釀酒酵母PDEs基因缺失對(duì)藍(lán)莓果酒抗氧化及揮發(fā)性物質(zhì)的影響

馬國(guó)為，姚 婷，談太聰，何欣萌，張亮然，王友升,*

(1.北京工商大學(xué) 北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100048；2.山東大學(xué) 微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100)

藍(lán)莓果實(shí)富含礦物質(zhì)、微量元素、維生素以及多酚類物質(zhì)等，具有抗氧化、保護(hù)視力、增強(qiáng)心臟功能、軟化血管、增強(qiáng)人體免疫力等功能[1-2]。藍(lán)莓生產(chǎn)的季節(jié)性和區(qū)域性限制了藍(lán)莓的貯藏和銷售，因此藍(lán)莓的生產(chǎn)和加工引起了生產(chǎn)者和消費(fèi)者的廣泛關(guān)注[3]。藍(lán)莓果酒的加工不僅解決藍(lán)莓儲(chǔ)藏的問題，還可以有效保留果實(shí)原有的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，提高其附加值[4]。在果酒釀造過程中，釀酒酵母菌種、糖度、酸度、溫度和SO2濃度是影響果酒發(fā)酵質(zhì)量的重要因素[5]。已有研究表明，酵母菌種是影響果酒風(fēng)味的關(guān)鍵因素之一[6]。

釀酒酵母的生存活力以及發(fā)酵特性主要受高酒精度、高滲透壓、氧化脅迫、低pH值等脅迫條件的影響[7]；而釀酒酵母內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)和環(huán)磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate,cGMP)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、代謝以及對(duì)脅迫條件的抗性發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[8]。環(huán)核苷酸磷酸二酯酶(cyclic nucleotide phosphodiesterase，PDEs)通過自身的磷酸化調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)第二信使cAMP或cGMP的信號(hào)傳導(dǎo)過程[9]。PDEs超家族可分I型和II型兩大類，酵母中含有yPDE1(Ⅱ型)和yPDE2(Ⅰ型)兩種PDEs，yPDE1和yPDE2在酵母細(xì)胞中發(fā)揮著不同的生理功能[10-11]。在對(duì)cAMP/cGMP信號(hào)通路調(diào)控釀酒酵母生存活力的研究中發(fā)現(xiàn)，yPDE1在反饋抑制葡萄糖誘導(dǎo)的cAMP信號(hào)通路發(fā)揮著特定功能[12]，yPDE2過量表達(dá)可提高酵母對(duì)氧化脅迫和酒精脅迫的耐受性[13-14]。由此可見，PDEs基因缺失能夠影響釀酒酵母的活性。已有研究表明，PDEs突變菌株能提高果酒發(fā)酵速率[15]，但對(duì)于利用PDEs基因缺失的釀酒酵母進(jìn)行藍(lán)莓果酒發(fā)酵特性的研究目前未見相關(guān)報(bào)道。

本研究擬采用藍(lán)莓果實(shí)為原料，通過比較野生型釀酒酵母與PDEs基因缺失菌株釀造的果酒理化特性、抗氧化能力、活性物質(zhì)和揮發(fā)性物質(zhì)含量，探究PDE1和PDE2基因?qū)︶劸平湍傅陌l(fā)酵特性的影響，以期為篩選優(yōu)良釀酒酵母提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料

菌株：野生型釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，為本實(shí)驗(yàn)室保存菌株。結(jié)合同源重組原理和醋酸鋰酵母高效轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行基因敲除。PDE1和PDE2基因單拷貝敲除菌株分別為PDE1/Δpde1和PDE2/Δpde2突變菌株，PDE1和PDE2基因雙拷貝敲除菌株分別為Δpde1/Δpde1和Δpde2/Δpde2突變菌株。

藍(lán)豐藍(lán)莓：山東藍(lán)莓生產(chǎn)基地提供，藍(lán)莓初始可溶性固形物含量(SSC)為10.6°Brix，總酸質(zhì)量濃度為6.87 g/L。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑

引物由Invitrogen公司負(fù)責(zé)合成；DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)2×TaqPCR Master Mix、6×loading buffer(溴酚藍(lán))以及MarkerⅦ，天根生化試劑公司；Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes、polyethylene glycol和lithium acetate dihydrate，美國(guó)Sigma公司；三羥甲基氨基甲烷(tris methyl aminomethane，Tris)、hygromycin B、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、G418 sulfate、Triton-X100和乙二胺四乙酸鈉(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)，美國(guó)Amresco公司；偏重亞硫酸鉀、偏重亞硫酸鈉、果膠酶(30 000 Da)等均為食品級(jí)，上海和氏璧化工有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、結(jié)晶紫、葡萄糖等均為分析純；酵母浸粉、蛋白胨、瓊脂均為生物試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

