核酸適配體生物傳感技術(shù)在沙門氏菌定量檢測中的應(yīng)用

班美靜，滿 燕，潘立剛

（1.北京市農(nóng)林科學(xué)院/北京農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究中心/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室(北京)/農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地環(huán)境監(jiān)測北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097；2.北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，北京 102206）

沙門氏菌（Salmonella）是導(dǎo)致食源性疾病的主要原因之一，可引起胃腸炎和腹瀉疾病，還會(huì)引起動(dòng)物傷寒、副傷寒、霍亂等疾病發(fā)生。沙門氏菌廣泛存在于自然環(huán)境中，因此在新鮮農(nóng)產(chǎn)品和動(dòng)物飼料生產(chǎn)過程中的任何環(huán)節(jié)都可能發(fā)生沙門氏菌污染。在世界各國發(fā)生的細(xì)菌性食物中毒中，沙門氏菌常位列榜首。因此，為防止和減少沙門氏菌對人類健康造成危害，建立沙門氏菌快速檢測方法成為食品安全領(lǐng)域日益增長的需求。

目前，沙門氏菌的檢測方法主要有：基于細(xì)菌理化差異的平板菌落計(jì)數(shù)（培養(yǎng)）法、基于抗原與抗體免疫反應(yīng)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、基于DNA擴(kuò)增的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）（常規(guī)PCR、定量PCR等）。平板菌落培養(yǎng)法是沙門氏菌檢測的最傳統(tǒng)、最常用檢測方法，但其勞動(dòng)強(qiáng)度大、耗時(shí)長，一般至少需要3～5 d，因此不能用于現(xiàn)場檢測。ELISA具有特異性強(qiáng)、通量高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，在沙門氏菌檢測中得到廣泛應(yīng)用。然而，這是一種多相檢測方法，需要多次洗滌，可能會(huì)導(dǎo)致交叉污染和假陽性，另外，其缺乏足夠的靈敏性，通常有一個(gè)低檢出限104CFU/mL[1]。PCR方法具有高的檢測靈敏度、時(shí)間短，但其需要復(fù)雜的DNA提取過程，對技術(shù)人員要求較高。

近年來，生物傳感技術(shù)以及納米材料的迅速發(fā)展，推動(dòng)了基于抗原/抗體、核酸適配體、酶、細(xì)胞、仿生受體、噬菌體等傳感元件的光學(xué)、電化學(xué)、表面增強(qiáng)拉曼散射（Surface Eenhanced Raman Scattering，SERS）、石英晶體微量天平（Quartz Crystal Microbalance，QCM）等多種檢測食源性致病菌的快速、高靈敏檢測方法的迅速發(fā)展。其中，核酸適配體是一種短的核酸序列，具有特異性強(qiáng)、親和力高、合成速度快、重現(xiàn)性好、修飾方便等優(yōu)點(diǎn)?；诤怂徇m配體的生物傳感器被稱為核酸適配體傳感器，已被廣泛應(yīng)用于食源性致病菌的定量檢測，且正在逐步取代以抗原/抗體為基礎(chǔ)的免疫生物傳感器。本文就核酸適配體生物傳感技術(shù)在沙門氏菌定量檢測中的應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 沙門氏菌核酸適配體

核酸適配體是利用指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技 術(shù)（systematic evolution of ligandsby exponential enrichment，SELEX）從一種人工合成的寡核苷酸文庫中篩選得到的能與靶分子高親和性和高特異性性結(jié)合的單鏈寡核苷酸。近年來，為提高篩選效率、簡化篩選過程，開發(fā)了多種SELEX新技術(shù)，如親和層析SELEX、毛細(xì)管電泳SELEX、全細(xì)胞SELEX和加尾SELEX技術(shù)等，這些新型篩選技術(shù)極大促進(jìn)了核酸適配體在各個(gè)領(lǐng)域的發(fā)展和應(yīng)用[2]。

