雙酶提取蒲公英根多糖工藝優(yōu)化及其抗氧化性研究

劉珊珊，劉亞瓊，張 琦，路 瑤

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，河北 保定 071001)

蒲公英(TaraxacummongolicumHand.-Mazz.)，菊科，為多年生草本植物，種類繁多，營養(yǎng)價值和藥用價值高，資源豐富。蒲公英的葉、花、根均可食用，用于制作沙拉、保健茶、釀酒及咖啡替代品等[1]，2012年被國家衛(wèi)生部列入《既是食品又是藥品的物品名單》。

蒲公英根含有多糖、黃酮、4-羥基苯乙酸肌醇酯(PIS)等多種生理活性成分[2-3]，具有抗氧化[4]、抗癌[5]、抗炎[6]等多重有益生理作用。蒲公英根多糖含量豐富，目前多糖提取常用的方法有：傳統(tǒng)熱水浸提法、超聲輔助提取法、酶提取法等[7-8]。酶解法不僅能提高多糖得率，還有助于保持多糖的活性，因而受到廣泛關(guān)注。已有報道采用木瓜蛋白酶對蒲公英進(jìn)行酶解，多糖得率為3.08%，優(yōu)于傳統(tǒng)的熱水提??；亦有使用纖維素酶提取蒲公英多糖，得率達(dá)20.67%[9-10]。上述研究均為單酶法提取多糖，有研究顯示，復(fù)合酶提取法能有效提高多糖提取率[11]，但將該方法應(yīng)用在蒲公英根多糖的提取尚未見報道。

本研究擬以烘焙后的蒲公英根粉為原料，采用木瓜蛋白酶- 纖維素酶雙酶協(xié)同提取蒲公英根多糖，并通過響應(yīng)面試驗對蒲公英根粉酶解工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以期為蒲公英根多糖提取提供新的思路，促進(jìn)蒲公英產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蒲公英根粉(80目)，試驗室自制；纖維素酶(400 U/mg)，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；木瓜蛋白酶(50萬U/g)，上海源葉生物科技有限公司；重蒸酚、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，北京索萊寶科技有限公司；無水乙醇、濃硫酸均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AR423CN型電子天平，奧豪斯儀器(上海)有限公司；H.SWX- 600BS型電熱恒溫水溫箱，金壇市朗博儀器制造有限公司；C20- SH2040型美的多功能電磁爐，美的集團(tuán)股份有限公司(廣東)；PAL- α型手持糖度計，ATAGO(愛拓)中國分公司；UV2200型紫外可見分光光度計，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1酶解工藝實驗

酶解工藝流程：取1.00 g蒲公英根粉，加定量水，加酶水浴酶解，沸水浴滅酶5 min，流水快速冷卻至室溫，用300目濾布過濾得酶解液。

蒲公英根粉制備：蒲公英根粉碎過80目檢驗篩，120 ℃烘焙35 min，每10 min翻動一次，防止焦煳。酶液配制：木瓜蛋白酶液酶活200 U/mL，纖維素酶液酶活200 U/mL，4 ℃保存待用。

1.3.2單因素實驗

1.3.2.1 單酶酶解實驗

按1.3.1實驗操作，分別進(jìn)行纖維素酶、木瓜蛋白酶酶解實驗，設(shè)料水比(g∶mL)為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 (酶添加量1.0 mL，60 ℃ 酶解1.5 h)，酶解溫度為30、40、50、60、70 ℃(料水比為1∶30,酶添加量1.0 mL，酶解1.5 h)，酶液添加量分別為0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL(料水比為1∶30，木瓜蛋白酶處理組50 ℃酶解1.5 h，纖維素酶處理組60 ℃酶解1.5 h)，測定酶解液多糖得率、可溶性固形物含量和DPPH自由基清除率，確定適宜的料水比、酶解溫度和酶液添加量。

1.3.2.2 雙酶協(xié)同作用與酶解效果實驗

按1.3.1實驗操作，料水比為1∶30，加入纖維素酶液1 mL，設(shè)木瓜蛋白酶液添加量為0、1、2、3、4 mL(50 ℃酶解1.5 h)，酶解溫度設(shè)置為50、55、60 ℃(木瓜蛋白酶液2 mL，酶解1.5 h)，酶解時間為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h(木瓜蛋白酶液2 mL，酶解溫度55 ℃)。測定酶解液多糖得率、可溶性固形物含量和DPPH自由基清除率，確定適宜的酶添加量、酶解溫度和酶解時間。

