辛伐他汀片在比格犬體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究

趙玉叢，王篤學(xué)，鄒華威

(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 動(dòng)物醫(yī)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046)

辛伐他汀(Simvastatin ，SV)是一種新型的調(diào)脂藥物，可以通過抑制內(nèi)源性膽固醇的合成，達(dá)到調(diào)節(jié)機(jī)體中血脂的作用，是治療高脂血癥的首選藥物之一[1,2]。為了進(jìn)一步研究辛伐他汀的體內(nèi)代謝，為其在人體內(nèi)的生物利用度研究提供依據(jù)，本試驗(yàn)用雄性比格犬作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，采用LC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)，用單劑量辛伐他汀片灌服比格犬后，測(cè)定了SV在比格犬體內(nèi)的血藥濃度，使用WinNonlinV5.2.1統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算出藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，并與同類文獻(xiàn)中SV的藥動(dòng)學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行了對(duì)比。

1 材料

1.1 試藥

辛伐他汀片(北京萬(wàn)生藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，規(guī)格:40mg/片)；辛伐他汀對(duì)照品(購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所，純度：100.0%)；內(nèi)標(biāo):普萘洛爾(Propranolol，上海睿智化學(xué)研究有限公司提供)。

1.2 儀器

LC-MS/MS-21 (API6500, Qtriple)(日本島津公司產(chǎn)品)、XW-80A旋渦混合儀(海門其林貝爾儀器制造有限公司產(chǎn)品)、5415R型臺(tái)式低溫離心機(jī)(艾本德中國(guó)有限公司產(chǎn)品)。

1.3 動(dòng)物

健康雄性比格犬3只(編號(hào)分別為1號(hào)犬，2號(hào)犬，3號(hào)犬)，體重7kg-10 kg，由上海睿智化學(xué)研究有限公司大動(dòng)物研究中心提供。實(shí)驗(yàn)前正常飼養(yǎng)2周且未服任何藥物。并在實(shí)驗(yàn)前12h禁止喂食，但是可以飲水。

2 LC-MS/MS分析條件

2.1 色譜條件

waters BEH C18色譜柱(2.1×50 mm, 1.7 μm)，柱溫60 ℃；流動(dòng)相選擇A、B混合流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速0.6 mL·min-1(見表1，其中A為含0.025%甲酸和1 mmol·L-1醋酸銨的水溶液，B為含0.025%甲酸和1 mmol·L-1醋酸銨的甲醇溶液)；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

采用ESI離子源，MRM檢測(cè)模式，MRM監(jiān)測(cè)離子對(duì)為辛伐他?。篞1/Q3 Masses: 441.50/325.20 Da，內(nèi)標(biāo)普萘洛爾：Q1/Q3 Masses: 260.10/116.20 Da。

表1 梯度洗脫條件

3 方法與結(jié)果

3.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液及內(nèi)標(biāo)溶液的配制

配制濃度為200 μg·mL-1的辛伐他汀母液，再將辛伐他汀母液用乙腈-水(v/v，1：1)稀釋，得濃度分別為0.02、0.04、0.2、0.6、2、6、20 μg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液，冰箱冷藏保存。

精密稱取適量?jī)?nèi)標(biāo)普萘洛爾，用乙腈溶解配制成1 mg·mL-1的普萘洛爾儲(chǔ)備液，在4℃的冰箱中保存。臨用前用乙腈稀釋得內(nèi)標(biāo)溶液(濃度40 ng·mL-1)。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品的配制

分別取各對(duì)照品儲(chǔ)備液10 μL于干燥離心管中，再加入內(nèi)標(biāo)溶液(普萘洛爾濃度為40 ng·mL-1)10 μL，再加入空白血漿180 μL，配成辛伐他汀濃度分別為 1、2、10、30、100、300、1000 ng·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，冰箱冷藏保存。

3.3 給藥劑量的確定

于實(shí)驗(yàn)前將3只雄性比格犬分別稱重，稱其體重分別為7.67 kg，7.84 kg，7.76 kg。根據(jù)表2中不同實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人等效劑量比值，查得犬與人的等效劑量比為1.87。按阿伐他汀的人用劑量每日0.5 mg/kg，計(jì)算得出1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)比格犬有效給藥劑量分別為7.133 mg、7.291 mg、7.217 mg。取1片辛伐他汀片(規(guī)格為40 mg/片)稱其質(zhì)量為224.6 mg，最終計(jì)算得出1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)比格犬分別給予辛伐他汀片的質(zhì)量為40.1 mg、40.9 mg和40.5 mg。

將辛伐他汀片粉碎均勻，分別稱取40.1 mg、40.9 mg、40.5 mg裝入3只膠囊中并編號(hào)為1、2、3。

表2 不同實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人等效劑量比值(劑量按mg/kg算，人按60kg算)

3.4 血漿樣品的采集

利用給藥器將3只膠囊分別對(duì)相應(yīng)編號(hào)的比格犬進(jìn)行給藥，在給藥之前及給藥之后的0.083 h、0.25 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h、24 h作為采血時(shí)間點(diǎn)，分別從比格犬前肢橈靜脈采取0.5 mL血液，置于加有EDTA-K2抗凝劑的離心管中，混勻，離心5 min(離心條件4 ℃、3 000 r·min-1)，將上清液在-80 ℃的條件下冷凍保存、備用。