在沙門氏菌核酸適配體的篩選（表1）方面，WANG等[3]利用全細(xì)胞SELEX技術(shù)，篩選得到了鼠傷寒沙門氏菌的ssDNA核酸適配體，Kd值為6.33（±0.58）nmol/L。Lee等[4]利用傳統(tǒng)全細(xì)胞SELEX技術(shù)篩選得到鼠傷寒沙門氏菌的RNA適配體，這種RNA核酸適配體具有抗RNA酶的作用，其Kd值約為20 nmol/L。近年來，Li等[5]建立了一種基于石英晶體微天平（QCM）的SELEX技術(shù)，并篩選得到鼠傷寒沙門氏菌的ssDNA核酸適配體，Kd值為58.5 nmol/L。通過對比發(fā)現(xiàn)，通過傳統(tǒng)的SELEX篩選技術(shù)得到的ssDNA核酸適配體的親和力要高于RNA核酸適配體；而通過新型基于QCM的SELEX技術(shù)得到的ssDNA核酸適配體的親和力要高于傳統(tǒng)SELEX篩選技術(shù)，且新型篩選方法速度快、效率高、成本低。近年來，利用上述SELEX篩選技術(shù)得到的核酸適配體，科學(xué)家們已經(jīng)建立了多種新型核酸適配體生物傳感檢測方法，并將其應(yīng)用于沙門氏菌的定量檢測中。本文基于核酸適配體的生物傳感技術(shù)在沙門氏菌定量檢測中的應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行了詳細(xì)概述，并對這些檢測方法進(jìn)行詳細(xì)對比（表2）。

2 核酸適配體生物傳感技術(shù)在沙門氏菌定量檢測中的應(yīng)用

2.1 比色檢測

比色法（Colorimetry）是通過比較或測量有色物質(zhì)溶液顏色深度來確定待測組分含量的方法。作為一種最簡單的傳感檢測方法，已被廣泛應(yīng)用于沙門氏菌的定量檢測。

表1 沙門氏菌核酸適配體篩選Table 1 Screening of Salmonella aptamer

表2 適配體生物傳感技術(shù)在沙門氏菌定量檢測中的應(yīng)用情況比較Table 2 Comparison of application of aptamer biosensor technology in the quantitative detection of Salmonella

2.1.1 鹽誘導(dǎo)金納米顆粒聚集 金納米顆粒（Gold nanoparticles，GNPs）在分散和聚集狀態(tài)下具有不同的外觀顏色，根據(jù)這一特性，科學(xué)家們建立了多種基于鹽誘導(dǎo)GNPs聚集的比色生物傳感檢測方法。如MA等[6]將沙門氏菌核酸適配體包被于GNPs表面，當(dāng)樣品中含有目標(biāo)分子沙門氏菌時(shí)，適配體與沙門氏菌專一性結(jié)合，致使適配體從GNPs-適配體復(fù)合物的表面脫離，釋放出GNPs。當(dāng)加入NaCl時(shí)，則會(huì)導(dǎo)致GNPs的聚集，GNPs溶液的顏色由紅色變成紫色甚至深藍(lán)色。該方法得到沙門氏菌的檢測范圍為102～107CFU/mL，最低檢測限為56 CFU/mL。WU等[7]利用相同的檢測原理，實(shí)現(xiàn)了沙門氏菌和大腸桿菌的定量檢測，最低檢測限為105CFU/mL。該檢測方法具有簡單、快速、成本低的優(yōu)點(diǎn)，但其檢測靈敏度相對比較低。

2.1.2 銀還原放大比色信號 為進(jìn)一步提高靈敏度，Yuan等[8]提出了一種銀還原的比色生物傳感檢測方法。通過生物素親和素的相互作用，沙門氏菌的適配體被固定于微孔板；另外，巰基修飾的適配體被固定于GNPs。當(dāng)沙門氏菌存在于樣品中，形成適配體-沙門氏菌-適配體-GNPs三明治復(fù)合物；然后，利用銀放大溶液增強(qiáng)比色信號，肉眼即可對沙門氏菌進(jìn)行定量檢測，得到沙門氏菌的最低檢測限為7 CFU/mL。這種銀還原放大比色信號的方法，可大大提高沙門氏菌的檢測靈敏度，具有簡單、快速、無需檢測儀器的優(yōu)點(diǎn)。

