廣東省中山市庫蠓形態(tài)與分子鑒定

葉雅芳，劉德星，李婷婷，邱德義，劉環(huán)宇

蠓科(Ceratopogonidae)是雙翅目(Diptera)中種類繁多、分布甚廣的體型較小的昆蟲，部分刺吸人畜血液的種類被稱為吸血蠓，其中庫蠓屬(Culicoides)是分布最廣、種類最多、與人畜關(guān)系最密切的吸血蠓之一。庫蠓全世界分布，約有1 400多種，在我國分布有347種[ 1-2]。庫蠓不但刺吸人畜血液引起蟲咬性皮炎和皮膚過敏性癥狀，而且還是奧柔普西病毒病(Oropouche virus，OROV)、藍舌病毒(Bluetongue virus, BTV)、施馬倫貝格病毒(Schmallenberg virus, SBV)、等多種人畜病原體的傳播媒介[3]。家畜流行病對畜牧業(yè)影響巨大，歐洲BTV和SBV的大暴發(fā)曾造成巨大的經(jīng)濟損失[4-5]。了解庫蠓的種類、分布、吸血特性及病原體攜帶率是有效預防控制疫病流行和傳播的關(guān)鍵，因此庫蠓的準確鑒定對于蠓傳疾病的研究和防控有著重要的意義。

由于雌蠓才具吸血習性，對疾病的傳播具有重要意義，因此雌蠓的分類鑒定尤其重要，但傳統(tǒng)形態(tài)學鑒定方法是根據(jù)成蟲外部形態(tài)特征以及雄蟲的尾器才能進行有效鑒定，而雌蟲、幼蟲或肢體殘缺的蟲體難以辯認，且蠓類中有效的形態(tài)鑒定特征極少，對近似種的分類鑒定十分困難，從而影響庫蠓地理分布及其傳播疾病的深入研究[6-7]。近年來，隨著研究人員對線粒體DNA的深度挖掘和廣泛應用，線粒體DNA已成為昆蟲物種分類和分子序列分析的一種有效分子標記，如線粒體COI基因和Cytb基因片段[8-12]。

中山市位于東經(jīng)113°9′2″至113°46′，北緯22°11′12″至22°46′35″，位于珠江三角洲中部偏南的西、北江下游出海處，處于北回歸線以南，熱帶北緣，光照充足，熱量豐富，氣候溫暖，冬季氣候變化緩和，地理條件和氣候條件均適合蠓類生長，且目前尚未見到學者系統(tǒng)開展中山市庫蠓的調(diào)查研究。本研究以臺灣蠛蠓Lasioheleataiwana、叢林鋏蠓Forcipomyiabessa、美島裸蠓Atrichopogonformosanus、彎曲阿蠓Alluaudomyiaflexuosa為外群，對2018年4月至2019年3月在中山市不同生境采集的庫蠓進行系統(tǒng)的形態(tài)學鑒定以及COI基因和Cytb基因序列分析，為研究我國庫蠓快速、準確的分類鑒定提供資料，也為進一步研究其種群分布、種群遺傳結(jié)構(gòu)及其傳播相關(guān)疾病的防控提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1庫蠓標本 本研究所用的104只庫蠓(13只雄蟲，91只雌蟲)為2018年4月至2019年3月采集于中山市不同生境(詳細信息見表1)。

表1 12種庫蠓的詳細信息

Tab.1 Information ofCulicoidesin this study

種名拉丁學名雄♂雌♀采集地GenBank序列號COICytb原野庫蠓Culicoides homotomus1♀6MK917544MK917648蘇島庫蠓Culicoides sumatrae1♀5MK917542MK917646異域庫蠓Culicoides peregrinus1♀4MK917543MK917647琉球庫蠓Culicoides actoni3♀4MK917539-917539MK917608-917610殘肢庫蠓Culicoides imicola2♀5MK896861,917442MK917545,917546連斑庫蠓Culicoides jacobsoni1♀4MK917538MK917607撫須庫蠓Culicoides palpifer1♂14♀4,5,7MK917477-917491MK917547-917561荒川庫蠓Culicoides arakawai9♂8♀1,3,6,7MK917494-917509MK917564-917580環(huán)斑庫蠓Culicoides circumscriptus1♂1♀2MK917492-917493MK917562,917563尖喙庫蠓Culicoides oxystoma10♀4MK917527-917537MK917597-917606霍飛庫蠓Culicoides huffi2♂14♀2,4,6,7MK917511-917527MK917581-917596似同庫蠓Culicoides similis35♀5,4,7MK917443-917477MK917622-917645

