蘇云金芽孢桿菌以色列亞種（Ｂｔｉ）發(fā)酵液的濃縮工藝研究

陳偉　廖先清　劉芳　饒犇　周榮華

摘要：通過對(duì)蘇云金芽孢桿菌以色列亞種（Bacillus thuringiensis subsp. israelensis，Bti）發(fā)酵液濃縮工藝的研究，探索了不同溫度對(duì)濃縮液有效成分的影響程度，比較了不同濃縮方式、不同干燥方式處理下有效成分的回收率。結(jié)果表明，采用真空薄膜濃縮方式最終得到的產(chǎn)物質(zhì)量是離心濃縮方式得到產(chǎn)物質(zhì)量的176%，效價(jià)回收率提高了36%。

關(guān)鍵詞：蘇云金芽孢桿菌以色列亞種（Bacillus thuringiensis subsp. israelensis）;真空薄膜濃縮;離心濃縮

中圖分類號(hào)：Q813.1? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）22-0111-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.22.025? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Studies on concentration process of BTi fermentation broth

CHEN Wei，LIAO Xian-qing，LIU Fang，RAO Ben，ZHOU Rong-hua

（Hubei of Biopesticide Engineering Research Center，Wuhan 430064，China）

Abstract： Through the study on the concentration process of Bacillus thuringiensis subsp. israelensis（Bti） fermentation broth， the effects of different temperatures on the active components of the concentrate were explored. The recovery rates of the active components under different concentration methods and different drying methods were compared. The results show that the quality of the product finally obtained by the vacuum film concentration method is 176% of the mass of the product obtained by centrifugal concentration， and the recovery rate of the potency is increased by 36%.

Key words： Bacillus thuringiensis subsp. israelensis; vacuum film concentration; centrifugal concentration

蘇云金芽孢桿菌以色列亞種（Bacillus thuringiensis subsp. israelensis，簡(jiǎn)稱Bti）是Goldberg和Margalit于1977年發(fā)現(xiàn)的一種對(duì)蚊科幼齡害蟲具有高度毒力的病原細(xì)菌。自發(fā)現(xiàn)以來(lái)，人們利用Bti制劑為控制蚊媒病的傳播進(jìn)行了大量工作。

目前Bti常規(guī)的生產(chǎn)方法是采用相關(guān)的芽孢桿菌生產(chǎn)菌種，分批發(fā)酵培養(yǎng)，至其大部分或者全部形成芽孢時(shí)，采用板框過濾或者離心的方式進(jìn)行濃縮，添加助劑后烘干或者噴霧干燥得到芽孢桿菌的活菌制劑[1-5]。這些方法存在著嚴(yán)重的不足，發(fā)酵液的濃縮采用的絮凝/板框過濾或者離心技術(shù)一般都會(huì)產(chǎn)生大量的廢水，后續(xù)處理成本較高;采用絮凝/板框過濾或者離心技術(shù)還會(huì)造成發(fā)酵液上清里的有效成分丟失，產(chǎn)品質(zhì)量下降。而且傳統(tǒng)的絮凝/板框過濾或者離心濃縮方法會(huì)產(chǎn)生大量生化需氧量（BOD）很高的廢水，需要進(jìn)行復(fù)雜的處理才可能達(dá)到排放標(biāo)準(zhǔn)。因此，有必要對(duì)芽孢桿菌發(fā)酵液后處理的工藝進(jìn)行研究，以達(dá)到提高后處理過程中芽孢及其所產(chǎn)生的活性物質(zhì)的收率，減少后處理工藝所產(chǎn)生的廢水泊BOD[6-12]。而采用真空薄膜濃縮后，優(yōu)點(diǎn)在于直接濃縮發(fā)酵液，相比于傳統(tǒng)的絮凝/板框過濾或者離心濃縮方式，發(fā)酵液中可溶性的增效物質(zhì)、促生物質(zhì)、抑菌活性物質(zhì)等得到有效回收。低溫濃縮過程中產(chǎn)生的冷凝水，生化需氧量極低，一般在80以下，達(dá)到排放標(biāo)準(zhǔn)。

本研究在前期其他芽孢桿菌濃縮工藝研究的基礎(chǔ)上，詳盡研究了蘇云金芽孢桿菌以色列亞種NBIM-301的濃縮工藝，主要是濃縮條件和回收率的研究。

1? 材料與方法

1.1? 材料

菌種：蘇云金芽孢桿菌以色列亞種NBIM-301系湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心分離并保存;發(fā)酵液由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心工程技術(shù)研究室提供。

儀器：真空薄膜濃縮器（蒸發(fā)量30 L/h）、LGJ-200F型冷凍干燥機(jī)、噴霧干燥塔（蒸發(fā)量10 L/h），黑龍江大三源乳品機(jī)械有限公司;Eppendorf 5424型離心機(jī)，艾本德中國(guó)有限公司。