2.1.3 磁納米顆粒對GNPs的高消光系數(shù)特性 磁納米顆粒（Magnetic Nanoparticles,MNPs）除具有較大的比表面積、豐富的功能基團(tuán)外，還具有良好的磁響應(yīng)強(qiáng)度及對GNPs的高消光系數(shù)等優(yōu)良特性[9]。根據(jù)這一特性，DUAN等[10]將巰基修飾適配體和生物素修飾適配體分別固定在于GNPs和MNPs表面；當(dāng)沙門氏菌目標(biāo)物存在于樣品中時(shí)，適配體與沙門氏菌高專一性結(jié)合，形成GNPs-適配體-沙門氏菌-適配體-磁珠復(fù)合物；磁分離后，GNPs在懸浮液中的含量降低，因此懸浮液顏色變淺，相應(yīng)其UV吸光度也會(huì)降低。利用該方法得到沙門氏菌的檢測范圍為25～105CFU/mL，最低檢測限為10 CFU/mL。與上述微孔板中銀還原方法相比，這種在磁納米顆粒上進(jìn)行核酸適配體的固定、磁納米復(fù)合物的分離純化等過程都相對比較簡單、快速，且降低交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。

2.1.4 酶催化 MNPs除具有高消光系數(shù)的特性外，還具有酶催化活性。Park等[11]利用MNPs的催化活性以及無標(biāo)記核酸適配體，構(gòu)建了一種核酸適配體生物傳感檢測方法。首先，表面帶負(fù)電荷的核酸適配體被吸附到表面帶正電荷的MNPs上，這種吸附作用會(huì)阻礙MNPs的催化活性；當(dāng)沙門氏菌目標(biāo)物存在時(shí)，適配體從磁珠上脫離，MNPs的催化活性恢復(fù)，導(dǎo)致底物四甲基聯(lián)苯胺（TMB）溶液顏色變成藍(lán)色，這種顏色變化可通過肉眼進(jìn)行觀察，最后得到沙門氏菌的最低檢測限為7.5×105CFU/mL。這種檢測方法具有簡單、快速的特點(diǎn)，但靈敏度低。

為提高檢測靈敏度，一些具有酶催化活性的納米復(fù)合材料也被應(yīng)用于核酸適配體生物傳感檢測方法的構(gòu)建。如Wu等[12]構(gòu)建了一種ZnFe2O4還原的氧化石墨烯（ZnFe2O4-rGO）納米結(jié)構(gòu)，這種新型納米結(jié)構(gòu)具有過氧化氫酶的催化活性，可催化過氧化氫對TMB的氧化，產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物；利用修飾有ZnFe2O4-rGO的適配體作為信號探針，生物素修飾適配體被固定于微孔板，作為捕獲探針；當(dāng)沙門氏菌目標(biāo)物存在時(shí)，形成微孔板-適配體-沙門氏菌-適配體-的ZnFe2O4-rGO復(fù)合物三明治結(jié)構(gòu)；ZnFe2O4-rGO催化底物TMB產(chǎn)生顏色變化，最后得到沙門氏菌的最低檢測限為11 CFU/mL，檢測范圍為 11～1.10×105CFU/mL。由此可見，復(fù)合納米材料應(yīng)用于生物傳感檢測方法中，可大大提高沙門氏菌的檢測靈敏度。

2.1.5 過氧化氫還原Au3+Au3+可被過氧化氫還原成紅色非聚集Au原子。Zhu等[13]將沙門氏菌核酸適配體固定于微孔板，當(dāng)樣品中含有目標(biāo)物沙門氏菌時(shí)，將會(huì)被核酸適配體捕獲；然后再次加入生物素修飾的適配體，形成雙適配體夾心結(jié)構(gòu)；最后加入親和素修飾的過氧化氫酶后，過氧化氫酶催化過氧化氫的降解，因此，導(dǎo)致晶體生長動(dòng)力學(xué)反應(yīng)減慢，形成聚集的納米顆粒，溶液顏色變成藍(lán)色；當(dāng)樣品中不含沙門氏菌時(shí)，過氧化氫則不被降解，Au3+在高濃度過氧化氫條件下，被快速還原形成非聚集的球型納米顆粒，溶液變成紅色。利用該方法實(shí)現(xiàn)了沙門氏菌的定量檢測，檢測范圍為101～106CFU/mL，最低檢測限為10 CFU/mL。該方法具有快速、高靈敏度、低成本、高專一性以及高準(zhǔn)確性的優(yōu)點(diǎn)。

