禽白血病病毒p27抗原的原核表達(dá)及其結(jié)合性多肽的篩選

姬向波，張立恒,李新鋒，曹天行, ，陳中衛(wèi), 3，張春霞,4

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 實(shí)驗(yàn)研究中心，河南 鄭州 450046； 2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 動物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046； 3.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 動物科技學(xué)院，河南 鄭州 450046;4.河南省非常規(guī)飼料資源創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450046)

ALV屬于α反轉(zhuǎn)錄病毒群病毒屬成員，可誘發(fā)禽類多種良性或惡性腫瘤，易導(dǎo)致感染雞群免疫抑制、生長抑制等生產(chǎn)性能下降[1]。該病毒主要通過種蛋垂直傳播、公雞精液帶毒傳播，雛雞間易發(fā)生水平傳播，易造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。目前尚無有效的藥物和疫苗預(yù)防禽白血病，篩選與該病毒主要表面抗原p27的特異性多肽，開發(fā)診斷試劑盒，用于診斷該病原具有廣闊的發(fā)展前景。

噬菌體表面展示可快速地篩選獲得高親和力多肽。Smith(1985)等最早報(bào)道將外源基因利用基因工程的方法加入噬菌體的基因組，使外源多肽與噬菌體表面的外殼蛋白共同展示在噬菌體顆粒表面[4]。Scott(1990)等首次實(shí)現(xiàn)隨機(jī)多肽與噬菌體表面蛋白共同展示在噬菌體顆粒表面，建立噬菌體隨機(jī)展示肽庫[5]。噬菌體展示技術(shù)與單克隆抗體統(tǒng)制方法相比，具有周期短、成本低等優(yōu)點(diǎn)。因此，本試驗(yàn)利用噬菌體展示技術(shù)，篩選ALV p27蛋白特異性結(jié)合多肽，為后期利用多肽制備ALV-p27 ELISA檢測試劑盒奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

Ph.D.噬菌體展示肽庫及其宿主菌E.coli ER2738(NEB公司)，表達(dá)ALV p27抗原的菌株pET30a-p27為前期構(gòu)建保存的甘油菌；鎳瓊脂糖親和層析柱(中科森輝微球技術(shù)有限公司)，蛋白Marker、4S Green Plus核酸染料、IPTG等均購自上海生工，測序和鑒定引物由上海生工合成，Agrose(河南東格生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 ALV p27抗原的制備、濃縮與鑒定

按照參考文獻(xiàn)[6]，恒溫?fù)u床，20 ℃，220 rpm/min，250 μL 0.5 mmol/L IPTG，1 L pET30a-p27 E.coli菌液，誘導(dǎo)ALV p27蛋白表達(dá)；誘導(dǎo)結(jié)束后，取菌液4 ℃，12 000 rpm/min，離心20 min，收集細(xì)胞菌體沉淀；破碎Buffer重懸后，進(jìn)行超聲波破碎，400 W，20 min(超聲2 S，暫停6S為一個(gè)循環(huán))；收集破碎后液體，4 ℃，12 000 rpm/min，離心20 min，收集上清；取上清液進(jìn)行鎳瓊脂糖親和層析，經(jīng)過不同濃度梯度的咪唑洗脫，收集洗脫后的ALV p27蛋白抗原。分別對菌液上清、破碎菌體液、洗滌收集液、洗脫收集液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。取純度高的洗脫液進(jìn)行凍干保存，備用。

