玉米黃粉二步酶解制備高F值寡肽的工藝優(yōu)化

楊華青，侯 威，趙 磊，*，王成濤，，盧 松

(1.北京工商大學(xué) 北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心/北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京 100048；2.內(nèi)蒙古阜豐生物科技有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030)

玉米黃粉又被稱為玉米蛋白粉，是濕磨法生產(chǎn)淀粉的副產(chǎn)物。玉米黃粉溶解性差、口感粗糙，色氨酸、賴氨酸等人體必需氨基酸含量不足的缺陷，大大限制了其在食品行業(yè)中的應(yīng)用[1-2]。玉米黃粉蛋白質(zhì)含量高達(dá)65%，且纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸等支鏈氨基酸(BCAA)與酪氨酸、苯丙氨酸等芳香族氨基酸(AAA)的摩爾數(shù)比值(fischer ratio,F值)高達(dá)4.8，顯著高于大豆(3.91)、小麥(3.29)、高粱(4.6)等豆谷類作物[3]。玉米黃粉通過水解可制備玉米蛋白肽，增強(qiáng)了溶解性，有利于提高其功能性和生物利用度[4-5]。與酸或堿水解相比，蛋白酶水解法具有工藝條件溫和，很少或沒有不良副反應(yīng)或產(chǎn)物，終產(chǎn)物經(jīng)中和后含鹽量較少，并可通過選擇特定酶和反應(yīng)因子來控制終產(chǎn)物功能性等優(yōu)點(diǎn)。玉米黃粉由于其氨基酸組成特點(diǎn)，尤其適合蛋白酶酶解制備高F值寡肽[6](HFRP，即一類由2～9個(gè)氨基酸殘基組成的、F值大于20的寡肽)。臨床醫(yī)學(xué)已證明[7]，高F值制劑可輔助治療肝臟切除手術(shù)的患者，改善病人的營養(yǎng)狀況，防止肝性腦病的發(fā)生或減緩其癥狀。

二步酶解是采用不少于2種的酶相繼水解底物的方法，可靈活選擇不同性質(zhì)、不同水解位點(diǎn)的酶，實(shí)現(xiàn)深度水解，并可定向設(shè)計(jì)水解產(chǎn)物的分子質(zhì)量、肽鏈的分子組成等[8]。采用蛋白酶水解玉米黃粉時(shí)，有時(shí)產(chǎn)物會(huì)有苦味，而采用二步酶解制備高F值寡肽，有利于控制肽鏈末端的疏水性氨基酸含量，得到低苦味活性肽。

本文以玉米黃粉為原料，采用二步酶解法，選擇具有內(nèi)切酶屬性的堿性蛋白酶和具有外切酶屬性的復(fù)合風(fēng)味蛋白酶，制備HFRP，并對(duì)制備工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為玉米黃粉資源綜合利用提供理論和技術(shù)指導(dǎo)，提高其利用率及附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米黃粉，阜豐集團(tuán)有限公司；堿性蛋白酶(2.4 AU-A/g，CAS:9014-01-1)、中性蛋白酶(0.8 AU/g，CAS:9080-56-2)、復(fù)合風(fēng)味蛋白酶(500 LAPU/g，未經(jīng)基因改造的米曲霉(Aspergillusoryzae)深層發(fā)酵生產(chǎn)的內(nèi)切蛋白酶和外切肽酶復(fù)合物)、復(fù)合蛋白酶(1.5 AU/g，枯草芽孢桿菌發(fā)酵、濃縮，提取復(fù)合而成)，諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司；木瓜蛋白酶(G8430)，Solarbio公司；活性炭(100目)，上海麥克林生化科技有限公司；葡聚糖凝膠Sephadex-G15，上海寶曼生物科技有限公司；玻璃層析柱(16 mm×40 cm)，廣州譽(yù)維生物科技儀器有限公司；酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、L-酪氨酸，中國藥品生物制品檢定所；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

