紅棗中γ-氨基丁酸的研究進(jìn)展

王麗玲，蒲云峰，李雁琴，侯旭杰,2,*

(1.塔里木大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；2.南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300)

棗(ZiziphusjujubaMill.)是鼠李科(Rhamnaceae)棗屬(Ziziphus)植物的成熟果實(shí)，是棗屬植物中栽培面積最廣和經(jīng)濟(jì)效益最高的一個(gè)栽培種[1]。棗樹(shù)原產(chǎn)于我國(guó)黃河中下游地區(qū)，是我國(guó)古老的特有果樹(shù)之一，有文字記載的栽培歷史至少有3 000多年[2]。由于棗樹(shù)具有耐鹽堿、抗旱、耐低溫、適應(yīng)性強(qiáng)等特征，已廣泛分布于亞洲、歐洲、美洲、非洲、大洋洲的國(guó)家和地區(qū)。目前，我國(guó)棗樹(shù)栽培面積近200萬(wàn)hm2，棗果產(chǎn)量已達(dá)824.1萬(wàn)t。紅棗不僅富含碳水化合物、氨基酸、有機(jī)酸、礦物質(zhì)及維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[3-4]，還含有多糖、cAMP、皂苷、生物堿、黃酮和三萜類(lèi)等功能成分[5]，具有抗氧化、降血壓、鎮(zhèn)靜安神、防治心腦血管疾病、改善記憶力、提高免疫力等功能[6-7]，是集藥、食、補(bǔ)三大功能為一體的藥食兼顧的天然保健食品。

1 紅棗改善睡眠功能

我國(guó)最早的中醫(yī)藥著作《神農(nóng)本草經(jīng)》中將紅棗作為藥材收錄，并記載其具有延長(zhǎng)壽命、補(bǔ)血、促進(jìn)睡眠等功效[8]?！侗静菥V目》中記載“大棗味甘，平。主治心腹邪氣，安中，養(yǎng)脾，補(bǔ)少氣少津，除煩悶等”，并且還記載了一條治療煩悶不眠的附方：“大棗十四枚，蔥白七根，加水三升煮成一升，一次服下”[9]。在2015版《中國(guó)藥典》中也記載“大棗具有補(bǔ)中益氣，養(yǎng)血安神，用于脾虛食少，乏力便溏，婦人臟躁”[10]。此外，《金匱要略》中的“甘麥大棗湯”和《傷寒論》中的“柴胡桂枝湯”的主要成分也是紅棗，它們?cè)趥鹘y(tǒng)中醫(yī)中常被用于治療抑郁、失眠等疾病[11]。雖然這些中醫(yī)藥著作是長(zhǎng)期醫(yī)療實(shí)踐的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，說(shuō)明紅棗具有促進(jìn)睡眠的功能，但紅棗促進(jìn)睡眠的分子機(jī)制仍然不清楚，難以用科學(xué)的理論去解釋紅棗的功效。

失眠是最為常見(jiàn)的睡眠障礙類(lèi)型，雖不屬于危重疾病，但會(huì)對(duì)正常生活和工作產(chǎn)生負(fù)面影響，并能加重或誘發(fā)心血管疾病。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，我國(guó)有45.4%的人曾經(jīng)歷了不同程度失眠[12]，并且失眠會(huì)隨著年齡增長(zhǎng)而增加[13]。由于傳統(tǒng)中藥多用紅棗治療以失眠為主的神經(jīng)衰弱癥，因此挖掘紅棗中具有治療失眠功效的化學(xué)成分并鑒定日益受到關(guān)注。目前，已有大量文獻(xiàn)報(bào)道了棗的化學(xué)成分及生理功能，早期的研究認(rèn)為皂苷是棗中具有鎮(zhèn)靜和促進(jìn)睡眠的有效成分，而韓國(guó)學(xué)者Won等[14]研究發(fā)現(xiàn)酸棗仁中黃酮和皂苷均具有鎮(zhèn)靜和促進(jìn)睡眠的功效，由于酸棗仁中黃酮含量比皂苷高，因此他認(rèn)為起主要作用的是黃酮。后來(lái)，Jiang等[13]比較了棗中黃酮、皂苷和多糖對(duì)小鼠的鎮(zhèn)靜催眠效果，發(fā)現(xiàn)皂苷的鎮(zhèn)靜催眠效果優(yōu)于黃酮，而多糖沒(méi)有鎮(zhèn)靜催眠作用。Cao等[15]研究了酸棗仁皂苷(jujubosides)對(duì)小鼠的鎮(zhèn)靜催眠效果，發(fā)現(xiàn)酸棗仁皂苷可能是一種重要的促進(jìn)睡眠的物質(zhì)。近期研究報(bào)道，Song等[16]以Sprague-Dawley小鼠為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)不僅酸棗仁皂苷A(jujuboside A)具有抗焦慮和鎮(zhèn)靜作用，而且它的代謝物(酸棗仁皂苷B和酸棗仁苷元)也具有相同功效。綜合來(lái)看，已有研究表明皂苷很可能是紅棗中具有鎮(zhèn)靜作用的有效成分。