1.2.2 ALV p27抗原特異性結(jié)合的噬菌體篩選

按照參考文獻(xiàn)[6]，無菌條件下，取純化后的10 μL ALV p27蛋白(0.01 g/L)用100 μL NaHCO3(1 mol/L pH 8.6)包被微孔板，4℃，溫和搖蕩過夜；棄包被液，用5% BSA液封阻，4℃，8 h；棄封阻液，100 μL(約1×1011滴度)噬菌體肽庫加入到相應(yīng)的孔中，室溫溫和搖動60 min；每孔加入250 μL 洗滌液(0.1% TBST)，洗滌8次；加入100 μL酸性洗脫液，室溫溫和搖蕩10 min，收洗脫液至含15 μL 1 M pH值為9.1的Tris-HCl緩沖液的離心管內(nèi)混勻，從中取10 μL測定滴度；將剩余的中性洗脫液加入宿主菌ER2738培養(yǎng)液，37 ℃恒溫培養(yǎng)4.5h-5 h；再將培養(yǎng)液于4℃，12000 rpm，離心10 min，收上清，加入1/6上清體積的PEG-NaCl溶液沉淀噬菌體。然后測定擴(kuò)增以后噬菌體的滴度，重復(fù)上述步驟，進(jìn)行4輪淘選。每輪淘選逐漸降低ALV p27蛋白包被量，以獲得高親和力的噬菌體，將獲取的噬菌體單克隆產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 ELISA鑒定

取10 μL ALV p27蛋白(40 μg/mL)和10 μL未誘導(dǎo)表達(dá)的OB菌培養(yǎng)液上清(40 μg/mL)，用100 μL NaHCO3(1 mol/L pH 8.6)包被微孔板，4℃過夜。PBST洗3次，用2% BSA液，37℃封阻3 h。PBST洗3次，每孔加100 μL噬菌體單克隆抗體(1×1011 PFU/mL)，37℃孵育1 h，PBST洗5次，每孔加 100 μL兔抗M13抗體(封閉液1：8 000稀釋)，37 ℃恒溫恒濕孵育1 h，PBST洗5次。每孔加100 μL HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體(封閉液1：3 000稀釋)，37 ℃恒溫恒濕孵育1 h后，PBST洗5次。酶標(biāo)儀讀取450 nm處吸光度OD值。將p27蛋白包被孔中的OD值設(shè)為陽性P，OB菌培養(yǎng)液上清包被孔的OD值設(shè)為陰性N，挑取P/N > 3的噬菌體單克隆抗體進(jìn)行擴(kuò)增。

1.2.4 序列擴(kuò)增、測序和多肽序列推導(dǎo)

取擴(kuò)增后的噬菌體2 μL，加入含有20 μL滅菌超純水，98℃裂解10 min，3 000 rpm/min離心5 min，取上清1 μL為模板，測序引物為5’-GCAAGCCTCAGCGACCGA-3’和5’-CCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’，PCR擴(kuò)增測序，產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后，取300 bp條帶，回收，送上海生工測序。DNA STAR軟件推導(dǎo)特異性結(jié)合多肽的序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 ALV p27抗原的制備、濃縮與鑒定

對IPTG誘導(dǎo)物誘導(dǎo)8 h-16 h后的產(chǎn)物，進(jìn)行離心沉淀，超聲波破碎菌體沉淀，沸水煮沸8 min-10 min后，加入10×SDS loading buffer進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，可在大約25 KD的位置見到ALV-p27目的蛋白，結(jié)果表明，誘導(dǎo)16 h，p27蛋白表達(dá)量最高(圖1)，將表達(dá)蛋白經(jīng)鎳瓊脂糖親和層析柱進(jìn)行純化，收集洗脫液進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，可得純化后的ALV-p27(圖2)。

圖1 鎳親和柱層析純化p27蛋白的SDS-PAGE電泳圖M：蛋白標(biāo)準(zhǔn)marker；1：上樣液；2：流出液；3：10 mM咪唑洗脫組分；4：50 mM咪唑洗脫組分； 5-6：500 mM咪唑洗脫組分

圖2 噬菌體單克隆PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖M：DNA marker；1-8：噬菌體單克隆PCR產(chǎn)物；9：陰性對照