注：采集地1：居民區(qū)(康逸豪園)2：辦公區(qū)(中山海關(guān)中山六路院內(nèi))3：城中村(三溪村)4：市內(nèi)公園(紫馬嶺公園)5：城郊農(nóng)莊(一魚六味飯店，有家禽舍)6：林區(qū)(大尖山農(nóng)戶雞舍)7：城郊大學校園(獅頭山)

1.1.2主要試劑 血液和組織DNA提取試劑盒(編號：Q5523)購自天根生化科技有限公司，dNTP、rTaq DNA聚合酶等購于大連寶生物有限公司，引物由Invitrogen公司合成。引物序列：

COI基因擴增引物：

LCO1490(5′-GGTCAACAAAATCATAAA-GATATTGG-3′)；

HCO2198(5′-TGATTTTTTGGTCACCCTGGAAGTTTTA-3′)[13]

Cytb基因擴增引物：

Cytb424-449(5′-GCRTAWGCRAAWARRA-ARTAYCAYTCWGG-3′)；

Cytb876-847(5′-ATYTGWCCYCAWGGWA-RWACRTAWCC-3′)[14]

1.2 方 法

1.2.1庫蠓采集 根據(jù)庫蠓的生活習性，選擇燈誘法(功夫小帥，24 W，12V，波長365 nm，武漢市吉星環(huán)保科技有限責任公司)。在7種不同的生態(tài)環(huán)境中居民區(qū)(康逸豪園)、辦公區(qū)(中山海關(guān)中山六路院內(nèi))、城中村(三溪村)、市內(nèi)公園(紫馬嶺公園)、城郊農(nóng)莊(一魚六味飯店，有家禽舍)、林區(qū)(大尖山農(nóng)戶雞舍)、城郊大學校園(獅頭山)布置采樣點進行蠓蟲收集，每月的上下旬各采集一次。在所選的生境內(nèi)，選擇遠離光源干擾和避風的室外場所作為掛燈點，每個采樣點掛誘蟲燈3盞，光源離地1.5 m，于日落前1 h接通電源，連續(xù)燈誘3 h后取出集蠓袋，做好標記，蠓連同集蠓袋放置于-20℃冰箱冷凍致死。

1.2.2庫蠓基因組DNA提取 參照文獻的方法[15]，挑選形態(tài)完整的庫蠓，切下翅置于玻片上，把剩余部分浸泡在220 μL含有1%蛋白酶K的組織消化緩沖液(天根公司DNA提取試劑盒)中，56 ℃消化過夜，按試劑盒操作說明從消化液中提取庫蠓基因組DNA，提取的DNA置于4 ℃暫存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3樣本處理和形態(tài)學鑒定 對消化后的庫蠓進行清洗、逐步脫水、切下頭部和腹部、將頭部的觸須、觸角，腹部、足擺正后，滴上加拿大樹膠(加丁香油)，重新調(diào)整擺正，封片，最后制成玻片標本[16]。待研究庫蠓根據(jù)外部形態(tài)特征按照《中國蠓科昆蟲》[2]，顯微鏡鏡檢鑒定種類，取一側(cè)翅進行拍照。

1.2.4PCR的擴增 分別采用COI基因和Cytb基因通用引物[13-14]進行 PCR 擴增。PCR擴增體系如下：DNA模板3 μL，上、下游引物(10 μL/L)各1 μL/L，10×PCR Buffer 5 μL，dNTP 2 μL，rTaq酶0.5 μL，加ddH2O補至50 μL。PCR反應條件為94 ℃預變性5 min，94 ℃變性45 s，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)，最后再72 ℃延伸10 min。

1.2.5序列測定及分析 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增情況，并將擴增產(chǎn)物送至上海立菲公司雙向測序，測序引物同擴增引物。使用DNAMAN軟件，將去除兩端引物后的正向序列在GenBank數(shù)據(jù)庫進行比對鑒定物種。

