì)照NY/T 1857-2010《黃瓜主要病害抗病性鑒定技術(shù)規(guī)程》及抗感差異的統(tǒng)計(jì)分析，將病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)定為HR（高抗）、R（抗?。?、S（感病）、HS（高感）材料4級(jí)。如此分級(jí)不僅能夠有效區(qū)分抗感材料，而且能真實(shí)反映材料抗感水平。通過本方法鑒定的40份黃瓜材料的抗感情況與田間自然發(fā)病條件的抗感水平一致。與其他鑒定方法相比，本鑒定方法具有操作方便，鑒定時(shí)間短、能一次性大批量鑒定材料、且可保存重要種子資源等優(yōu)點(diǎn)。本鑒定方法以黃瓜為例，同時(shí)適用冬瓜、節(jié)瓜、南瓜等易感疫病的瓜類。