Zhao等[17]采用高效液相色譜- 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detector,HPLC- ELSD)法分析9種酸棗仁樣品中的皂苷，它們的皂苷含量在0.232～0.824 mg/g。在筆者研究團(tuán)隊(duì)前期研究中，以駿棗為原料，通過(guò)溶劑提取和大孔樹(shù)脂純化，獲得富含皂苷的組分，其得率為0.019% (即相當(dāng)于0.19 mg/g)[18]。有研究報(bào)道，以劑量為40 mg/kg[13],25 mg/kg和9 mg/kg[16]的紅棗皂苷飼喂小鼠，能夠獲得鎮(zhèn)靜和促進(jìn)睡眠功效。如果按紅棗含0.8 mg/g皂苷和達(dá)到促進(jìn)睡眠功效的皂苷劑量9 mg/kg計(jì)算，一個(gè)體重80 kg的人每天至少需要吃0.9 kg紅棗才能達(dá)到促進(jìn)睡眠的功效，該消費(fèi)量遠(yuǎn)超過(guò)人們正常紅棗消費(fèi)量。因此，皂苷可能不是紅棗中促進(jìn)睡眠的主要活性物質(zhì)。

2 紅棗中γ-氨基丁酸的發(fā)現(xiàn)

在Song等[16]研究中發(fā)現(xiàn)酸棗仁皂苷B和酸棗仁苷元通過(guò)影響γ-氨基丁酸A受體(γ-aminobutyric acid A receptor,GABA(A))的表達(dá)與激活，從而產(chǎn)生促進(jìn)睡眠的功效。我們猜測(cè)GABA(A)的天然配體——γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)可能是紅棗中促進(jìn)睡眠的功效成分。

GABA是一種非蛋白氨基酸，它廣泛分布于微生物、動(dòng)物和植物體內(nèi)[19]。GABA被認(rèn)為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[20]，其作用是降低神經(jīng)元活性，防止神經(jīng)細(xì)胞過(guò)熱，從根本上鎮(zhèn)靜神經(jīng)，從而達(dá)到抗焦慮的效果[21]。此外，GABA還具有降血壓、改善記憶、抑制癌細(xì)胞增殖、增強(qiáng)免疫、減少失眠等功效[22-25]。近年來(lái)，一些研究分析了部分水果中的GABA質(zhì)量分?jǐn)?shù)，如紅毛丹鮮果710 μg/g[19]、草莓鮮果1 560～3 640 μg/g[26]、葡萄鮮果146 μg/g[27]、枇杷鮮果15.6～36.4 μg/g[28]、龍眼干果1 998 μg/g[29]、荔枝鮮果1 700～3 500 μg/g[30]和歐李干果140 μg/g[31]等。

鑒于此，我們采用氨基酸自動(dòng)分析儀法比較了含GABA的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品和紅棗樣品的色譜圖，見(jiàn)圖1，發(fā)現(xiàn)在21.32 min處，紅棗樣品和氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖中均出現(xiàn)了保留時(shí)間相同的峰，表明紅棗中含有GABA。此外，從紅棗的色譜圖可以看出，GABA的色譜峰比大多數(shù)游離氨基酸的色譜峰高，這說(shuō)明紅棗中不但含有GABA，而且其含量較高。

圖1 紅棗樣品和氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品的色譜Fig.1 Chromatograms of jujube sample and amino acid standard sample