L- 8900型氨基酸自動(dòng)分析儀，日本日立公司；UV2450型紫外可見光分光光度計(jì)，日本島津公司；YS- 10型小型高速粉碎機(jī)，北京燕山正德機(jī)械設(shè)備有限公司；HQ45型恒溫?fù)u床，中國科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠；Combi- 514R型高速冷凍離心機(jī)，翰尼科學(xué)產(chǎn)業(yè)；ATN- 300型自動(dòng)凱氏定氮儀，上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司；AKTApurifier 10型蛋白純化系統(tǒng)，美國通用公司；FD- 1B- 80型冷凍干燥機(jī)，南京普森儀器設(shè)備有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1蛋白酶活力測定

蛋白酶活力以蛋白酶活力單位表示，1 g固體酶粉(或1 mL液體酶)，在一定的溫度和pH值條件下，1 min水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸，即為1個(gè)酶活力單位(U/g或U/mL)。按照GB/T 23527—2009[9]中的方法，分別測定堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、復(fù)合風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶的酶活力。堿性蛋白酶的最適pH值為8.0，其余均為7.0；中性蛋白酶的最適溫度為45 ℃，其余均為50 ℃。

1.3.2初次酶解條件優(yōu)化

1.3.2.1 初次酶解蛋白酶的篩選

稱取一定量的玉米黃粉，料液比(g/mL)1∶5，堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、復(fù)合風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶的添加量均為5 kU/g，在最適pH值和最適溫度條件下酶解4 h。隨后將玉米黃粉酶解液pH值調(diào)為中性，沸水浴15 min終止反應(yīng)，5 000 r/min離心15 min，采用福林酚法測上清液中蛋白質(zhì)含量，計(jì)算蛋白轉(zhuǎn)化率，見式(1)。將酶解、離心后的固形物烘干后稱重計(jì)算溶解度，見式(2)。對(duì)照組不經(jīng)任何酶處理，其他步驟相同。

蛋白轉(zhuǎn)化率=ma/mb×100%；

(1)

溶解度=(m1-(m3-m2)/m1)×100%。

(2)

式(1)、式(2)中：mb、ma，分別為酶解前后樣品中蛋白質(zhì)質(zhì)量，g；m1，酶解前玉米黃粉的質(zhì)量，g；m2為空白容器質(zhì)量，g；m3，離心得到未酶解物烘干后的質(zhì)量與空白容器質(zhì)量之和，g。

1.3.2.2 初次酶解單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

按1.3.2.1節(jié)篩選出的酶和實(shí)驗(yàn)方法，研究不同的酶添加量(8～16 kU/g)、pH值(7.0 ～11.0)、料液比(g/mL)(1∶5～1∶40)、酶解時(shí)間(1.0～5.0 h)和酶解溫度(30～70 ℃)對(duì)蛋白轉(zhuǎn)化率的影響。依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取各因素下最優(yōu)水平作為正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)依據(jù)，進(jìn)行正交試驗(yàn)。

1.3.3初次酶解充分性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

向初次酶解液中加入堿性蛋白酶繼續(xù)酶解5 h，每小時(shí)取樣滅酶后測定水解度(degree of hydrolysis,DH)。水解度測定方法采用甲醛滴定法，測定步驟如下：吸取5 mL的酶解液于小燒杯中，加水60 mL，利用磁力攪拌器攪拌，用2 mol/L的NaOH將混合液pH值調(diào)節(jié)至8.2，向容器中加入10 mL體積分?jǐn)?shù)37%甲醛溶液，最后利用上述濃度的NaOH滴定溶液至pH值 9.2，記錄消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(V1，mL)。以相同體積的蒸餾水代替酶解液作為對(duì)照，處理方法相同，記錄消耗的體積(V2，mL)。以此計(jì)算氨基氮含量(ρ)和水解度，見式(3)、式(4)。

ρ=(V1-V2)×c×M/V0。

(3)

式(3)中：ρ，樣品中氨基氮含量，mg/mL；c，NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mmol/mL；M，氮原子摩爾質(zhì)量，mg/mmol；V0，樣品的體積，mL。

DH=(ρ1-ρ0)/ρtot。

(4)