2.2 噬菌體肽庫與ALV p27蛋白的親和性篩選

ALV p27抗原對噬菌體隨機(jī)M13肽庫進(jìn)行親和篩選，通過4輪進(jìn)行親和篩選，噬菌體克隆抗體回收率從6.9×10-6增加到7.5×10-3，表明目的噬菌體克隆可有效富集(見表1)。

表1 每輪親和篩選中噬菌體的滴度

2.3 結(jié)合性噬菌體單克隆產(chǎn)物的鑒定

挑取噬菌體單克隆產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳，可看到300 bp目的條帶。

2.4 測序及其結(jié)合性多肽氨基酸序列的推導(dǎo)

ELISA篩選后獲得4個(gè)噬菌體單克隆產(chǎn)物，PCR擴(kuò)增后送上海生工測序，測序結(jié)果及推導(dǎo)的氨基酸序列(表2)。

表2 噬菌體單克隆的測序結(jié)果

3 討論

噬菌體隨機(jī)展示肽技術(shù)是在噬菌體外殼蛋白基因片段中插入外源多肽基因序列的重組噬菌體技術(shù)。利用受體與配體親和的特性，從噬菌體隨機(jī)展示肽庫中淘選出能與病毒目標(biāo)抗原結(jié)合的多肽，篩選出的多肽與血清中的抗體有高度同源性。王耘等[7]利用競爭洗脫法淘選與Cry3Bb毒素具有親和力的特異性短肽，以其為結(jié)合性受體建立IC-ELISA檢測方法。Liu等[8]利用商業(yè)噬菌體展示肽庫，篩選出可與新煙堿類殺蟲劑吡蟲啉特異性結(jié)合的噬菌體，并以此建立ELISA方法對吡蟲啉的最大信號抑制濃度(IC50)和檢測限(LOD)分別為96和2.3 ng/mL。本試驗(yàn)運(yùn)用噬菌體肽庫篩選出ALV p27蛋白特異性結(jié)合肽具有周期短、成本低等優(yōu)點(diǎn)。

ALV蛋白質(zhì)組分主要有g(shù)ag基因編碼的核心蛋白，pol基因編碼的3種酶，env基因編碼的兩種糖蛋白[9]。在gag編碼的非糖基化蛋白中，p27是主要的特異性抗原，在病毒復(fù)制過程中含量較高，是制備抗體檢測的首選抗原[10]。利用噬菌體肽庫篩選特異性多肽時(shí)，應(yīng)經(jīng)過純化，以防止篩選到與雜質(zhì)結(jié)合的非特異性噬菌體。本試驗(yàn)利用大腸桿菌表達(dá)目的蛋白，是體外制備抗原最常用的手段，該方式獲取的蛋白產(chǎn)量高、結(jié)構(gòu)簡單，且具有良好的抗原性。在小肽與蛋白質(zhì)的相互作用過程中，氨基酸殘基中起重要作用的為其中的5-8個(gè)氨基酸殘基，或是其中的2-3 個(gè)氨基酸殘基。本試驗(yàn)選用New England Biolabs公司構(gòu)建的單鏈絲狀噬菌體隨機(jī)M13肽庫來篩選目標(biāo)多肽，該展示系統(tǒng)上展示的小肽有 5個(gè)拷貝，因而這有利于在篩選過程中獲得高親和力的噬菌體克隆。

現(xiàn)有的商品化ALV-p27檢測試劑盒主要利用ALV p27蛋白的單克隆抗體作為包被物，檢測待檢樣品中的ALV-p27抗原含量，再以此來評估樣品中的病毒陰陽性。此類試劑盒的ALV-p27抗原單克隆抗體研發(fā)周期長，制備費(fèi)用高。本試驗(yàn)利用噬菌體展示技術(shù)很好地規(guī)避了這一難題，將ALV-p27抗原在原核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)、純化，這種與以目標(biāo)蛋白進(jìn)行免疫獲得蛋白抗體的方法相比更簡便，也更易操作。