HQ45型恒溫?fù)u床，武漢中科科儀技術(shù)發(fā)展有限公司；5810R型高速離心機(jī)，美國(guó)Eppendorf公司；生物安全柜，美國(guó)Thermo公司；PCR儀，美國(guó)Bio- Rad公司；QP2010型氣相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司；PC- 420D型固相微萃取工作臺(tái)，Corning 公司；PR- 201型數(shù)字式糖度計(jì)，上海右一公司；Mole-cular Devices SpectraMax 190型酶標(biāo)儀，上海艾研生物科技有限公司；T6型新世紀(jì)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1藍(lán)莓果酒釀造

挑選成熟度高、無腐爛變質(zhì)的新鮮藍(lán)莓，用清水洗凈、打漿。向果漿中加入100 mg/L果膠酶，酶解2 h，用紗布過濾除去殘?jiān)?，添加蔗糖將藍(lán)莓汁的SSC調(diào)至22°Brix。藍(lán)莓汁中加入200 mg/L偏重亞硫酸鉀進(jìn)行4 h殺菌，最后將野生型釀酒酵母(WT)及4株P(guān)DE1/Δpde1、Δpde1/Δpde1、PDE2/Δpde2和Δpde2/Δpde2突變菌株分別接種到等量藍(lán)莓汁中，接種量均為2×107CFU/mL。將發(fā)酵罐放置在20 ℃條件下進(jìn)行恒溫發(fā)酵，每天攪拌2次。發(fā)酵結(jié)束后，將藍(lán)莓酒進(jìn)行皮渣分離，果酒濾液密封保存進(jìn)入陳釀期，陳釀結(jié)束后再進(jìn)行過濾灌裝即得成品。

1.3.2藍(lán)莓果酒發(fā)酵特性測(cè)定

1.3.2.1 理化指標(biāo)測(cè)定

pH：采用酸度計(jì)測(cè)?？偹幔翰捎脡A式滴定法測(cè)定。酒精度：采用比色法測(cè)定[16]。糖度：采用硫酸- 苯酚比色法測(cè)定[17]。每項(xiàng)測(cè)定各重復(fù)3次。

1.3.2.2 抗氧化能力測(cè)定

DPPH自由基清除能力的測(cè)定參考文獻(xiàn)[18]方法；羥自由基清除能力的測(cè)定參照文獻(xiàn)[19]方法；ABTS自由基清除能力的測(cè)定參考文獻(xiàn)[20]方法。各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均將自由基清除率為50%定義為1個(gè)活性單位(U)，樣品自由基清除能力表示為單位質(zhì)量(g)新鮮樣品中含有的活性單位(U/g)。

1.3.2.3 活性物質(zhì)含量測(cè)定

總酚的測(cè)定參照文獻(xiàn)[21]方法，并略有改進(jìn)：以沒食子酸作標(biāo)準(zhǔn)曲線，總酚含量換算為每100 g新鮮樣品中沒食子酸當(dāng)量值(mg/100 g)?？傸S酮含量測(cè)定參考文獻(xiàn)[22]方法：以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，總黃酮含量換算為每100 g新鮮樣品中蘆丁當(dāng)量值(mg/100 g)；花青素含量的測(cè)定參照文獻(xiàn)[23]方法。

1.3.2.4 揮發(fā)性物質(zhì)測(cè)定

采用SPME- GC/MS法測(cè)定藍(lán)莓果酒的揮發(fā)性物質(zhì)。取3 g待測(cè)樣品，裝入15 mL樣品瓶，加0.9 g氯化鈉和轉(zhuǎn)子，密封后50 ℃、400 r/min條件下平衡20 min，75 μm CAR/PDMS萃取頭進(jìn)行萃取，50 ℃萃取30 min后，GC進(jìn)樣口解析3 min，同時(shí)啟動(dòng)儀器采集數(shù)據(jù)。