1.3.3響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，利用雙酶協(xié)同提取蒲公英根多糖，選取酶添加量、酶解溫度、酶解時間為實驗因素，以多糖含量為響應(yīng)值，通過Design Expert 8.05軟件設(shè)計三因素三水平Box-Behnken響應(yīng)面試驗，試驗方案如表1。通過二次多元回歸方程擬合，得到各實驗因素與響應(yīng)值之間函數(shù)關(guān)系的回歸方程，根據(jù)響應(yīng)面圖確定適宜的酶解工藝條件。

表1 響應(yīng)面設(shè)計中的自變量及其水平Tab.1 Independent variables and their levels in response surface design

1.4 理化指標(biāo)測定

1.4.1可溶性固形物含量測定

使用手持糖度計測量溶液的可溶性固形物含量。

1.4.2多糖含量測定

采用硫酸- 苯酚法測定多糖含量[9]。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：以光密度為縱坐標(biāo)，葡萄糖的含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按式(1)計算多糖得率。

(1)

式(1)中：Y為多糖的得率，%；C為多糖的質(zhì)量濃度，μg/mL；N為稀釋的倍數(shù)；V為酶解液體積，mL；m為蒲公英根粉質(zhì)量，g。

1.4.3DPPH自由基清除率的測定

參照文獻(xiàn)[12]，將酶解液適當(dāng)稀釋，各處理組常溫避光反應(yīng)30 min，525 nm下測定吸光度，按式(2)計算清除率。

(2)

式(2)中：A0為2 mL無水乙醇+2 mL DPPH溶液的吸光度；Ai為2 mL待測液+2 mL DPPH溶液的吸光度；Aj為2 mL待測液+2 mL無水乙醇的吸光度。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

采用SPSS 22.0軟件分析實驗結(jié)果，差異顯著水平為0.05；使用Design-Expert 8.05軟件分析響應(yīng)面結(jié)果；使用Origin 9.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線分析

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：

y=0.545 83x+0.041 72，R2=0.994 0，該曲線線性良好(圖1)，可用于計算多糖含量。

2.2 單因素實驗結(jié)果分析

2.2.1料水比對酶解效果的影響

料水比對蒲公英根粉酶解效果的影響實驗結(jié)果見圖2。由圖2可知：隨著料水比的增加，木瓜蛋白酶和纖維素酶多糖得率均呈先上升后平緩趨勢，木瓜蛋白酶的酶解效果優(yōu)于纖維素酶；可溶性固形物含量和DPPH自由基清除率逐漸降低。當(dāng)料水比較低時，底物分散程度差，不利于酶和底物充分接觸，料水比增加到一定程度后，酶促反應(yīng)處于動態(tài)平衡，得率趨于平穩(wěn)，而可溶性固形物被稀釋，DPPH自由基的清除能力不斷降低。由實驗結(jié)果可知，適宜的料水比為1∶30。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

圖2 料水比對蒲公英根多糖酶解效果的影響Fig.2 Effects of solid-liquid ratio on enzymatic hydrolysis of dandelion root polysaccharide

2.2.2酶解溫度對酶解效果的影響

圖3 酶解溫度對蒲公英根多糖酶解效果的影響Fig.3 Effects of temperature on enzymatic hydrolysis of dandelion root polysaccharide

酶解溫度對蒲公英根酶解效果的影響見圖3。由圖3可知：隨著酶解溫度的升高，多糖得率、DPPH自由基清除率均呈先上升后下降的趨勢；木瓜蛋白酶在50 ℃時出現(xiàn)峰值，纖維素酶在60 ℃時出現(xiàn)峰值；纖維素酶處理組的可溶性固形物含量隨酶解溫度升高而增加，木瓜蛋白酶處理組則呈先上升后下降趨勢。隨著溫度升高，酶活性增加，木瓜蛋白酶水解細(xì)胞壁上的糖蛋白，解除糖蛋白對多糖的束縛；纖維素酶作用于植物細(xì)胞壁上的纖維素，促進(jìn)蒲公英根多糖的釋放，進(jìn)而多糖得率升高；當(dāng)溫度超過酶最適作用溫度，酶解作用降低，導(dǎo)致多糖得率下降，DPPH自由基清除率與多糖含量相關(guān)，趨勢同步。由實驗結(jié)果可知，木瓜蛋白酶酶解的適宜溫度為50 ℃，纖維素酶酶解的適宜溫度為60 ℃。