在隨后的工作中，我們采用HPLC法分析了7個(gè)品種鮮棗中GABA含量，其干棗質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為150.31～333.37 μg/g，其中駿棗和駿優(yōu)2號(hào)中GABA含量最高，而冬棗最低[32]。Okada等[25]以20名更年期女性為研究對(duì)象，每日給予含26.4 mg GABA的脫脂大米胚芽，發(fā)現(xiàn)超過(guò)65%患者的失眠、睡眠障礙和抑郁癥狀得到明顯改善。如果參考這一劑量，每天攝取約200 g鮮棗，就可產(chǎn)生促進(jìn)睡眠的功效。

然而，在《本草綱目》中描述紅棗：“大的是棗，小的是棘；大棗即曬干的大棗”[9]。在《中國(guó)藥典》(2015版)也記載“大棗為鼠李科植物棗樹(shù)的干燥成熟果實(shí)。秋季果實(shí)成熟采收，曬干”[10]。這表明入藥是指大個(gè)干制紅棗，而不是鮮棗或干制小紅棗。駿棗是新疆主栽的紅棗品種之一，主要用于干制及加工，也是典型的大棗品種。因此，我們分析了采摘、干制和貯藏對(duì)駿棗中GABA含量的影響，發(fā)現(xiàn)2016年11月采摘的鮮棗(水分36.44%)GABA占干棗質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)628.74 μg/g，比2016年10月采摘的鮮棗(水分57.92%)GABA高了近1倍[32]。通常情況下，植物組織中GABA非常低，其新鮮組織中GABA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)只有3.12～624 μg/g，但當(dāng)遭受生物或非生物脅迫后，GABA含量會(huì)快速大量增加[32]。有研究報(bào)道，蔬菜和水果經(jīng)低溫脅迫處理，能夠增加其GABA含量。經(jīng)5 min的機(jī)械或冷刺激，大豆鮮葉中GABA含量增加到1～2 μmol/g，比處理前增加了20～40倍[34]；龍眼經(jīng)預(yù)冷處理后，其GABA含量增加了89%[30]；溫室栽培的菠菜經(jīng)14 d冷脅迫(4～7 ℃)處理后，其GABA含量顯著高于對(duì)照組[35]。經(jīng)查詢(xún)，2016年10月新疆阿拉爾氣溫在0～20 ℃范圍內(nèi)波動(dòng)，即夜間溫度常在0 ℃左右，而2016年10月下旬夜間溫度常在-5 ℃左右。這說(shuō)明駿棗采摘前可能因經(jīng)歷了自然冷脅迫，從而促進(jìn)了駿棗中GABA的積累。

經(jīng)55 ℃干燥24 h后，獲得水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20.03%的干制駿棗，導(dǎo)致GABA損失了13.50%；當(dāng)干制駿棗常溫貯藏6個(gè)月和12個(gè)月后，GABA分別減少了49.18%和77.44%[32]。Wang等[36]在制備GABA強(qiáng)化牛奶時(shí)，發(fā)現(xiàn)殺菌會(huì)導(dǎo)致GABA損失，升高溫度會(huì)導(dǎo)致GABA損失顯著增加，故認(rèn)為美拉德反應(yīng)是導(dǎo)致GABA損失的主要原因；此外，干果常溫貯藏過(guò)程中，也會(huì)發(fā)生美拉德反應(yīng)，從而導(dǎo)致游離氨基酸損失[37]。這說(shuō)明干制和貯藏過(guò)程中，可能會(huì)因美拉德反應(yīng)導(dǎo)致駿棗中GABA損失。

基于現(xiàn)有結(jié)果和分析，每天吃66 g鮮駿棗(水分36.44%)或61 g干駿棗(水分20.03%)，就能獲得足夠的GABA(26.4 mg)，從而達(dá)到促進(jìn)睡眠的功效。在《中國(guó)果樹(shù)志：棗卷》中記載：“駿棗平均果重22.9 g，最大果重36.1 g”[38]。即因此推斷每天吃3粒駿棗就可能產(chǎn)生促進(jìn)睡眠的功效。這與民間廣泛流傳的一句諺語(yǔ)“一日三棗，長(zhǎng)生不老”正好相符。但如果是每次吃常溫貯藏了6個(gè)月或12個(gè)月的干制駿棗，至少需要吃6粒棗或12粒。這也說(shuō)明減少加工貯藏過(guò)程中GABA損失，是維持紅棗功效的重要措施之一。因此，GABA作為紅棗中一種重要的功能成分，應(yīng)該也作為一個(gè)紅棗加工及功能評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)。