1.2? 方法

1.2.1? 真空薄膜濃縮? 取5 L發(fā)酵液加入真空薄膜濃縮器進(jìn)料容器中，經(jīng)加熱器加熱到設(shè)定溫度后送至分離器，在真空度-90～-80 kPa下進(jìn)行蒸發(fā)和分離，蒸氣通過冷凝器冷凝成水后排出，濃縮后的物料取出后通過不同方式進(jìn)行干燥。

1.2.2? 離心濃縮? 取5 L發(fā)酵液加入管式離心機(jī)，在18 000 r/min轉(zhuǎn)速下進(jìn)行離心分離，倒掉上清液，取出沉淀通過不同方式進(jìn)行干燥。

1.2.3? 冷凍干燥? 將濃縮物放入冷凍干燥機(jī)中24 h，待完全干燥后取出，稱重后備用。

1.2.4? 噴霧干燥? 將濃縮物在進(jìn)口風(fēng)溫150 ℃、塔內(nèi)溫度60 ℃條件下進(jìn)行噴霧干燥，收集稱重后備用。

1.2.5? 分析檢測(cè)? 以色列亞種NBIM-301采用GB/T19567.1-2004中生物測(cè)定法測(cè)定生物效價(jià)。

1.2.6? 總有效成分計(jì)算方法? 總有效成分=生物效價(jià)×質(zhì)量。

1.2.7? 有效成分回收率計(jì)算? 有效成分回收率=不同處理的產(chǎn)物質(zhì)量×產(chǎn)物生物效價(jià)×100/發(fā)酵液直接凍干的產(chǎn)物總有效成分。

1.2.8? 工藝廢水化學(xué)需氧量和5 d生化需氧量檢測(cè)? 取離心濃縮上清液和真空薄膜濃縮冷凝液各5 L送武漢市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心委托檢測(cè)，采用GB11914-1989、HJ505-2009兩項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)中的方法進(jìn)行。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 最適濃縮溫度

NBIM-301的結(jié)果表明，50 ℃和60 ℃處理后，效價(jià)差異在10%以內(nèi)但60 ℃溫度更高，濃縮所需的時(shí)間更少，分離效率要高于50 ℃。70 ℃處理時(shí)產(chǎn)品效價(jià)很低（表1）。

進(jìn)一步研究了55、60、65 ℃條件下的濃縮試驗(yàn)，結(jié)果表明，雖然65 ℃效價(jià)比60 ℃時(shí)要低，但65 ℃溫度更高，濃縮所需的時(shí)間更少，濃縮效率高（表2）。

2.2? 不同濃縮方式的產(chǎn)物回收率

與其他蘇云金芽孢桿菌的濃縮試驗(yàn)不同，由NBIM-301的發(fā)酵液直接真空薄膜濃縮得到的產(chǎn)物效價(jià)相比于離心濃縮處理得到的產(chǎn)物效價(jià)（5 233 ITU/mg）稍高一些，這是由于NBIM-301的晶體較小，離心濃縮會(huì)損失一部分晶體，而將兩種處理方式得到的濃縮液凍干或者噴霧干燥后，前者得到的產(chǎn)物質(zhì)量要大于后者。不管用什么溫度進(jìn)行蒸發(fā)濃縮，所得到的濃縮液的固含量是一致的，仍以1 t發(fā)酵液為例，分別計(jì)算以真空薄膜濃縮（65 ℃）和離心濃縮兩種方式回收到的產(chǎn)物量，結(jié)果見表3。由表3可知，采用真空薄膜濃縮方式最終得到的產(chǎn)物質(zhì)量是離心濃縮方式得到的產(chǎn)物質(zhì)量的176%，效價(jià)回收率提高了36%。

3? 討論

蘇云金芽孢桿菌發(fā)酵液后處理的核心問題就是將伴孢晶體等殺蟲成分及其增效因子與發(fā)酵液分離，除去占質(zhì)量90%以上的水分，得到干燥的工業(yè)原粉。為了不破壞發(fā)酵液的殺蟲活性，濃縮過程要遵循“低溫、快速”的原則，而減壓濃縮法是在較低溫度下將發(fā)酵液濃縮到一定體積的方法，正好能夠符合該原則和要求，而目前MVR和降膜蒸發(fā)器的技術(shù)則降低了能耗和提高了效率，促進(jìn)了該技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用。從原理上講，溫度越低越有利于伴胞晶體和生物有效物質(zhì)的回收，但是溫度太低則會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)效率的降低和成本增加，所以在選擇具體工藝時(shí)需要綜合考慮。而根據(jù)本試驗(yàn)研究結(jié)果，65 ℃是正好能保證回收效率和效果比較合適的溫度，在該溫度下最終得到的產(chǎn)物質(zhì)量是離心濃縮方式得到的產(chǎn)物質(zhì)量的176%，效價(jià)回收率提高了36%。

當(dāng)然，真空薄膜濃縮也有一些不足之處，一是有效成分含量的下降，二是后續(xù)劑型加工會(huì)受到影響。這些都需要對(duì)工藝進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化和改善，以得到最優(yōu)的工藝。

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