色譜柱：SPB- 50毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)。升溫程序：初溫50 ℃，保持2 min，以3 ℃/min升溫至150 ℃，再以5 ℃/min的速度升溫至250 ℃保持5 min。載氣(He)流速為1.0 mL/min，不分流進(jìn)樣。質(zhì)譜條件：接口溫度為250 ℃，離子源溫度220 ℃，電離方式EI，電子能量70 eV，掃描質(zhì)量范圍為50～600 u。利用質(zhì)譜與保留指數(shù)兩者結(jié)合定性，采用TIC峰面積歸一化法對(duì)果酒中揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生型及突變體菌株釀造的藍(lán)莓果酒品質(zhì)指標(biāo)比較

圖1 不同釀酒酵母發(fā)酵的藍(lán)莓果酒的品質(zhì)變化Fig.1 Change of quality in blueberry wine fermented by different Saccharomyces cerevisiae

接種不同釀酒酵母的藍(lán)莓果酒發(fā)酵過程中pH值、酒精度、總糖、總酸的變化情況見圖1。野生型釀酒酵母以及4株P(guān)DEs基因缺失菌株發(fā)酵的藍(lán)莓果酒在發(fā)酵過程中總糖、酒精度、總酸、pH值的變化趨勢(shì)基本一致。由圖1(d)可知，Δpde1/Δpde1菌株利用糖的效率最高，而PDE1/Δpde1菌株利用糖的效率最低。Δpde1/Δpde1菌株在發(fā)酵前6 d酒精度增加速度最快，PDE1/Δpde1菌株增加速度最慢，與利用糖的效率呈正相關(guān)。Δpde2/Δpde2菌株發(fā)酵結(jié)束后總酸度最高，為7.18 g/L，是野生型的1.2倍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與野生型釀酒酵母相比，PDE1/Δpde1菌株降低藍(lán)莓果酒的發(fā)酵速度，而Δpde1/Δpde1、Δpde2/Δpde2和PDE2/Δpde2菌株均會(huì)提高藍(lán)莓果酒發(fā)酵速度，其中Δpde1/Δpde1菌株的發(fā)酵速度最快。

2.2 野生型及突變體菌株釀造的藍(lán)莓果酒的抗氧化能力比較

不同小寫字母代表不同菌株發(fā)酵的藍(lán)莓果酒的抗氧化能力之間差異顯著。圖2 不同釀酒酵母發(fā)酵的藍(lán)莓果酒抗氧化指標(biāo)的變化Fig.2 Changes of antioxidant index in blueberry wine fermented by different strains of Saccharomyces cerevisiae

比較不同酵母菌株發(fā)酵的藍(lán)莓果酒的抗氧化能力差異，結(jié)果見圖2。由圖2(a)可知，野生型發(fā)酵的藍(lán)莓果酒對(duì)DPPH自由基的清除能力為942.76 U/g，PDE1/Δpde1、Δpde1/Δpde1、PDE2/Δpde2和Δpde2/Δpde2菌株發(fā)酵的果酒清除能力分別是野生型的55%、42%、51%和31%；同時(shí)，圖2(b)結(jié)果顯示，野生型酵母發(fā)酵的藍(lán)莓果酒ABTS自由基清除能力為2 387.92 mg/100 g，PDE1/Δpde1和PDE2/Δpde2發(fā)酵的果酒ABTS自由基清除能力與野生型能力接近，而Δpde1/Δpde1和Δpde2/Δpde2菌株的能力分別是野生型的76%和67%；此外，野生型酵母發(fā)酵的藍(lán)莓果酒羥自由基清除能力為141.72 U/g，Δpde1/Δpde1菌株發(fā)酵的果酒羥自由基清除能力達(dá)到野生型的1.3倍，而PDE1/Δpde1、PDE2/Δpde2和Δpde2/Δpde2發(fā)酵的果酒羥自由基清除能力僅為野生型的49%、75%和24%。結(jié)果表明，與野生型釀酒酵母相比，PDEs基因缺失菌株會(huì)降低藍(lán)莓果酒對(duì)DPPH和ABTS自由基的清除能力，且Δpde1/Δpde1和Δpde2/Δpde2菌株的清除能力低于PDE1/Δpde1和PDE2/Δpde2的清除能力；Δpde1/Δpde1菌株會(huì)提高對(duì)羥自由基的清除能力。綜合比較，Δpde1/Δpde1菌株的抗氧化能力強(qiáng)于Δpde2/Δpde2菌株的抗氧化能力。