2.2 熒光檢測

2.2.1 傳統(tǒng)有機(jī)熒光染料 WANG等[14]利用適配體修飾的NaYF4:Ce/Tb納米顆粒和一個(gè)熒光DNA標(biāo)簽，構(gòu)建了一種均一的時(shí)間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移（TR-FRET）檢測方法，實(shí)現(xiàn)了沙門氏菌的檢測。其中，適配體功能化的NaYF4:Ce/Tb納米顆粒作為能量供體，標(biāo)記有羧基熒光素（5-Carboxyfluorescein，F(xiàn)AM）的互補(bǔ)寡核苷酸（cDNA）作為受體。當(dāng)樣品中不存在沙門氏菌時(shí)，適配體與cDNA雜交，光子能量從NaYF4:Ce/Tb納米顆粒轉(zhuǎn)移到FAM。通過這種方法得到沙門氏菌的線性檢測范圍為102～106CFU/mL，最低檢測限為25 CFU/mL。Duan等[15]通過抗-ε-亞基抗體-生物素-親和素-生物素-核酸適配體連接臂，將鼠傷寒沙門氏菌的核酸適配體與色素細(xì)胞中的F0F1-ATP酶的“旋轉(zhuǎn)子”ε-亞基偶聯(lián)，F(xiàn)-DHPE熒光探針標(biāo)記于色素細(xì)胞的表面，建立了一種新型核酸適配體生物傳感器，實(shí)現(xiàn)了沙門氏菌的定量檢測，其線性檢測范圍為10～104CFU/mL，最低檢測限為10 CFU/mL。盡管這些方法具有高的檢測靈敏度，但其操作比較繁瑣、耗時(shí)。

近年來，微流控芯片技術(shù)作為一種極具潛力的分析平臺，具有集成化、微型化、高通量及自動(dòng)化檢測的特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于食源性致病菌的定量檢測中。如ZHANG等[16]建立了一種微芯片毛細(xì)管電泳耦合激光誘導(dǎo)熒光技術(shù)（MCELIF），SYBR Gold標(biāo)記的核酸適配體與沙門氏菌專一性結(jié)合后，利用核酸適配體-沙門氏菌復(fù)合物與核酸適配體的質(zhì)荷比的不同，通過MCE將復(fù)合物與核酸適配體分離開，實(shí)現(xiàn)了牛奶樣品中沙門氏菌的定量檢測，得到了沙門氏菌的最低檢測限為3.37×102CFU/mL。這種微流控芯片檢測方法具有高度的集成化、操作簡便的優(yōu)點(diǎn)。

盡管上述基于傳統(tǒng)有機(jī)熒光染料的檢測方法具有較高的檢測靈敏度，但這些傳統(tǒng)有機(jī)熒光染料的熒光強(qiáng)度相對較低，易漂白，對環(huán)境變化靈敏度高。為克服這些問題，一些具有高熒光強(qiáng)度、高穩(wěn)定性的熒光納米發(fā)光材料，如量 子 點(diǎn)（Quantum Dot，QDs）、 碳 點(diǎn)（Carbon Dots，CDs)、上轉(zhuǎn)換納米發(fā)光材料（Up-conversion Nanoparticles，UCNPs）等作為傳統(tǒng)有機(jī)熒光染料的替代標(biāo)簽，被用于新型核酸適配體熒光生物傳感器的構(gòu)建中。

2.2.2 量子點(diǎn)（QDs） QDs具有寬的激發(fā)波長范圍、窄的發(fā)射峰、寬大的斯托克斯位移、高熒光強(qiáng)度及光穩(wěn)定性，已成為最最理想的熒光替代標(biāo)簽[17]。Hamula等[18]利用發(fā)射波長分別在535、585 nm處的QDs作為光學(xué)標(biāo)簽，并將其分別與副溶血性弧菌和鼠傷寒沙門氏菌的適配體偶聯(lián)，建立了一種雙色流式細(xì)胞傳感分析方法，最終得到副溶血性弧菌和鼠傷寒沙門氏菌的最低檢測限為5×103CFU/mL。Xu等[19]首先分別利用修飾有大腸桿菌0157:H7、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌和鼠傷寒沙門氏菌抗體的免疫磁珠從食品樣本中分離出4種目標(biāo)菌，然后利用發(fā)射波長不同的4種量子點(diǎn)（528、572、621、668 nm）分別標(biāo)記4種食源性致病菌的適配體，利用該標(biāo)記的適配體專一性識別磁珠上的捕獲的目標(biāo)菌。利用該方法得到大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌和鼠傷寒沙門氏菌純菌樣的最低檢測限分別為80、100、47、160 CFU/mL；得到牛肉樣品中4種菌的最低檢測限分別為320、350、110、750 CFU/mL。與傳統(tǒng)有機(jī)熒光染料相比，這些基于QDs的核酸適配體生物傳感檢測方法改善了熒光淬滅現(xiàn)象，具有更高的檢測靈敏度；此外，還能同時(shí)實(shí)現(xiàn)多種食源性致病菌的高通量檢測。除這些優(yōu)勢外，由于QDs的激發(fā)光仍然在紫外-可見光區(qū)，因此，被測生物樣品同樣會(huì)被激發(fā)，熒光背景值偏高，檢測靈敏度仍會(huì)受到一定程度影響。