2.2.3酶添加量對酶解效果的影響

圖4 酶添加量對蒲公英根多糖酶解效果的影響Fig.4 Effects of enzyme addition on enzymatic hydrolysis of dandelion root polysaccharide

酶添加量對蒲公英根酶解效果的影響見圖4。由圖4可知：隨著酶添加量的增加，多糖得率、DPPH自由基清除率和可溶性固形物含量均呈上升趨勢。木瓜蛋白酶在添加量為0～2.0 mL，纖維素酶添加量為0～1.0 mL時，多糖得率明顯升高，DPPH自由基清除率同步變化。繼續(xù)增加酶量，多糖得率變化不大，這是因為隨著酶添加量的增加，底物與酶接觸機(jī)會增多，多糖能夠更多地分離出來。當(dāng)酶量達(dá)到一定量后，酶解反應(yīng)趨于穩(wěn)定，繼續(xù)增加酶用量也很難明顯提高多糖得率。由實驗結(jié)果可知，木瓜蛋白酶的適宜添加量為2.0 mL，纖維素酶的適宜添加量為1.0 mL。

2.2.4雙酶協(xié)同作用對酶解效果的影響

2.2.4.1 酶添加量對雙酶酶解效果的影響

圖5 酶添加量對蒲公英根多糖雙酶協(xié)同酶解效果的影響Fig.5 Effects of enzyme addition on synergistic enzymatic hydrolysis of dandelion root polysaccharide

酶添加量對蒲公英根雙酶酶解效果的影響見圖5。由圖5可知：在纖維素酶懸液添加量為1.0 mL時，隨著木瓜蛋白酶懸液添加量的增加，多糖得率、DPPH自由基清除率和可溶性固形物含量均呈先上升后下降的趨勢。木瓜蛋白酶添加量為2.0 mL時出現(xiàn)峰值，可能是因為在木瓜蛋白酶懸液添加量達(dá)到飽和之前，兩者表現(xiàn)為增效作用，而當(dāng)添加量過高時出現(xiàn)反饋抑制。由實驗結(jié)果可知，木瓜蛋白酶懸液的適宜添加量為2.0 mL。

2.2.4.2 酶解溫度對雙酶酶解效果的影響

酶解溫度對蒲公英根雙酶酶解效果的影響見圖6。由圖6可知：隨著酶解溫度的增加，多糖得率、DPPH自由基清除率和可溶性固形物含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且均在55 ℃時出現(xiàn)峰值。故雙酶協(xié)同適宜的酶解溫度為55 ℃。

2.2.4.3 酶解時間對雙酶酶解效果的影響

酶解時間對蒲公英根雙酶酶解效果的影響見圖7。由圖7可知：隨著酶解時間的增加，多糖得率、DPPH自由基清除率均呈先上升后下降趨勢，在2.0 h時出現(xiàn)峰值；可溶性固形物含量呈緩慢上升趨勢。延長酶解時間有助于酶與底物充分結(jié)合，促進(jìn)多糖溶出；但酶解時間過長可能會導(dǎo)致活性物質(zhì)抗氧化能力減弱，生產(chǎn)周期變長、生產(chǎn)成本增加。由實驗結(jié)果可知，適宜酶解時間為2.0 h。

圖6 酶解溫度對蒲公英根多糖雙酶協(xié)同酶解效果的影響Fig.6 Effects of hydrolysis temperature on synergistic enzymatic hydrolysis of dandelion root polysaccharide

圖7 酶解時間對蒲公英根多糖雙酶協(xié)同酶解效果的影響Fig.7 Effects of hydrolysis time on synergistic enzymatic hydrolysis of dandelion root polysaccharide

2.3 Box-Behnken響應(yīng)面試驗結(jié)果

Box-Behnken響應(yīng)面試驗結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果如表3。多糖得率為22.10%～33.34%，蒲公英根多糖得率(Y1)對酶解溫度(A)、酶解時間(B)和酶添加量(C)的二次多項回歸方程，見式(3)。

Y1=32.9-0.59A-0.60B-0.54C+0.34AB-0.93AC-0.47BC-6.7A2-1.73B2-1.67C2。

(3)

