兩面針莖段組織培養(yǎng)及防褐化技術(shù)研究

韋瑩　余麗瑩　黃雪彥　繆劍華　韋樹(shù)根　董青松　秦雙雙　黃寶優(yōu)

摘要：以?xún)擅驷榌Zanthoxylum nitidum （Roxb.）DC.]帶芽嫩莖為外植體，研究了不同抗褐化劑對(duì)兩面針組織培養(yǎng)中試管苗褐化的抑制效果。結(jié)果表明，在初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加1.0 g/L聚乙烯吡咯烷酮（PVP），外植體褐化程度輕，萌發(fā)率最高，為62.50%。3種添加抗褐化劑組合對(duì)試管苗抗褐化均起到一定抑制作用，添加PVP處理效果最理想，PVP濃度為1.0 g/L時(shí)，試管苗褐化率僅為11.67%，增殖系數(shù)為5.03，其次為活性炭（AC），抗壞血酸（維生素C）的抗褐化效果不明顯。

關(guān)鍵詞：兩面針[Zanthoxylum nitidum （Roxb.）DC.];莖段;組織培養(yǎng);試管苗;抗褐化

中圖分類(lèi)號(hào)：S853.75? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）22-0194-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.22.044? ? ? ? ? ?開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Study on anti-browning and stem tissue culture of Zanthoxylum nitidum （Roxb.）DC.

WEI Ying，YU Li-ying，HUANG Xue-yan，MIAO Jian-hua，WEI Shu-gen，

DONG Qing-song，QIN Shuang-shuang，HUANG Bao-you

（Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants，Nanning 530023，China）

Abstract： Tender stems were used as explants， to discuss the effects of different anti-browning agents on the browning of plantlets in tissue culture of Zanthoxylum nitidum. The results showed that when adding 1.0 g/L PVP in first culture medium， the explants were light browning， The highest budding rate was 62.50%. Three combinations of adding anti-browning agent played a role in inhibiting browning on test tube plantlet，The best result was to add PVP. The browning rate was 11.67% in the presence of PVP was 1.0 g/L， the multiplication coefficient was 5.03，followed by AC，the anti browning effect of Vc was not obvious.

Key words： Zanthoxylum nitidum （Roxb.）DC.; stems; tissue culture; test tube plantlet; anti-browning

兩面針[Zanthoxylum nitidum （Roxb.）DC.]系蕓香科（Rutaceae）花椒屬（Zanthoxylum）木質(zhì)藤本植物，廣泛分布于廣東、廣西、云南、貴州、四川、湖南、臺(tái)灣、福建、浙江等省，生長(zhǎng)于山野坡地灌木叢中，資源豐富、應(yīng)用廣泛[1]。兩面針為中國(guó)南方地區(qū)的常用中藥，具祛風(fēng)活血、解毒消腫，散淤止痛之功能。常用于治療胃痛、牙痛、神經(jīng)痛、風(fēng)濕骨痛、毒蛇咬傷等多種病癥[2]，此外也應(yīng)用于抗癌、潔齒，是三九胃泰、正骨水、跌打萬(wàn)花油等著名中成藥和日用品兩面針中藥牙膏的主要原料[3]。

隨著人們對(duì)兩面針?biāo)幉男枨罅咳找嫔遊4]，加上生境破壞和不合理采挖，其野生資源瀕臨枯竭，因此市場(chǎng)上兩面針?biāo)幉牡膫纹芬草^多[5]，難以滿(mǎn)足市場(chǎng)需求。兩面針生藥、成分、藥理、臨床等方面的研究，已取得一定進(jìn)展[6]，關(guān)于組織培養(yǎng)方面的研究不多[7-9]，至今未有兩面針試管苗抗褐化相關(guān)報(bào)道。植物組織培養(yǎng)具有繁殖速度快、繁殖率高的特點(diǎn)，但在兩面針組織培養(yǎng)中，試管苗出現(xiàn)菌類(lèi)污染、玻璃化、褐化等問(wèn)題。褐化主要發(fā)生在莖段初代誘導(dǎo)及試管苗繼代培養(yǎng)過(guò)程中，接觸培養(yǎng)基部位、整個(gè)植株均出現(xiàn)不同程度褐化，嚴(yán)重影響了兩面針試管苗的質(zhì)量和繁育。本試驗(yàn)在前期組培研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了維生素C、活性炭（AC）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP） 3種抗褐化劑對(duì)兩面針褐化的抑制效果，旨在為工廠(chǎng)化生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)種苗提供參考依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)材料