2.3 野生型及突變體菌株釀造的藍(lán)莓果酒中活性物質(zhì)含量的比較

不同小寫字母代表不同菌株發(fā)酵的藍(lán)莓果酒中活性物質(zhì)之間差異顯著。圖3 接種野生型和突變菌株的藍(lán)莓發(fā)酵醪液中活性物質(zhì)含量Fig.3 Content of active substances of fermented mash with wild and mutant strains

比較接種不同釀酒酵母的藍(lán)莓果酒中總酚、總黃酮和花青素含量的差異，結(jié)果見圖3。PDEs基因缺失菌株發(fā)酵的藍(lán)莓果酒的總酚與總黃酮含量與野生型相比差異顯著。野生型釀酒酵母發(fā)酵的藍(lán)莓果酒總酚質(zhì)量比為3.24 mg/100 g，Δpde1/Δpde1、PDE2/Δpde2和Δpde2/Δpde2菌株發(fā)酵的藍(lán)莓果酒總酚含量分別為野生型的1.5，1.3和1.15倍，而PDE1/Δpde1菌株發(fā)酵的藍(lán)莓果酒中總酚含量低于野生型。同時(shí)，野生型發(fā)酵的藍(lán)莓果酒的總黃酮質(zhì)量比為20.53 mg/100 g，4株突變體發(fā)酵的藍(lán)莓果酒中總黃酮含量均低于野生型，依次是野生型的63%、65%、69%和18%。相比而言，Δpde2/Δpde2菌株發(fā)酵的藍(lán)莓果酒中花青素含量是野生型的1.03，PDE1/Δpde1菌株發(fā)酵的藍(lán)莓果酒中花青素含量與野生型菌株無顯著性差異，Δpde1/Δpde1、PDE2/Δpde2菌株發(fā)酵的果酒中花青素含量低于野生菌株，依次是野型菌株的92%和90%。結(jié)果表明，與野生型釀酒酵母相比，Δpde1/Δpde1、PDE2/Δpde2和Δpde2/Δpde2菌株會(huì)提高藍(lán)莓果酒的總酚含量；PDEs基因缺失會(huì)降低藍(lán)莓果酒中總黃酮含量，且Δpde2/Δpde2菌株釀造的藍(lán)莓果酒中總黃酮含量最低；PDEs基因缺失對(duì)藍(lán)莓果酒中花青素含量影響較小。

2.4 藍(lán)莓果酒抗氧化能力與活性物質(zhì)的相關(guān)性分析

對(duì)藍(lán)莓果酒的抗氧化能力與活性物質(zhì)含量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見表1。由表1可知，藍(lán)莓果酒的抗氧化能力與總黃酮含量呈正相關(guān)，其中ABTS自由基清除能力與總黃酮含量的正相關(guān)性達(dá)到顯著水平；相比而言，羥自由基清除能力與總酚含量呈正相關(guān)，但不顯著，而DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力均與總酚含量呈負(fù)相關(guān)；DPPH自由基清除能力與花青素含量呈正相關(guān)，而ABTS自由基清除能力和羥自由基清除能力與花青素含量呈負(fù)相關(guān)。分析結(jié)果表明，總黃酮可能是藍(lán)莓果酒抗氧化能力的關(guān)鍵活性物質(zhì)，而且也可能存在其他活性物質(zhì)對(duì)藍(lán)莓果酒的抗氧化能力起重要作用。

表1 果酒抗氧化能力與活性物質(zhì)的相關(guān)性分析Tab.1 Correlation analysis between antioxidant capacity and active components of blueberry wine

2.5 野生型和突變菌株釀造的藍(lán)莓果酒揮發(fā)性物質(zhì)比較

從5種不同菌株發(fā)酵的藍(lán)莓果酒中共檢測(cè)到33種揮發(fā)性物質(zhì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。表2中，包括10種醇類物質(zhì)、11種酯類物質(zhì)、4種酸類物質(zhì)、3種酚類物質(zhì)、3種醛類物質(zhì)、1種酮類物質(zhì)和1種烴類物質(zhì)。圖4為不同釀酒酵母發(fā)酵的藍(lán)莓果酒中揮發(fā)性物質(zhì)含量，PDE1/Δpde1菌株發(fā)酵的果酒中醛類物質(zhì)為主要成分，其次是醇類物質(zhì)；而其他4種菌株發(fā)酵的藍(lán)莓果酒中醇類物質(zhì)含量最高，Δpde1/Δpde1菌株發(fā)酵的果酒中醇類物質(zhì)高達(dá)83%，其次為酸類物質(zhì)。