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果Tab.2 Experimental results of Box-Behnken experiment

表3 回歸模型方差分析Tab.3 Variance analysis of regression model

方差分析結(jié)果表明，建立的模型具有很高的顯著性(P<0.000 1，F(xiàn)=92.54)，模型的失擬項P值為0.223 7，大于0.05，失擬項檢驗不顯著，說明模型適當(dāng)?？梢钥闯?，影響多糖得率的因素按照由大到小順序依次為：酶解時間(B)、酶解溫度(A)、酶添加量(C)。在所選各因素水平范圍內(nèi)，A、B、C、A2、B2、C2、AC對Y的影響顯著(P<0.05)，因此，交互項和二次項對響應(yīng)值也有較大的影響。

響應(yīng)面模型可靠性分析見表4，試驗?zāi)Ｐ蛿M合度為0.991 7，表示試驗結(jié)果的預(yù)測值與實際值高度相關(guān)；校正決定系數(shù)為0.980 9，模型的精密度為25.360，變異系數(shù)為1.900，說明試驗結(jié)果較可靠，建立的模型能夠較好地描述多糖得率隨酶解條件的變化規(guī)律，可用此模型對多糖得率進(jìn)行分析和預(yù)測。

圖8 各因素交互作用的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface diagram of interaction of various factors

由回歸方程所做的響應(yīng)面圖如圖8。由回歸方程可知，二次項系數(shù)為負(fù)值，表明方程具有最大值。

表4 響應(yīng)面模型可靠性分析Tab.4 Reliability analysis of response surface model

任何兩個交互因素的響應(yīng)面都存在最高點，酶解時間和酶解溫度對多糖得率的影響較大，酶添加量對得率的影響較小。通過軟件Design-Expert 8.05分析，適宜酶解條件：酶解溫度為55.31 ℃，酶解時間為1.9 h，纖維素酶液添加量0.99 mL，木瓜蛋白酶液添加量1.98 mL，料水比1∶30，在此條件下多糖得率的預(yù)測值為32.89 mg/g，驗證實驗多糖得率為32.97 mg/g，與預(yù)測值的相對誤差為0.08 mg/g，說明該響應(yīng)面結(jié)果可靠。

蒲公英根粉處理前后多糖含量和DPPH自由基清除率情況如表5。由表5可知，蒲公英根經(jīng)過烘焙后多糖含量升高至(18.74±0.58)mg/g，這可能是因為烘焙使原料水分降低、孔結(jié)構(gòu)也發(fā)生了變化，有利于物質(zhì)的提取[13]。有報道顯示，高溫會導(dǎo)致纖維素和半纖維素糖苷鍵斷裂，生成大量脫水糖、酮類以及聚合度不同的糖類活性中間體[14]，其詳細(xì)的裂解機(jī)理仍有待進(jìn)一步研究。采用雙酶協(xié)同酶解后多糖得率為(32.97±0.13)mg/g，DPPH自由基清除率達(dá)92.31%±0.25%，酶解液抗氧化性顯著提高。

表5 酶解前后蒲公英多糖得率及DPPH自由基清除率Tab.5 Polysaccharide yield and DPPH free radical scavenging rate of dandelion polysaccharide before and after enzymatic hydrolysis

3 結(jié) 論

1)采用單酶法提取蒲公英根多糖的適宜條件為：料水比(g∶mL)1∶30 g/mL，纖維素酶酶解溫度50 ℃，添加量1.0 mL；木瓜蛋白酶酶解溫度60 ℃，添加量為2.0 mL。

2)纖維素酶和木瓜蛋白酶協(xié)同提取蒲公英根多糖提取率高于單酶法。采用Box-Behnken響應(yīng)面試驗建立了雙酶協(xié)同提取蒲公英根多糖的二次多項式回歸模型，影響多糖得率的工藝因素主次順序為酶解時間、酶解溫度、酶添加量。確定了適宜的酶解條件為：酶解溫度55 ℃，酶解時間1.9 h，纖維素酶液添加量0.99 mL(200 U/mL)，木瓜蛋白酶液添加量1.98 mL(200 U/mL)，料水比(g ∶mL)1∶30。

烘焙和酶解工藝可提高蒲公英根多糖得率和DPPH自由基清除率，二者存在正相關(guān)關(guān)系。