2011年11月從廣西龍州引種種植于廣西藥用植物園繁育圃，經(jīng)廣西壯族自治區(qū)藥用植物園余麗瑩研究員鑒定該品種為兩面針，采摘無(wú)病蟲(chóng)害植株的幼嫩帶芽莖段作為試驗(yàn)材料。

1.2? 儀器與試劑

AIR TECH超凈工作臺(tái)，立式壓力蒸汽滅菌鍋，EL電子天平，電磁爐，pH酸度計(jì)，滅菌器等。

聚乙烯吡咯烷酮（PVP），活性炭（AC），抗壞血酸（維生素C），奈乙酸﹙NAA﹚，6-芐基腺嘌呤（6-BA）等。

1.3? 方法

1.3.1? 莖段滅菌與誘導(dǎo)? 取兩面針幼嫩帶芽莖段，用洗潔精水溶液清洗表面污垢，流水沖洗5～8 min，再用75%乙醇溶液表面滅菌30 s，然后在0.1%氯化汞溶液中分別滅菌8、10、12 min，無(wú)菌水沖洗3～5次。

1.3.2? 不同抗褐化劑對(duì)兩面針外植體誘導(dǎo)的比較? 用滅菌好的接種工具將嫩芽?jī)啥饲械?，將長(zhǎng)為1.2～1.5 cm的帶芽莖段分別接種于不同培養(yǎng)基①M(fèi)S+NAA 0.1 mg/L+6-BA1.0 mg/L;②MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+維生素C 1.0 g/L;③MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+PVP 1.0 g/L;④MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+AC 1.2 g/L培養(yǎng)基上，觀察并記錄褐化、萌發(fā)情況，每瓶接種3個(gè)莖段。每個(gè)處理接種8瓶。

1.3.3? 不同抗褐化劑對(duì)兩面針試管苗生長(zhǎng)的比較? 將兩面針試管苗剪切成1.2～1.5 cm的帶芽莖段，接種到MS+NAA 0.5 mg/L+6-BA 1.0 mg/L及維生素C、PVP、AC不同濃度組合培養(yǎng)基中，其中抗褐化劑濃度分別為維生素C（0.2、0.5、1.0、1.5 g/L）、PVP（0.5、1.0、1.5、2.0 g/L）、AC（0.5、0.8、1.2、1.5 g/L），觀察并記錄褐化及萌發(fā)情況，每瓶接種6個(gè)莖段。每個(gè)處理接種10瓶。

1.4? 統(tǒng)計(jì)方法

萌芽率=萌發(fā)芽數(shù)/接種外植體數(shù)×100%;褐化率=褐化外植體（苗）的塊、株數(shù)/接種總數(shù)×100%。

1.5? 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)溫度（25±2） ℃，光照度2 000 lx，光照時(shí)間12 h/d。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 不同抗褐化劑對(duì)兩面針外植體誘導(dǎo)的影響

以帶芽莖段為外植體，接種于添加不同濃度抗褐化劑處理的MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，比較不同抗褐化劑對(duì)外植體褐化及誘導(dǎo)情況的影響，結(jié)果如表1所示，處理1外植體接種5 d，切口開(kāi)始出現(xiàn)輕微的褐色，培養(yǎng)7 d，接觸培養(yǎng)基部位出現(xiàn)少量污染和褐化現(xiàn)象（圖1），添加抗褐化劑的3個(gè)處理褐化情況差異較大，4個(gè)初代誘導(dǎo)處理中，以MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+PVP 1.0 g/L（處理3）生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)外植體抗褐化效果較為理想，褐化時(shí)間較晚，培養(yǎng)10 d出現(xiàn)輕微褐化，培養(yǎng)30 d，褐化率和萌發(fā)率分別為16.67%和62.50%，芽體嫩綠，長(zhǎng)勢(shì)好。

2.2? 不同抗褐化劑對(duì)兩面針試管苗生長(zhǎng)及防褐化效果的影響

2.2.1? 不同濃度維生素C對(duì)兩面針試管苗褐化的影響? 在組織培養(yǎng)過(guò)程中，維生素C具有防止組織變褐的作用。由表2可以看出，抗褐化劑維生素C對(duì)兩面針試管苗有一定的防褐化作用，在濃度為1.0～1.5 g/L時(shí)效果比較理想，培養(yǎng)60 d后，褐化率最低為20.00%，苗增殖系數(shù)最高為3.58，株壯、葉綠，苗長(zhǎng)勢(shì)好，低濃度的維生素C對(duì)試管苗生長(zhǎng)效果差，試管苗在培養(yǎng)15 d接觸培養(yǎng)基部位開(kāi)始出現(xiàn)褐化（圖2），隨后整個(gè)植株褐化，試管苗出現(xiàn)玻璃化、葉片枯黃和凋落的現(xiàn)象（圖3）。