2.2.3 碳點(diǎn)（CDs） CDs是指粒徑小于10 nm的碳納米顆粒，是一類新型的光致發(fā)光納米材料。CDs具有熒光量子產(chǎn)率高、合成簡單、毒性低、原材料來源廣泛、生物相容性好、熒光性能優(yōu)等優(yōu)點(diǎn)，受到科學(xué)家們的廣泛關(guān)注[20]。近年來，Wang等[21]以檸檬酸為碳源，采用水熱法，成功合成了CDs，并利用該CDs建立了一種基于aptamer-CDs的核酸適配體生物傳感器，實(shí)現(xiàn)了蛋殼和自來水中的鼠傷寒沙門氏菌的定量檢測，得到沙門氏菌的線性范圍為103～105CFU/mL，最低檢測限為50 CFU/mL。該方法具有簡單、快速、高靈敏的特點(diǎn)，可用于其他食源性致病菌的定量檢測。

2.2.4 上轉(zhuǎn)換納米發(fā)光材料（UCNPs） UCNPs具有高的化學(xué)穩(wěn)定性，不易被光漂白，不受外界環(huán)境（如濕度、酸度等）和被測物樣品的影響的優(yōu)點(diǎn)，此外，其使用近紅外光（980、880 nm）作為激發(fā)光源，發(fā)射光在可見光區(qū)域分布，且具有單激發(fā)多譜帶發(fā)射，具有低的熒光背景值的優(yōu)異特性，特別適合作為復(fù)雜生物樣本中的熒光標(biāo)記物[22]。因此，UCNPs為核酸適配體熒光生物傳感方法的構(gòu)建提供了新的領(lǐng)域。Wu等[23]利用藍(lán)、綠、紅3種UCNPs分別作為金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌和鼠傷寒沙門氏菌核酸適配體的熒光標(biāo)記，同時(shí)利用互補(bǔ)鏈功能化的磁珠進(jìn)行分離純化，建立了一種基于多色UCNPs的熒光傳感器，實(shí)現(xiàn)了3種食源性致病菌的多重檢測，得到金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌和鼠傷寒沙門氏菌的最低檢測限分別為25、10、15 CFU/mL。這種基于UCNPs的核酸適配體熒光生物傳感檢測方法具有高靈敏、簡單、高通量檢測的優(yōu)點(diǎn)。

2.2.5 無標(biāo)記熒光核酸適配體傳感器 以上描述的熒光標(biāo)記核酸適配體傳感器，都需要熒光基團(tuán)或熒光納米材料對核酸適配體進(jìn)行熒光標(biāo)記，因此，需要對標(biāo)記后的分子進(jìn)行復(fù)雜的分離和純化，所以這種標(biāo)記方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力、成本昂貴。因此，開發(fā)方便、無需標(biāo)記的核酸適配體熒光傳感器，實(shí)現(xiàn)沙門氏菌的定量檢測非常有研究意義。