1.2.6COI和Cytb序列分析 將庫蠓104條COI序列和Cytb序列上傳至GenBank，每條序列及其憑證標本詳細信息見表1，并在GenBank中引入85種庫蠓656條序列長度658 bp以上的COI序列和2種庫蠓234條序列長度300 bp以上的Cytb序列(已剔除未明確到種和同一蠓種的序列差異>2%的序列)，采用自測的臺灣蠛蠓、叢林鋏蠓、美島裸蠓、彎曲阿蠓8條COI序列和8條Cytb序列分別作為外群，使用MEGA6.0軟件將以上所得的COI序列和Cytb序列，截取出完全重合的序列進行分析，基于Kimura2-parameter 模型，鄰接法構(gòu)建NJ樹(自檢值設(shè)置為1 000次)。

2 結(jié) 果

2.1主要形態(tài)特征描述 根據(jù)104只庫蠓頭部、翅、腹部、尾器的形態(tài)描述進行檢索鑒定標本，鑒定結(jié)果為原野庫蠓(1♀)、蘇島庫蠓(1♀)、異域庫蠓(1♀)、琉球庫蠓(3♀)、殘肢庫蠓(2♀)、連斑庫蠓(1♀)、撫須庫蠓(1♂，14♀)、荒川庫蠓(9♂，8♀)、環(huán)斑庫蠓(1♂，1♀)、尖喙庫蠓(10♀)、霍飛庫蠓(2♂，14♀)、似同庫蠓(35♀)12種庫蠓(表2、圖1)。由表2、圖1可知：1)頭部：該12種庫蠓頭部形態(tài)特征(復眼是否連接、眼面間柔毛、觸須第3節(jié)感覺器窩)之間不完全存在差異，不能作為鑒別特征。2)翅：該12種庫蠓翅特征(翅面淡、暗斑是否明顯、翅臀室淡斑數(shù)目、徑中淡斑是否覆蓋第1 徑室基部和徑中橫脈、翅面大毛所在位置、徑5 室淡斑數(shù)目、徑5 室淡斑位置)和一側(cè)翅圖之間均存在差異，可作為鑒別的特征。3)腹部：庫蠓雌蟲腹部特征(受精囊數(shù)目、受精囊形態(tài))之間不完全存在差異，可知庫蠓雌蟲腹部特征不能作為鑒別的特征。4)尾器：該12種庫蠓雄蟲尾器形態(tài)(陽莖中葉形態(tài)、陽莖中葉側(cè)突形態(tài))之間存在很大的差異，因此雄蠓可以根據(jù)其尾器形態(tài)進行有效鑒定。

圖1 12種庫蠓一側(cè)翅圖Fig.1 Wing of Culicoides

2.2 COI序列分析

2.2.1COI序列構(gòu)成 104只12種庫蠓COI的長度均為658 bp。撫須庫蠓、環(huán)斑庫蠓、似同庫蠓、蘇島庫蠓4種庫蠓COI序列在GenBank中未找到相應序列，為本研究首次獲得。從GenBank數(shù)據(jù)庫中引用85種庫蠓COI序列656條，采用自測的其它蠓屬COI序列有臺灣蠛蠓2條、叢林鋏蠓3條、美島裸蠓2條、彎曲阿蠓1條。將以上所得的COI序列對齊，截取出完全重合的序列后，共獲得93種庫蠓768條長度為612 bpCOI序列。

2.2.2COI序列同源性比對 將本研究所獲12種庫蠓COI序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行同源比對，原野庫蠓、異域庫蠓、琉球庫蠓、殘肢庫蠓、連斑庫蠓、荒川庫蠓、尖喙庫蠓、霍飛庫蠓的COI序列相似度皆大于98%，說明該8種庫蠓的形態(tài)鑒定結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中的COI基因序列比對結(jié)果一致。撫須庫蠓、蘇島庫蠓在GenBank中均未收錄COI序列，而似同庫蠓、環(huán)斑庫蠓與GenBank數(shù)據(jù)庫中的COI序列相似度小于98%。