3.5 血漿樣品的處理

將上述條件下保存的血漿樣品在室溫下融化后，取30 μL置于EP管中，再在EP管中加入150 μL含有內(nèi)標(biāo)普萘洛爾(濃度為40 ng·mL-1)的乙腈，渦旋振蕩混合5 min后，在轉(zhuǎn)速為5 800 r·min-1的條件下離心10 min，取2 μL上清液，注入LC-MS/MS儀中進(jìn)行分析。

3.6 方法學(xué)考察

3.6.1 專屬性考察

按上述色譜-質(zhì)譜條件，分別測(cè)定來(lái)自6個(gè)不同樣本的空白血漿、空白血漿添加SV和內(nèi)標(biāo)、及給藥后4 h的血漿樣品，結(jié)果顯示SV和內(nèi)標(biāo)普萘洛爾的保留時(shí)間分別是1.21 min和1.03 min，二者可以完全分離，表明SV和內(nèi)標(biāo)的測(cè)定不受血漿中其他內(nèi)源性物質(zhì)的干擾。

3.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限

將“3.2”項(xiàng)下制得的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，按“3.5”項(xiàng)下方法處理后分別進(jìn)樣分析。以比格犬血漿中SV的濃度為橫坐標(biāo)，以SV與內(nèi)標(biāo)Propranolol的峰面積比為縱坐標(biāo)，采用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸計(jì)算，得回歸方程Y=0.0027X-0.004 (r=0.99993)，SV血漿濃度在1-1000 ng·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。以標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低點(diǎn)濃度作為最低定量限，定量下限為1 ng·mL-1。

3.6.3 回收率考察

取高(3 μg·mL-1)、中(1 μg·mL-1)、低(0.1 μg·mL-1)濃度的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品、每個(gè)濃度各5份作為質(zhì)控樣品，按“3.5”項(xiàng)下方法處理后，計(jì)算提取回收率，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算方法回收率，結(jié)果見表3。由表3中可知SV的回收率考察結(jié)果均滿足生物樣品分析的要求。

表3 血漿中SV的回收率(%，n=5)

3.6.4 精密度考察

取上述高(3 μg·mL-1)、中(1 μg·mL-1)、低(0.1 μg·mL-1)濃度質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度各取5份，按“3.5”項(xiàng)方法處理，計(jì)算日內(nèi)精密度。每天取上述濃度質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度各取3份，連續(xù)3 d按“3.5”項(xiàng)下處理，計(jì)算日間精密度。結(jié)果見表4，RSD均小于6%，滿足測(cè)定要求。

表4 SV的日內(nèi)、日間精密度(%，n=5)

3.7 血藥濃度-時(shí)間曲線與藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

分別于上述色譜-質(zhì)譜條件下，測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)3只比格犬血漿中SV的濃度，數(shù)據(jù)見表5。3只健康雄性比格犬在口服阿伐他汀片(口服劑量為0.93 mg/kg)后的血藥濃度-時(shí)間曲線見圖1。

將按上述色譜-質(zhì)譜條件所測(cè)得的血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)用WinNonlin V5.2.1統(tǒng)計(jì)軟件選擇非房室模型進(jìn)行計(jì)算，得到SV在比格犬體內(nèi)的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。SV在比格犬血漿中的末端消除速率(Ke)選擇末端消除法來(lái)進(jìn)行計(jì)算，在比格犬體內(nèi)的藥時(shí)曲線下面積(AUC)選擇線性梯形法或者對(duì)數(shù)梯形法來(lái)進(jìn)行計(jì)算。

表5 各時(shí)間點(diǎn)3只比格犬血漿中SV的濃度

圖1 3只健康雄性比格犬口服辛伐他汀片的血藥濃度-時(shí)間曲線

選擇非房室模型來(lái)計(jì)算辛伐他汀在比格犬體內(nèi)的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，計(jì)算結(jié)果見表6。由表6可知，辛伐他汀在3只健康雄性比格犬體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)差異較為明顯。

表6 SV在比格犬體內(nèi)的主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

4 討論與結(jié)論

臨床應(yīng)用劑量的辛伐他汀在體內(nèi)經(jīng)肝臟代謝后，血藥濃度較低，要對(duì)SV進(jìn)行定量測(cè)定必須要求所用的分析方法有極高的靈敏度，故一般的HPLC方法難以滿足其分析要求。本試驗(yàn)建立了SV在比格犬體內(nèi)血漿中的HPLC-MS/MS分析方法，該方法分析時(shí)間短(僅1.21 min)、靈敏度高、專屬性強(qiáng)、樣品處理簡(jiǎn)單、定量下限較低(1 ng·mL-1)，可滿足辛伐他汀在比格犬體內(nèi)血藥濃度的測(cè)定及藥代動(dòng)力學(xué)研究的要求。

本試驗(yàn)中血樣直接用乙腈沉淀蛋白后進(jìn)樣分析，省略了萃取、過固相柱等繁瑣步驟，與文獻(xiàn)方法比較[3-5]，該方法操作簡(jiǎn)單、內(nèi)源性物質(zhì)干擾少、成本低、提高了樣品處理效率，適用于大批量生物樣品濃度的檢測(cè)。

本試驗(yàn)中辛伐他汀在3只雄性比格犬體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)差異較大，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[6-8]，就本試驗(yàn)來(lái)分析，原因可能與比格犬個(gè)體化差異大有關(guān)，這提示臨床用藥時(shí)要注意個(gè)體化給藥。本試驗(yàn)的研究可為辛伐他汀藥物的臨床合理應(yīng)用提供參考價(jià)值。