雖然SYBR、PicoGreen和AccuBlue等傳統(tǒng)有機(jī)熒光染料具有弱的熒光強(qiáng)度，但與雙鏈DNA（dsDNA）結(jié)合后，會(huì)產(chǎn)生高的熒光強(qiáng)度，而與ssDNA結(jié)合后，卻沒有明顯熒光強(qiáng)度變化。DUAN等[24]利用這一特性，建立了一種基于AccuBlue染料的無標(biāo)記適配體熒光傳感器，實(shí)現(xiàn)了鼠傷寒沙門氏菌的定量檢測。其檢測原理為：當(dāng)沙門氏菌目標(biāo)物存在于樣本中，核酸適配體與沙門氏菌專一性結(jié)合，導(dǎo)致cDNA從cDNA-aptamer雙鏈中脫離，因而導(dǎo)致AccuBlue的釋放，熒光強(qiáng)度降低。利用該方法得到了沙門氏菌的線性檢測范圍為50～106CFU/mL，最低檢測限為25 CFU/mL。近年來，Srinivasan等[25]也利用相同的實(shí)驗(yàn)原理，利用SYBR Green I作為熒光信號，實(shí)現(xiàn)了鼠傷寒沙門氏菌的定量檢測，最低檢出限為733 CFU/mL。此外，Srinivasan等[25]也建立了另外一種檢測鼠傷寒沙門氏菌的無標(biāo)記熒光核酸適配體傳感檢測方法，該方法利用羅丹明B（Rhodamine B,RB）和GNPs之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence Rresonance Eenergy Transfer，F(xiàn)RET）進(jìn)行沙門氏菌的定量檢測。其檢測原理為：當(dāng)適配體與GNPs與RB混合后，由于FRET，RB熒光被大大淬滅；當(dāng)核酸適配體被吸附到GNPs的表面，以保護(hù)GNPs受鹽誘導(dǎo)發(fā)生聚集現(xiàn)象，而這時(shí)存在的GNPs會(huì)導(dǎo)致RB熒光猝滅。當(dāng)沙門氏菌目標(biāo)物存在時(shí)，適配體與目標(biāo)物專一性結(jié)合，導(dǎo)致GNPs不穩(wěn)定，發(fā)生鹽誘導(dǎo)聚集，進(jìn)而導(dǎo)致淬滅的RB熒光的恢復(fù)。利用這種方法實(shí)現(xiàn)了沙門氏菌的定量檢測，檢測范圍為1 530～96 938 CFU/mL，最低檢出限為464 CFU/mL。此外，Zhang等[26]建立了一種基于三重觸發(fā)序列可再生鏈取代放大-驅(qū)動(dòng)熒光Ag納米團(tuán)簇的聚集的新型無標(biāo)記、無修飾、無DNA萃取的熒光檢測方法，實(shí)現(xiàn)了鼠傷寒沙門氏菌的定量檢測，線性檢測范圍為102～107CFU/mL，最低檢測限為50 CFU/mL。上述這些無標(biāo)記熒光核酸適配體生物傳感檢測方法，不需對標(biāo)記的復(fù)合物進(jìn)行分離純化，其構(gòu)建過程相對簡單、快速，大大降低了檢測成本。

2.3 表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）檢測

SERS已被廣泛應(yīng)用于環(huán)境監(jiān)測、醫(yī)學(xué)診斷、食品安全等多個(gè)研究領(lǐng)域。SERS技術(shù)具有快速、高靈敏檢測食源性致病菌的潛力，可為食品安全提供保障。常見的表面增強(qiáng)拉曼散射基質(zhì)有銀納米粒子（AgNPs）、GNPs等重金屬納米材料[27-29]。ZHANG等[30]建立了一種GNPs增強(qiáng)的SERS核酸適配體生物傳感器，實(shí)現(xiàn)了金黃色葡萄球菌和鼠傷寒沙門氏菌的同時(shí)檢測。修飾有拉曼分子4-巰基苯甲酸（p-MBA）、5，5’-二硫基（2-硝基苯甲酸）和適配體的GNPs作為信號探針；固定有沙門氏菌和葡萄球菌適配體的Fe3O4磁性金納米顆粒（Magnetic Gold Nanoparticles, MGNPs）作為捕獲探針。沙門氏菌和葡萄球菌目標(biāo)物加入到反應(yīng)體系后，被捕獲探針和信號探針上的適配體所捕獲，形成三明治結(jié)構(gòu)。最終得到沙門氏菌和葡萄球菌的的最低檢測限分別為15、35 CFU/mL。該檢測方法利用MGNPs進(jìn)行分離純化，因此簡化了實(shí)驗(yàn)過程，且具有高靈敏、高專一性的優(yōu)點(diǎn)；但該方法約需3 h才能實(shí)現(xiàn)沙門氏菌的定量檢測，因此檢測時(shí)間相對較長。