表2 野生型和突變菌株釀造的藍(lán)莓果酒揮發(fā)性物質(zhì)的種類和含量Tab.2 Species and contents of volatile substances of blueberry wine fermented by wild type and mutant strains

“—”表示未檢測(cè)到該物質(zhì)。

圖4 5種菌株發(fā)酵的藍(lán)莓果酒中揮發(fā)性物質(zhì)含量Fig.4 Volatile components in blueberry wine fermented by five strains

醇類物質(zhì)是產(chǎn)生果酒香氣的主要成分，目前在5種藍(lán)莓果酒中檢測(cè)到的醇類物質(zhì)主要有芳樟醇、苯乙醇、松油醇(表2)。研究表明，苯乙醇和香葉醇具有玫瑰花香，苯乙醇可在發(fā)酵期間產(chǎn)生。芳樟醇、松油醇和香茅醇能增加果酒的果香和甜香的特征[24]。PDE1/Δpde1釀造的藍(lán)莓果酒中的醇類物質(zhì)低于野生菌株，PDE2/Δpde2菌株發(fā)酵的藍(lán)莓果酒的醇類物質(zhì)高于野生菌株。Δpde1/Δpde1和Δpde2/Δpde2菌株發(fā)酵的藍(lán)莓果酒中的苯乙醇含量明顯高于其他菌株。在突變菌株發(fā)酵的藍(lán)莓果酒中未檢測(cè)到桉樹醇和香茅醇。從醇類物質(zhì)的變化情況可以看出，Δpde1/Δpde1菌株發(fā)酵的藍(lán)莓果酒醇類物質(zhì)含量最高。

酯類物質(zhì)是果實(shí)發(fā)酵過程中醇類物質(zhì)和酸類物質(zhì)發(fā)生酯化反應(yīng)形成的，也是果酒香氣的主體成分[25]。突變菌株釀造的果酒中酯類物質(zhì)含量低于野生菌株，尤其PDE1/Δpde1釀造的藍(lán)莓果酒只存在肉豆蔻酸異丙酯(表2)。在突變菌株中，Δpde1/Δpde1菌株發(fā)酵的藍(lán)莓果酒醇類物質(zhì)含量最高，其次為Δpde2/Δpde2。苯甲酸乙酯、苯乙醇乙酸酯、癸酸乙酯、乙酸丁香酚酯具有果香和花香的特征。Δpde1/Δpde1和Δpde2/Δpde2菌株發(fā)酵過程中產(chǎn)生了乙酸丁香酚酯并增加了苯乙醇乙酸酯的合成。

檢測(cè)得到的酸類物質(zhì)中，辛酸占總酸類物質(zhì)的60%～90%。突變菌株發(fā)酵的果酒中酸類物質(zhì)總含量明顯低于野生菌株，其中Δpde1/Δpde1菌株發(fā)酵的藍(lán)莓果酒中酸類物質(zhì)含量最少。酚類物質(zhì)主要是愈創(chuàng)木酚、丁香酚和異丁香酚，其中愈創(chuàng)木酚含量最高。愈創(chuàng)木酚具有獨(dú)特的芬香氣味，丁香酚和異丁香酚均具有濃烈的丁香香氣和辛香香氣。除了PDE2/Δpde2菌株，其余3株突變菌株發(fā)酵的藍(lán)莓果酒中愈創(chuàng)木酚含量低于野生菌株。Δpde1/Δpde1菌株發(fā)酵過程中產(chǎn)生了異丁香酚。

醛類物質(zhì)主要檢測(cè)到壬醛、苯乙醛和5-羥甲基糠醛。苯乙醛具有水果的甜香氣味，突變菌株發(fā)酵的藍(lán)莓果酒中苯乙醛的含量低于野生菌株，在突變菌株中，Δpde2/Δpde2菌株釀造的藍(lán)莓果酒中的苯乙醛含量最高。4種突變菌株發(fā)酵過程產(chǎn)生5-羥甲基糠醛，其中PDE1/Δpde1釀造的藍(lán)莓果酒中含量最高。