2.2.3COI聚類分析 基于COI聚類分析表明(圖2)，不同種類蠓間無交叉，且相同種類蠓的不同個體均聚在同一分支下，支持率達到99%以上，僅Bakhoum鑒定的似同庫蠓[17]雖聚在同一分支但支持度僅90%。庫蠓屬與蠛蠓屬、鋏蠓屬、裸蠓屬、阿蠓屬混在不同支序內(nèi)，但因支持度低(<20%)，無法說明其親緣關(guān)系，符合關(guān)于COI基因不適合進行系統(tǒng)進化關(guān)系分析的結(jié)論[18]，對上述4屬并入庫蠓屬的現(xiàn)象，在其他昆蟲中也有類似的結(jié)果[19]。蘇島庫蠓與其近似種無害庫蠓序列相似度95.24%，低于98%，該兩庫蠓間無交叉，說明COI基因在不同蠓種間有明顯差異，可以用于鑒定和區(qū)分近似蠓種。撫須庫蠓、霍飛庫蠓、荒川庫蠓、環(huán)斑庫蠓該4種庫蠓雌蟲與其雄蟲形態(tài)特征之間存在差異，而雌蟲COI基因序列與雄蟲序列聚在同一分支下且相似度98%以上，說明同一種的雌雄庫蠓之間COI基因的差異小于種間差異，可以用于雌蟲的種類鑒定。

2.3 Cytb序列分析

2.3.1Cytb序列構(gòu)成 104只12種庫蠓Cytb的長度均為394 bp。原野庫蠓、蘇島庫蠓、異域庫蠓、琉球庫蠓、殘肢庫蠓、連斑庫蠓、撫須庫蠓、荒川庫蠓、環(huán)斑庫蠓、尖喙庫蠓、霍飛庫蠓、似同庫蠓10種庫蠓Cytb序列在GenBank中未找到相應序列，為本研究首次獲得。從GenBank中引用2種庫蠓荒川庫蠓、殘肢庫蠓Cytb序列248條。采用自測的其它蠓屬Cytb序列有臺灣蠛蠓2條、叢林鋏蠓3條、美島裸蠓2條、彎曲阿蠓1條。將以上所得的Cytb序列對齊，截取出完全重合的序列后，共獲得16種庫蠓360條長度321 bpCytb序列用于分析。

2.3.2Cytb序列同源性比對 將本研究12種庫蠓的全部Cytb序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行同源比對，荒川庫蠓、殘肢庫蠓Cytb序列相似度皆大于98%，說明該2種庫蠓的形態(tài)鑒定結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中的Cytb基因序列比對結(jié)果一致。其余10種庫蠓原野庫蠓、蘇島庫蠓、異域庫蠓、琉球庫蠓、殘肢庫蠓、連斑庫蠓、撫須庫蠓、荒川庫蠓、環(huán)斑庫蠓、尖喙庫蠓、霍飛庫蠓、似同庫蠓在GenBank中均未收錄有Cytb基因序列。

注：♂.雄性庫蠓序列；♀.雌性庫蠓序列；★.GenBank引用的序列。進化樹等邊三角形?的底邊長度代表每個物種含有個體數(shù)目的多少圖2 基于COI構(gòu)建的NJ樹(Kimura 2-parameter模型)Fig.2 Neighbor-jointing tree based on the mitohondrial gene COI sequence

2.3.3Cytb聚類分析 基于Cytb聚類分析表明(圖3)，不同種類蠓間無交叉，且相同種類蠓的不同個體均聚在同一分支下，支持率均達到99%，說明Cytb基因在不同蠓種間有明顯差異，可以用于鑒定和區(qū)分蠓種。庫蠓屬與蠛蠓屬、鋏蠓屬、裸蠓屬、阿蠓屬混在不同支序內(nèi)，但因支持度低(<10%)，無法說明其親緣關(guān)系，說明Cytb不適合進行系統(tǒng)進化關(guān)系分析，對上述4屬并入庫蠓屬的現(xiàn)象，與本研究COI聚類分析的研究結(jié)果一致。撫須庫蠓、霍飛庫蠓、荒川庫蠓、環(huán)斑庫蠓雌蟲Cytb基因序列與雄蟲序列聚在同一分支下且相似度98%以上，說明同一種的雌雄庫蠓之間Cytb基因的差異小于種間的差異，可以用于雌蟲的種類鑒定。

注：♂.雄性庫蠓序列；♀.雌性庫蠓序列；★.GenBank引用的序列。進化樹等邊三角形?的底邊長度代表每個物種含有個體數(shù)目的多少圖3 基于Cytb構(gòu)建的NJ樹(Kimura 2-parameter模型)Fig.3 Neighbor-jointing tree based on the mitohondrial gene Cytb sequence