近年來，Ma等[31]構(gòu)建了一種基于多刺狀金納米顆粒（Spiny Gold Nanoparticles, SGNPs）的SERS核酸適配體傳感檢測方法。SGNPs依次經(jīng)4-巰基苯甲酸（p-MBA）和巰基化修飾適配體（SH-Aptamer）進(jìn)行功能化修飾，其中p-MBA作為拉曼信號分子，巰基修飾的適配體作為SERS探針。此外，被固定在孔板上的生物素修飾的適配體用以專一性識別和捕獲沙門氏菌。該方法得到了沙門氏菌的檢測范圍為101～105CFU/mL，最低檢測限為4 CFU/mL，檢測時(shí)間約1 h。該檢測方法具有超高的檢測靈敏度和選擇性，還具有低成本、快速、簡易操作等優(yōu)點(diǎn)，且檢測時(shí)間相對較短。

Xu等[32]利用DNA組裝的金納米二聚體（Gold Nanodimer，GNDs），建立了一種SERS適配體傳感檢測方法，實(shí)現(xiàn)了沙門氏菌的定量檢測。其中，適配體（ssDNA1）功能化的35 nm的GNPs作為捕獲探針；Cy3修飾的互補(bǔ)鏈（ssDNA2）功能化的15 nm的GNPs作為信號探針。拉曼信號探針與捕獲探針經(jīng)互補(bǔ)的ssDNAs的雜交，形成不對稱的GNDs。沙門氏菌目標(biāo)物加入后與適配體專一性結(jié)合，從二聚體復(fù)合物中解離，因此，拉曼信號強(qiáng)度下降。最后得到沙門氏菌的檢測范圍在102～107CFU/mL，最低檢測限為35 CFU/mL。該檢測方法具有高靈敏、穩(wěn)定、均一的優(yōu)點(diǎn)，且其檢測時(shí)間也相對較短。

2.4 電化學(xué)檢測

電化學(xué)生物傳感器具有操作簡單、靈敏度高、攜帶方便、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，已成為一種潛在的POCT分析平臺，被廣泛應(yīng)用于沙門氏菌的定量檢測中。其中，電化學(xué)阻抗法可用于檢測分析物與固定在電極表面的探針分子相互作用后電極界面性質(zhì)變化，可提供一種快速、靈敏和無損的分析平臺。近年來，出現(xiàn)了多種利用電化學(xué)阻抗法檢測沙門氏菌的研究報(bào)道。GE等[33]通過結(jié)合誘導(dǎo)GNPs表面核酸適配體的取代以及滾環(huán)擴(kuò)增（Rolling Circle Amplification, RCA），建立了一種超高靈敏的電化學(xué)阻傳感檢測方法，并將其用于沙門氏菌的定量檢測中。沙門氏菌與核酸適配體的異質(zhì)識別和特異性結(jié)合，會(huì)釋放引物結(jié)合部分，導(dǎo)致在核酸適配體傳感器表面錨定多個(gè)圓形模板；RCA反應(yīng)產(chǎn)生具有多個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列的長DNA分子產(chǎn)物，這些產(chǎn)物可以與適配體傳感器表面的生物素化的檢測探針雜交，以輸出酶放大的電化學(xué)信號。該方法得到沙門氏菌的線性檢測范圍為2×101～2×108CFU/mL，最低檢測限為16 CFU/mL。該檢測方法不需要精密的溫度循環(huán)儀器，具有快速、穩(wěn)健、低成本、高靈敏、高專一性的優(yōu)點(diǎn)。

Muniandy等[34]建立了一種基于還原的氧化石墨烯二氧化鈦（Reduced Graphene Oxide Titanium Dioxider,GO-TiO2）納米復(fù)合材料的適配體傳感器，并將其用于沙門氏菌的定量檢測。通過靜電作用，無標(biāo)記的適配體被固定于rGO-TiO2納米復(fù)合材料表面，當(dāng)DNA適配體與沙門氏菌細(xì)胞結(jié)合后，會(huì)對電極表面電子的轉(zhuǎn)移產(chǎn)生阻礙；電極表面電導(dǎo)率的改變通過電分析方法進(jìn)行表征；最后得到沙門氏菌的檢測范圍為101～108CFU/mL，檢測時(shí)間約1 h。該方法具有高靈敏、高選擇性、快速、穩(wěn)健的優(yōu)點(diǎn)。