3 GABA的測(cè)定方法

目前，GABA檢測(cè)方法有氨基酸分析儀法、分光光度法、酶法、毛細(xì)管電泳法、薄層掃描法、高效液相色譜法等[39]。其中，分光光度法操作方法簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本低，但專(zhuān)一性差；氨基酸自動(dòng)分析儀法樣品前處理簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)單，但檢測(cè)費(fèi)用高、分析周期長(zhǎng)；酶法、毛細(xì)管電泳法等方法具有準(zhǔn)確度高、專(zhuān)一性強(qiáng)，但操作復(fù)雜、檢測(cè)成本高；鄰苯二甲醛(o-phthalaldehyde,OPA)柱前衍生HPLC法具有試劑價(jià)格便宜、衍生時(shí)間短、衍生條件簡(jiǎn)單、過(guò)量試劑不干擾測(cè)定等優(yōu)點(diǎn)，其應(yīng)用最為廣泛。然而，現(xiàn)有OPA柱前衍生HPLC法分析條件多照搬游離氨基酸的分析條件，這些方法存在流動(dòng)相組成復(fù)雜、流速高、系統(tǒng)壓力高、分析周期長(zhǎng)等問(wèn)題。如程威威等[40]分析發(fā)芽糙米GABA是以乙腈和25 nmol/L的乙酸鈉緩沖液為流動(dòng)相，流速1 mL/min，有機(jī)相初始體積分?jǐn)?shù)10%(乙腈)，梯度洗脫，單次分析周期45 min；吳琴燕等[41]分析紅茶GABA是以甲醇和10 mmol/L的磷酸鹽緩沖液為流動(dòng)相，流速1 mL/min，有機(jī)相初始體積分?jǐn)?shù)10%(甲醇)，梯度洗脫，單次分析周期45 min；Chen等[42]分析蘑菇子實(shí)體和菌絲中GABA是以甲醇、水和50 nmol/L的乙酸鈉緩沖液為流動(dòng)相，流速1.2 mL/min，有機(jī)相初始體積分?jǐn)?shù)17%(甲醇)，梯度洗脫，單次分析周期43 min。這些方法與文獻(xiàn)中采用OPA柱前衍生HPLC法測(cè)定氨基酸的分析條件相似[43]，均是參考了氨基酸的分析條件，并不是專(zhuān)門(mén)用于GABA的分析。因此，有必要從簡(jiǎn)化流動(dòng)相組成、提高初始有機(jī)相比例、降低流動(dòng)相流速等方面開(kāi)展OPA柱前衍生HPLC法分析GABA含量的條件優(yōu)化。

4 研究展望

在前期取樣分析的7種新鮮紅棗品種中均檢測(cè)到GABA，并且紅棗可能因自然冷脅迫積累了GABA[32]。如果攝入3粒富含GABA的紅棗，就能獲得足夠的GABA產(chǎn)生促進(jìn)睡眠的功效，說(shuō)明GABA可能是紅棗中重要的活性成分，下一步應(yīng)在前期研究的基礎(chǔ)上對(duì)該功能進(jìn)行驗(yàn)證。劉孟軍等[44]主編的《中國(guó)棗種質(zhì)資源》記錄了881個(gè)棗種質(zhì)資源和63個(gè)棗優(yōu)株，而目前僅分析了7個(gè)品種的鮮棗及1個(gè)品種的采摘、干制和貯藏樣品的GABA。因此，今后應(yīng)擴(kuò)大品種調(diào)查范圍，開(kāi)展采摘、干制和貯藏對(duì)紅棗GABA形成及變化規(guī)律研究，更好地認(rèn)識(shí)紅棗中的GABA及紅棗的功能價(jià)值。

目前，GABA的測(cè)定多采用OPA柱前衍生HPLC法，但現(xiàn)有方法多參考氨基酸測(cè)定的方法，存在流動(dòng)相組成復(fù)雜、流速高、系統(tǒng)壓力高、分析周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)。因此，開(kāi)展紅棗GABA研究，首先應(yīng)針對(duì)現(xiàn)有HPLC法的不足，通過(guò)對(duì)流動(dòng)相組成、流速、有機(jī)相初始比例等條件的優(yōu)化，建立一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的GABA檢測(cè)方法。