3 討 論

本研究在中山市不同生境采集的撫須庫蠓、霍飛庫蠓、荒川庫蠓、環(huán)斑庫蠓雄蟲可以根據(jù)其尾器的形態(tài)特征進行有效鑒定，而12種庫蠓雌蟲僅可從翅部特征的細微差異進行鑒定和區(qū)別，特別是近似種，如蘇島庫蠓與無害庫蠓。線粒體DNA(mtDNA)具有多拷貝、分子量小、母系遺傳、突變速度適中等特點，能準確鑒別物種[22]。目前，已有多個研究表明在對蚤目、同翅目和雙翅目(搖蚊科、麻蠅科)等昆蟲進行序列分析時聯(lián)合形態(tài)學特征以及線粒體DNA(mtDNA)綜合分析得到的結(jié)果比單獨使用線粒體COI基因分析得到的結(jié)果更為理想[23-25]。因此，本研究基于形態(tài)學特征和COI、Cytb分子標記數(shù)據(jù)綜合分析對12種庫蠓進行鑒定，驗證了線粒體COI和Cytb基因序列可作為庫蠓的分類鑒定和序列聚類分析的有效分子標記，可得到更為準確的種類鑒定和序列分析結(jié)果。

庫蠓雄蟲可以根據(jù)其尾器特征進行有效鑒定，而庫蠓雌蟲有效的形態(tài)鑒定特征極少，尤其大多近似種僅可從翅特征的細微差異進行鑒定和區(qū)別，例如蘇島庫蠓與無害庫蠓是近似種，許多形態(tài)特征相似，只能根據(jù)翅特征進行鑒別：蘇島庫蠓翅基淡斑大，向后延伸至臀室基部翅緣，即翅基淡斑與臀室基部淡斑融合，臀室只有2個淡斑；而無害庫蠓翅基淡斑與臀室基部淡斑分離，臀室均有3個淡斑，其余形態(tài)特征幾乎無異[15]，但該2種庫蠓COI序列相似度95.24%，低于98%，說明COI基因在近似蠓種間有明顯差異，這與COI基因用于其它昆蟲近似種的研究結(jié)果相似[26-28]，可以用于鑒定和區(qū)分近似蠓種，所以該12種庫蠓形態(tài)學鑒定的結(jié)果需要分子鑒定加以補充。本研究組的似同庫蠓形態(tài)特征與《中國蠓科昆蟲》[2]的似同庫蠓相一致，而Bakhoum鑒定的似同庫蠓[17]與本研究的似同庫蠓翅特征不一致，COI序列相似度為88.18%，低于98%；Harrup鑒定的似同庫蠓[20]與本研究的似同庫蠓COI序列相似度為93.15%，低于98%，且在基于COI構(gòu)建的NJ樹中，Bakhoum鑒定的似同庫蠓[17]聚在同一分支的支持度僅90%，其個體間COI序列差異較大，說明Bakhoum[17]、Harrup[20]鑒定的似同庫蠓可能不準確；同理，本研究組的環(huán)斑庫蠓形態(tài)特征與《中國蠓科昆蟲》[2]的環(huán)斑庫蠓相一致，而Slama D鑒定的環(huán)斑庫蠓[21]形態(tài)特征與本研究的環(huán)斑庫蠓不一致，說明Slama D鑒定的環(huán)斑庫蠓[21]可能不準確，因此上傳基因序列到數(shù)據(jù)庫前，應該盡量通過形態(tài)學的反復鑒定和確認。在構(gòu)建的2個基因NJ樹中，雖然不同蠓屬聚在同一大支，但不同蠓種間無交叉，且相同蠓種的不同個體均聚在同一分支下，支持率達到99%以上，說明COI和Cytb基因只適于蠓蟲種級的鑒定。撫須庫蠓、霍飛庫蠓、荒川庫蠓、環(huán)斑庫蠓雌蟲COI基因、Cytb基因序列與雄蟲序列聚在同一分支下且相似度98%以上，說明同一種的雌雄庫蠓之間COI基因、Cytb基因的差異小于種間的差異，這與COI基因、Cytb基因用于其它昆蟲的研究結(jié)果相似[29-32]，可以用于雌蟲的種類鑒定。

線粒體COI基因和Cytb基因分子標記已應用于多種醫(yī)學昆蟲近似種的鑒定與區(qū)別[26-28]，由于分子標記不受性別、早期階段的形態(tài)結(jié)構(gòu)、肢體殘缺的蟲體、鑒定者專業(yè)性的的影響[33]，形態(tài)學與分子學相結(jié)合的方法鑒別庫蠓，可以相互驗證，使結(jié)果更為準確，為庫蠓的鑒別提供了準確高效的方法。

利益沖突：無