另外，Ranjbar等[35]建立了一種基于納米多孔金（Nano-porous Gold, NPG）作為底物的新型鼠傷寒沙門氏菌電化學(xué)傳感檢測方法。采用金銅合金，通過電化學(xué)方法在Au/GCE表面合成NPG；硫醇功能化適配體通過自組裝被有效的連接到NPG/Au/GCE表面；最后得到鼠傷寒沙門氏菌的線性檢測范圍為6.5×102～6.5×108CFU/mL，定量限檢測限為65 CFU/mL，最低檢測限為1 CFU/mL。該適配體生物傳感器具有高靈敏、高選擇性、高重現(xiàn)性的優(yōu)點(diǎn)，該方法具有可區(qū)分活菌細(xì)胞和死菌細(xì)胞的重要優(yōu)勢。

此外，無標(biāo)記的方法也被應(yīng)用于電化學(xué)核酸適配體生物傳感方法的構(gòu)建中。如Sheikhzadeh等[36]研制了一種基于聚[吡咯-3-羧基-吡咯]共聚物和適配體的無標(biāo)記電化學(xué)阻抗生物傳感器，并用于鼠傷寒沙門氏菌的檢測。適配體與沙門氏菌的相互作用對聚[吡咯-3-羧基吡咯]共聚物內(nèi)在的共軛及其隨后的電性能的影響，通過阻抗進(jìn)行測定。該方法得到沙門氏菌的檢測范圍為102～108CFU/mL，定量檢測限為100 CFU/mL，最低檢測限為3 CFU/mL。該無標(biāo)記電化學(xué)核酸適配體生物傳感檢測方法，簡化了實(shí)驗(yàn)過程，具有簡單、快速（約45 min）、低成本、高靈敏的優(yōu)點(diǎn)。

3 結(jié)語

綜上所述，基于比色、熒光、SERS、電化學(xué)等的適配體生物傳感技術(shù)已經(jīng)引起人們的極大關(guān)注，并已被廣泛應(yīng)用于沙門氏菌的定量檢測中。與沙門氏菌傳統(tǒng)檢測方法比較，適配體生物傳感技術(shù)具有高靈敏、高專一性、快速等優(yōu)點(diǎn)。目前，比色和熒光檢測法是適配體生物傳感檢測中應(yīng)用最廣泛的方法。在熒光傳感檢測方法中，多種新型納米材料，如量子點(diǎn)、碳點(diǎn)、上轉(zhuǎn)換熒光納米粒子等，都被廣泛應(yīng)用于沙門氏菌的定量檢測中。其中，不同發(fā)射波長的量子點(diǎn)還被用于多種食源性致病菌的高通量檢測中。雖然這些方法具有特異優(yōu)勢，但也存在需要對適配體進(jìn)行標(biāo)記的弊端。因而，又出現(xiàn)了多種免標(biāo)記適配體傳感檢測方法的建立。

核酸適配體生物傳感技術(shù)在沙門氏菌定量檢測中存在著巨大挑戰(zhàn)。首先，樣品基質(zhì)的復(fù)雜性。目標(biāo)物的提取和純化相對比較復(fù)雜繁瑣，且適配體會(huì)非特異性地與樣品基質(zhì)結(jié)合，導(dǎo)致錯(cuò)誤或不精確的結(jié)果的出現(xiàn)。其次，食源性致病菌的多樣性。樣品基質(zhì)中往往會(huì)存在多種食源性致病菌，而目前現(xiàn)有的適配體生物傳感檢測方法的檢測對象還比較單一，因此高通量檢測也是目前的一大挑戰(zhàn)。最后，目前應(yīng)用于沙門氏菌定量檢測的核酸適配體生物傳感技術(shù)，還僅限于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行檢測，不能實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)實(shí)地的快速檢測。因此，開發(fā)與這些生物傳感技術(shù)相匹配的便攜式檢測儀器，實(shí)現(xiàn)沙門氏菌的實(shí)時(shí)實(shí)地快速檢測是另一重大挑戰(zhàn)。