式(4)中：ρ1，水解液中氨基氮含量，mg/mL；ρ0，玉米蛋白粉混懸液中氨基氮含量，mg/mL；ρtot，酶解液中氮含量，mg/mL。

1.3.4二次酶解條件優(yōu)化

1.3.4.1 二次酶解蛋白酶的篩選

取一定量的玉米黃粉初次酶解液，按照木瓜蛋白酶、復(fù)合風(fēng)味蛋白酶的最適pH值和最適溫度條件，酶添加量均為1 kU/mL，酶解2.0 h，沸水浴15 min終止反應(yīng)。利用活性炭吸附，活性炭吸附條件為溫度30 ℃、pH值4.0、吸附時(shí)間1.5 h、活性炭添加量0.07 g/mL。依據(jù)GB/T 5009.124—2016[10]對(duì)吸附后的樣品進(jìn)行前處理，利用氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行氨基酸組成分析和含量測定，按式(5)計(jì)算F值。

F值=n(BCAA)/n(AAA)。

(5)

式(5)中：n(BCAA)為支鏈氨基酸(纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸)摩爾數(shù)；n(AAA)為芳香族氨基酸(酪氨酸、苯丙氨酸)摩爾數(shù)。

1.3.4.2 二次酶解單因素實(shí)驗(yàn)及正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

按1.3.4.1中篩選的酶和實(shí)驗(yàn)方法，研究不同的酶添加量(0.9～8.1 kU/mL)、pH值(2.0 ～10.0)、酶解時(shí)間(1.0～5.0 h)和溫度(30～70 ℃)對(duì)F值的影響。依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取各因素下最優(yōu)水平作為正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)依據(jù)，進(jìn)行正交試驗(yàn)。

1.3.5活性肽分子質(zhì)量測定

選擇桿菌肽(分子質(zhì)量1 422.69 Da)、合成多肽1(分子質(zhì)量912.835 Da)、合成多肽2(分子質(zhì)量493.46 Da)、色氨酸(分子質(zhì)量204.213 Da)作為檢測標(biāo)準(zhǔn)物，依據(jù)它們在Sephadex G- 15自裝柱中保留時(shí)間的不同確定活性肽的分子質(zhì)量范圍。標(biāo)準(zhǔn)樣品和樣品分離條件：上樣量100 μL、樣品質(zhì)量濃度10 mg/mL、流速0.3 mL/min，流動(dòng)相為高純水，紫外檢測波長280 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶活力測定結(jié)果

各商品蛋白酶活力測定結(jié)果見表1。

表1 不同蛋白酶活力測定結(jié)果Tab.1 Enzymatic activity assay of various proteases

2.2 初次酶解條件優(yōu)化結(jié)果

2.2.1初次酶解蛋白酶的確定

初次酶解后，玉米黃粉蛋白轉(zhuǎn)換率和溶解度如圖1。堿性蛋白酶對(duì)玉米黃粉的蛋白轉(zhuǎn)化率和水解程度均高于其他蛋白酶；中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和復(fù)合蛋白酶的蛋白轉(zhuǎn)化率相近；復(fù)合風(fēng)味蛋白酶的蛋白轉(zhuǎn)化率低于其他蛋白酶，這可能與其外切酶屬性相關(guān)[11-12]，相同時(shí)間內(nèi)無法斷開玉米蛋白內(nèi)部的肽鍵，因此效果不佳。二步酶解玉米黃粉制備高F值寡肽時(shí)，初次酶解要求發(fā)生在特定的位置，使得切下的肽段末端為芳香族氨基酸，堿性蛋白酶是一種內(nèi)切蛋白酶，主要水解羧基側(cè)芳香族或疏水性氨基酸。所以，綜合考慮酶切位點(diǎn)[13]與蛋白轉(zhuǎn)化率方面的數(shù)據(jù)，優(yōu)選堿性蛋白酶作為初次酶解玉米黃粉的蛋白酶。

圖1 不同蛋白酶對(duì)玉米黃粉蛋白轉(zhuǎn)化率和溶解度的影響Fig.1 Effects of different proteases on protein conversion and solubility of corn yellow powder