3 討 論

本研究結(jié)果表明，與野生型釀酒酵母相比，突變菌株Δpde1/Δpde1、Δpde2/Δpde2和PDE2/Δpde2均會(huì)提高藍(lán)莓果酒發(fā)酵速度，其中Δpde1/Δpde1菌株在發(fā)酵過程中糖的消耗速度以及酒精度的上升速度最快，最能有效提高藍(lán)莓果酒發(fā)酵速度。研究表明，PDE1對(duì)控制葡萄糖和細(xì)胞內(nèi)酸化反應(yīng)起著重要的生理作用，且敲除PDE1會(huì)導(dǎo)致釀酒酵母在添加葡萄糖后cAMP積聚更高[26]，由此可以說明，敲除PDE1基因的釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)cAMP水平會(huì)升高，信號(hào)傳導(dǎo)速度更快，從而利用糖的速度更快。

Δpde1/Δpde1菌株發(fā)酵的藍(lán)莓果酒的羥自由基清除能力高于野生型菌株，Δpde2/Δpde2菌株發(fā)酵的藍(lán)莓果酒對(duì)DPPH、ABTS和羥自由基清除能力與其他菌株相比均最弱，而且Δpde1/Δpde1和Δpde2/Δpde2菌株發(fā)酵的藍(lán)莓果酒對(duì)DPPH和ABTS自由基清除能力分別低于PDE1/Δpde1和PDE2/Δpde2菌株的能力?？梢酝茢啵琍DEs基因的缺失會(huì)降低釀酒酵母發(fā)酵藍(lán)莓果酒的抗氧化能力，且PDE2基因影響大于PDE1基因，PDEs基因雙敲的影響大于PDEs基因單敲。有研究指出，PDE2缺失會(huì)影響許多不同功能類別的基因，也會(huì)明顯影響細(xì)胞壁的完整性[26-27]。同時(shí)，酵母細(xì)胞在以葡萄糖為碳源時(shí)，其時(shí)序壽命與Ras- cAMP信號(hào)通路的活性呈負(fù)相關(guān)[28]，因此，當(dāng)PDEs基因被敲除后，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路活性增強(qiáng)，而細(xì)胞的時(shí)序壽命縮短，生成的活性物質(zhì)會(huì)相應(yīng)減少，從而抗氧化能力下降。又因?yàn)镻DE1對(duì)cAMP親和力和特異性低于PDE2，且有報(bào)道稱釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)單獨(dú)破壞PDE1基因觀察不到PDE2基因被破壞時(shí)的一些表型[11]，進(jìn)一步說明PDE2基因影響大于PDE1基因。

Δpde1/Δpde1菌株釀造的藍(lán)莓果酒中總酚含量最高，PDEs基因缺失會(huì)降低藍(lán)莓果酒中總黃酮含量，而PDEs基因缺失對(duì)藍(lán)莓果酒中花青素含量影響較小。綜合比較，Δpde1/Δpde1菌株的活性物質(zhì)含量最高且抗氧化能力最強(qiáng)。PDEs基因缺失菌株釀造的藍(lán)莓果酒香氣成分種類和含量存在差異，突變菌株發(fā)酵的藍(lán)莓果酒中的醇類、醛類、酮類以及烴類物質(zhì)高于野生型菌株發(fā)酵的果酒，但酯類、酸類和酚類物質(zhì)低于野生型菌株發(fā)酵的果酒。此外，PDEs基因雙敲菌株發(fā)酵的果酒中醇類、酯類和酮類等香氣成分高于PDEs基因單敲菌株，其中Δpde1/Δpde1菌株發(fā)酵的果酒中香氣種類較多，醇類和酯類物質(zhì)含量最高。

4 結(jié) 論

通過考察野生型與PDEs基因缺失釀酒酵母對(duì)藍(lán)莓果酒發(fā)酵特性及品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)突變菌株中Δpde1/Δpde1菌株最能有效提高藍(lán)莓果酒的發(fā)酵速度，PDE1和PDE2基因的缺失會(huì)降低釀酒酵母發(fā)酵藍(lán)莓果酒的抗氧化能力，且敲除PDE2的釀酒酵母釀造的藍(lán)莓果酒的抗氧化能力比敲除PDE1的更弱。PDEs基因雙敲菌株發(fā)酵的藍(lán)莓果酒中香氣物質(zhì)種類以及含量高于PDEs基因單敲菌株，其中Δpde1/Δpde1菌株發(fā)酵的藍(lán)莓果酒中芳樟醇、苯乙醇、松油醇和苯乙醇乙酸酯等香氣成分含量較多。由此可知，釀酒酵母中PDEs基因敲除顯著影響果酒發(fā)酵的特性，PDE2基因的敲除影響大于PDE1基因，且PDEs基因雙敲的影響大于PDEs基因單敲。