2.2.2? 不同濃度PVP對(duì)兩面針試管苗褐化的影響? PVP是一種水溶性物質(zhì)，通過(guò)氫鍵與酚類(lèi)物質(zhì)結(jié)合，減少酚類(lèi)物質(zhì)的毒害，起到減輕褐化的作用。由表3可以看出，PVP對(duì)減少褐化情況有明顯的效果，隨著PVP濃度的升高，褐化得到控制，而且試管苗增殖系數(shù)均達(dá)到4.00以上，但是濃度過(guò)高，則會(huì)影響試管苗的增殖，甚至出現(xiàn)試管苗玻璃化的現(xiàn)象，4個(gè)不同濃度PVP均能在一定程度上起到抑制褐化的作用，當(dāng)PVP濃度為0.5 g/L時(shí)，褐化率最高為21.67%;PVP濃度為1.0 g/L時(shí)抗褐化效果最佳，褐化率和增殖系數(shù)分別為11.67%和5.03。PVP抗褐化組合培養(yǎng)基培養(yǎng)的試管苗褐化發(fā)生時(shí)間較晚，25 d開(kāi)始出現(xiàn)褐化，且褐化程度輕。

2.2.3? 不同濃度AC對(duì)兩面針試管苗褐化的影響? AC具有吸附特性，在試管苗繼代增殖培養(yǎng)過(guò)程中，添加適當(dāng)濃度活性炭對(duì)試管苗褐化起到一定抑制作用。由表4可見(jiàn)，活性炭濃度為0.5 g/L時(shí)褐化比較嚴(yán)重，且出現(xiàn)葉片枯黃凋落情況，褐化率最高，為25.00%;活性炭濃度為1.2 g/L時(shí)，褐化率和增殖系數(shù)分別為15.00%和4.53，株壯葉綠，隨著濃度的進(jìn)一步升高，試管苗褐化和增殖效果不理想。

3? 結(jié)論與討論

褐化是外植體由于自身分泌的酚類(lèi)化合物的影響導(dǎo)致外植體褐變，是植物組織培養(yǎng)中一種常見(jiàn)的現(xiàn)象，直接影響到組織培養(yǎng)能否取得成功，褐化問(wèn)題是植物組織培養(yǎng)中最常見(jiàn)的三大問(wèn)題之一[10，11]。目前還未發(fā)現(xiàn)避免褐化的特效方法，科研人員根據(jù)不同植物采用不同試驗(yàn)手段，篩選出防止褐變的發(fā)生或者減輕褐變?cè)斐晌：Φ淖罴逊椒╗12-15]。

兩面針為木質(zhì)藤本植物，進(jìn)行初代誘導(dǎo)及試管苗增殖培養(yǎng)容易發(fā)生嚴(yán)重褐化。本試驗(yàn)探討兩面針組培過(guò)程抗褐化的方法，通過(guò)從莖段誘導(dǎo)、添加抗褐化劑等方面，總結(jié)兩面針組培快繁過(guò)程中防褐化的相關(guān)技術(shù)，旨在促進(jìn)兩面針組培快繁技術(shù)的優(yōu)化，為推廣優(yōu)質(zhì)種苗提供技術(shù)參考。

采用連續(xù)轉(zhuǎn)移初代誘導(dǎo)材料（試管苗）、暗培養(yǎng)方法進(jìn)行抗褐化研究，發(fā)現(xiàn)效果不明顯，隨后通過(guò)在培養(yǎng)基中添加維生素C、PVP、AC進(jìn)行防褐化試驗(yàn)。結(jié)果表明，3種抗褐化組合在一定程度上均能控制褐化，明顯比不添加抗褐化劑的處理效果好。其中添加PVP濃度為1.0 g/L的處理褐化程度較輕，試管苗長(zhǎng)勢(shì)良好，增殖系數(shù)最高，而添加AC和維生素C的處理褐化圈較大，顏色較濃，試管苗長(zhǎng)勢(shì)及增殖效果稍差。

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