資料表明[2,6,14]，蛋白酶不同，作用位點(diǎn)及使用目的也不同。木瓜蛋白酶屬于巰基蛋白酶，長期孵育時(shí)具有廣泛底物特異性，可水解肽鏈中L-精氨酸、L-賴氨酸、甘氨酸、L-瓜氨酸等羧基參與形成的肽鍵，并優(yōu)先水解肽鍵N-端具有2個(gè)羧基的氨基酸或芳香L-氨基酸的肽鍵。復(fù)合風(fēng)味蛋白酶含有內(nèi)切蛋白酶和外切肽酶2種活性，在中性或微酸性(最適pH值7.0、溫度50 ℃)條件下，該酶可用于脫除低水解度產(chǎn)物、苦味蛋白水解液的苦味，徹底水解蛋白質(zhì)，增進(jìn)和改善水解液的風(fēng)味。復(fù)合蛋白酶的主酶是堿性蛋白酶，在低水解度情況下(最適溫度40～60 ℃、最適pH值5.5～7.5)也有脫苦作用。

2.2.2初次酶解條件的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以蛋白轉(zhuǎn)化率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)初次酶解條件進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。隨著酶添加量的增加，蛋白轉(zhuǎn)化率逐漸增大，當(dāng)堿性蛋白酶添加量為12.0 kU/g時(shí)，蛋白轉(zhuǎn)化率達(dá)到44.55%，此后蛋白轉(zhuǎn)化率變化趨于平緩；因此選取10.0～12.5 kU/g作為正交試驗(yàn)區(qū)間，進(jìn)行進(jìn)一步篩選。蛋白轉(zhuǎn)化率隨著pH值的增加先增大后減小，當(dāng)pH值為9.0時(shí)，蛋白轉(zhuǎn)化率最高為44.89%；因此選取pH值為8.5～10.0作為正交試驗(yàn)區(qū)間。當(dāng)料液比(g/mL)為1∶5～1∶30時(shí)，蛋白轉(zhuǎn)化率隨著料液比的減小逐漸增大，當(dāng)料液比為1∶30時(shí)，蛋白轉(zhuǎn)化率達(dá)到63.60%，此后蛋白轉(zhuǎn)化率有所下降；因此選取料液比(g/mL)1∶20～1∶35作為正交試驗(yàn)區(qū)間。堿性蛋白酶在水解3.0 h后，蛋白轉(zhuǎn)化率最大為87.33%，而4.0 h后變化基本上趨于平穩(wěn)；因此，選擇酶解時(shí)間2.5～4.0 h作為正交試驗(yàn)區(qū)間。當(dāng)反應(yīng)溫度為30～40 ℃時(shí)，蛋白轉(zhuǎn)化率隨著溫度的增加逐漸增大，當(dāng)溫度達(dá)到40 ℃時(shí)，蛋白轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大為84.88%，此后蛋白轉(zhuǎn)化率逐漸降低；因此選擇溫度35～50 ℃作為正交試驗(yàn)區(qū)間。

表2 初次酶解條件的篩選Tab.2 Screening of conditions for primary enzymolysis

2.2.3初次酶解條件的正交試驗(yàn)結(jié)果及酶解充分性驗(yàn)證

以蛋白轉(zhuǎn)化率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，將5種條件的單因素實(shí)驗(yàn)進(jìn)行正交分析，尋找各個(gè)因素的重要性次序及最佳的搭配，結(jié)果見表3。由表3極差R的大小順序可知，各因素對(duì)蛋白轉(zhuǎn)化率的影響主次順序?yàn)镃、A、E、D、B，即料液比對(duì)酶解液中蛋白質(zhì)含量的影響最大，其次為酶添加量及作用溫度，酶作用時(shí)間對(duì)反應(yīng)結(jié)果的影響較小，pH值的不同對(duì)最終結(jié)果影響程度最小。各因素方差分析F值均小于臨界值，表明各因素都不是主要影響因素。

因此，當(dāng)以蛋白轉(zhuǎn)化率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)各因素的優(yōu)化組合為堿性蛋白酶添加量12.5 kU/g、pH值9.0、料液比(g/mL)1∶35、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間3.0 h。優(yōu)化條件下酶解玉米黃粉最終蛋白轉(zhuǎn)化率可達(dá)85.61%，較優(yōu)化前提高了452.93%。

初次酶解充分性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)顯示，在1.0～5.0 h酶解過程中，酶解液中多肽水解度維持在29.6%～29.7%，水解度無顯著性變化，表明堿性蛋白酶已將玉米蛋白充分酶切，推測芳香族氨基酸末端大部分得到暴露，因此擬以初次酶解液為底物進(jìn)行二次酶解，以期斷開芳香族氨基酸，使其游離、脫苦。

2.3 二次酶解條件優(yōu)化結(jié)果

2.3.1二次酶解蛋白酶的確定

二次酶解用酶的篩選原則是使用外切蛋白酶或者是具有外切酶活性的蛋白酶類，將位于肽端的AAA殘基切下，使初次酶解暴露出的AAA游離于酶解液中，最終在活性炭吸附作用下降低游離AAA含量，達(dá)到提高F值的目的。根據(jù)蛋白酶的屬性(內(nèi)切酶或外切酶)和相關(guān)文獻(xiàn)[15]，選擇復(fù)合風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、木瓜蛋白酶作為二次酶解備選酶(如圖2)。從圖2可以看出，復(fù)合風(fēng)味蛋白酶優(yōu)于復(fù)合蛋白酶、木瓜蛋白酶，表現(xiàn)出良好的外切酶活性，經(jīng)活性炭吸附游離氨基酸后，F(xiàn)值約為木瓜蛋白酶的2倍，因此選擇復(fù)合風(fēng)味蛋白酶作為二次酶解用酶。

2.3.2二次酶解條件的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以F值作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)二次酶解條件進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)(見表4)。當(dāng)復(fù)合風(fēng)味蛋白酶添加量為0.9～2.7 kU/mL時(shí)，隨著酶添加量的增加，F(xiàn)值逐漸增大，當(dāng)酶添加量為2.7 kU/mL時(shí)，F(xiàn)值為17.86，此后F值逐漸下降；因此選取2.25～3.15 kU/mL作為正交試驗(yàn)區(qū)間，進(jìn)行進(jìn)一步篩選。當(dāng)pH值為8.0時(shí)，F(xiàn)值最大為16.96；因此在正交試驗(yàn)時(shí)選取7.0～9.0作為試驗(yàn)區(qū)間。復(fù)合風(fēng)味蛋白酶在水解2.0 h后，F(xiàn)值達(dá)最大為18.16，因此，選擇1.5～2.5 h作為正交試驗(yàn)區(qū)間。當(dāng)反應(yīng)溫度在30～50 ℃時(shí)，F(xiàn)值隨著溫度的增加逐漸增大，當(dāng)溫度達(dá)到50 ℃時(shí)，F(xiàn)值達(dá)到最大為20.27，此后F值逐漸降低；因此選擇45～55 ℃作為正交試驗(yàn)區(qū)間。

表3 初次酶解條件正交試驗(yàn)Tab.3 Orthogonal test of primary enzymoysis conditions

F(0.05)=3.29。

圖2 不同二次酶解用酶對(duì)F值的影響Fig.2 Effect of different enzymes on F value

2.3.3二次酶解條件的正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)二次酶解單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，結(jié)果見表5。方差分析顯示各因素對(duì)F值大小影響均不顯著，但從極差分析結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，酶解時(shí)間對(duì)結(jié)果的影響較大，其次是酶添加量。分析原因可能是復(fù)合風(fēng)味蛋白酶具有外切酶活性，時(shí)間和酶添加量的增加可導(dǎo)致其不斷將肽鏈兩端的氨基酸進(jìn)行切斷，直接影響F值。結(jié)合極差分析結(jié)果可知，各因素對(duì)F值影響的大小順序依次為C、A、B、D。二次酶解正交試驗(yàn)后選擇的優(yōu)化組合為復(fù)合風(fēng)味蛋白酶添加量2.7 kU/mL、酶解時(shí)間2.5 h、pH值7.0、酶解溫度45 ℃。

表4 二次酶解條件的篩選Tab.4 Screening of secondary enzymolysis conditions

表5 二次酶解正交試驗(yàn)Tab.5 Orthogonal test of secondary enzymolysis conditions

2.4 二步蛋白酶酶解液經(jīng)活性炭吸附后氨基酸組成變化

分析二步蛋白酶酶解液經(jīng)活性炭吸附后的氨基酸組成，并分別統(tǒng)計(jì)BCAA和AAA的含量，見圖3、表6。圖3、表6顯示，經(jīng)二步酶解、活性炭吸附，樣品F值為28.30(多肽得率為35.0%)，玉米黃粉酶解前F值為3.50左右，提高了4.9倍。該數(shù)值高于孔芳[16]報(bào)道的酶法水解牛乳酪蛋白制備的寡肽混合物的F值(21.06)；低于Pedroche等[17]用固定化酶水解牛酪蛋白，并經(jīng)胰乳蛋白酶和羧肽酶A處理后的產(chǎn)物的F值(30.6)；也低于漆倩涯[18]利用超聲輔助酶法水解杏鮑菇制備的寡肽液的F值(34.78)。

圖3 活性炭吸附前后二步蛋白酶酶解液氨基酸組成Fig.3 Composition of amino acids of two-step enzymolysis before and after adsorption with activated carbon

表6 活性炭吸附前后二步蛋白酶酶解液氨基酸含量Tab.6 Content of amino acids of two-step enzymolysis before and after adsorption with activated carbon mmol/L

2.5 二步蛋白酶酶解液經(jīng)活性炭吸附后多肽分子質(zhì)量分布

酶解液中主要多肽的分子質(zhì)量范圍為204.213～1 422.69 Da，如圖4。按照氨基酸平均分子質(zhì)量為128 Da計(jì)算，酶解液中的多肽大概由2～11個(gè)氨基酸組成。HFRP的定義需要滿足以下2點(diǎn)要求：寡肽由2～9個(gè)氨基酸組成，分子質(zhì)量范圍256～1 152 Da。二步蛋白酶酶解液經(jīng)活性炭吸附后，短肽氨基酸組成和分子質(zhì)量基本滿足HFRP的要求，并且分子質(zhì)量位于493.46～912.84 Da的短肽含量占總含量的85%以上。

圖4 活性炭吸附后二步蛋白酶酶解液多肽分子質(zhì)量分布Fig.4 Molecular weight distribution of two-step enzymolysis before and after adsorption with activated carbon

3 結(jié) 論

以玉米黃粉為原料，研究并優(yōu)化了二步酶解制備HFRP的工藝條件。通過篩選得到堿性蛋白酶作為初次酶解用酶，利用其特定酶切位點(diǎn)的特性，促使芳香族氨基酸暴露于肽鏈末端，經(jīng)過優(yōu)化確定初次酶解條件為堿性蛋白酶添加量12.5 kU/g(以玉米黃粉質(zhì)量為基準(zhǔn))、pH值9.0、料液比(g/mL)1∶35，50 ℃反應(yīng)3.0 h，其蛋白轉(zhuǎn)化率為85.61%。再以初次酶解液為原料，選擇具有外切酶活性的復(fù)合風(fēng)味蛋白酶作為二次酶解用酶，通過外切酶斷開暴露于肽端的AAA，以利于后期活性炭除掉芳香族氨基酸脫苦，優(yōu)化確定二次酶解條件為酶添加量2.7 kU/mL(以玉米黃粉初次酶解液體積為基準(zhǔn))、pH值7.0，45 ℃酶解2.5 h。經(jīng)過上述二步酶解，再經(jīng)活性炭吸附，樣品寡肽得率35%，F(xiàn)值達(dá)到28.30，是酶解前的4.9倍，研究結(jié)果以期為玉米黃粉資源的綜合利用提供一定參考。