云南省梁河縣鼠疫疫源地野外鼠形動物嗜吞噬細(xì)胞無形體感染調(diào)查

張宏澤，朱俊潔，俞 丹，洪汝丹，洪 梅，劉正祥，栗冬梅，尹家祥

人粒細(xì)胞無形體病是由嗜吞噬細(xì)胞無形體(Anaplasmaphagocytophilum，AP)感染所引起的一種人獸共患病，是常見的蜱傳自然疫源性疾病[1-3]。自2006年我國安徽省發(fā)現(xiàn)首例HGA患者以來，東北、華北、華南、華中、西北及西南等多地均有HGA患者或疑似患者的報(bào)道[4-6]。云南省由于其獨(dú)特的地形地貌，成為我國多種蜱傳疾病的流行區(qū)域。梁河縣地處云南省西部橫斷山脈西南端，介于東經(jīng)98°06′～98°31′、北緯24°31′～24°58′之間，境內(nèi)海拔高差達(dá)1 800 m，有中山、低山、火山錐、臺階地、河谷平壩5種地貌類型，是云南家鼠鼠疫自然疫源地區(qū)域，但尚不清楚該疫源地鼠形動物是否有無形體感染。本研究采用巢式PCR對采集自梁河縣的野外鼠形動物肝脾樣本進(jìn)行擴(kuò)增并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行基因序列檢測，對陽性樣本基因序列進(jìn)行對比分析，旨在了解云南省梁河縣鼠疫疫源地野外鼠形動物嗜吞噬細(xì)胞無形體自然感染情況。

1 材料與方法

1.1動物樣本采集及抽樣 本研究于2015年12月至2016年10月分春、夏、秋、冬四季于梁河縣按海拔高度選取了Ⅰ海拔梯度(1 000～1 200 m)、Ⅱ海拔梯度(1 200～1 400 m)、Ⅲ海拔梯度(1 400～1 600 m)及Ⅳ海拔梯度(1 600 m以上)4個(gè)海拔梯度，每個(gè)海拔梯度段選取2～3個(gè)研究樣點(diǎn)進(jìn)行野外捕鼠并記錄生境信息。將捕獲的665只野外鼠形動物帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行鼠種鑒定，無菌條件下取肝、脾臟器樣本，置于-40 ℃保存?zhèn)溆?。?yīng)用單純隨機(jī)抽樣方法抽取407份動物標(biāo)本(數(shù)量少于或等于10只的鼠種全部納入)進(jìn)行嗜吞噬細(xì)胞無形體檢測分析。

1.2 試劑與設(shè)備

1.2.1分子生物學(xué)檢測 磁珠法微量細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒(AU19014)與核酸染料Gelview(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)；DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)和 Nuclease-Free Water(Thermo)；DNA Marker(Biomed)；Agarose(Coolaber)。

1.2.2儀器設(shè)備 全自動核酸提取儀AU1001(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)；核酸濃度測定儀NanoDrop-1000(Thremo)；QuantStudio3 PCR儀(Thremo)；臺式高速離心機(jī)(AndyBio)；G:Box凝膠成像系統(tǒng)(Syngene)。

1.3 方 法

1.3.1DNA提取 所有樣本DNA按照磁珠法微量細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑(AU19014)說明書進(jìn)行操作。

1.3.2引物 根據(jù)參考文獻(xiàn)[7]，選取無形體屬16S rRNA基因巢式PCR通用外側(cè)引物out1：5′-TTG AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGA ACG-3′；out2：5′-CAC CTC TAC ACT AGG AAT TCC GCT ATC-3′；與嗜吞噬細(xì)胞無形體特異性引物HGA1：5′-GTC GAA CGG ATT ATT CTT TAT AGC TTG-3′；HGA2：5′-TAT AGG TAC CGT CAT TAT CTT CCC TAC-3′，由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.3.3PCR檢測 先用外側(cè)引物out1和out2對所提取的樣本DNA進(jìn)行擴(kuò)增，PCR第1輪擴(kuò)增反應(yīng)體系為PremixTaq酶12.5 μL、上下游引物各0.5 μL (10 μmol/L)、DNA模板5 μL，加無菌去離子水補(bǔ)至總體積25 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min后，以95 ℃變性30 s、55 ℃退火40 s、72 ℃延伸50 s、循環(huán)35次，72 ℃總延伸7 min。第2輪反應(yīng)使用嗜吞噬細(xì)胞無形體特異性引物 HGA1和HGA2 進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為PremixTaq酶15 μL、上下游引物各0.6 μL (10 umol/L)、取第1輪擴(kuò)增產(chǎn)物0.5 μL 作為模板，加無菌去離子水至總體積30 μL。反應(yīng)條件同第1輪。本實(shí)驗(yàn)將首份PCR擴(kuò)增陽性產(chǎn)物送至上海生工生物技術(shù)公司測序；通過比對序列將其確定為嗜吞噬細(xì)胞無形體，并將此樣本擴(kuò)增產(chǎn)物作為陽性對照。陰性對照模板為無菌去離子水；為避免污染，配置反應(yīng)體系、PCR擴(kuò)增及凝膠電泳均在不同實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，陽性對照僅用于電泳檢測目的條帶位置比較。

1.3.4電泳檢測 制備1.5%瓊脂糖凝膠后吸取第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物3 μL 進(jìn)行120 V、45 min電泳；使用凝膠成像系統(tǒng)對膠體成像，并拍照保存；選取單一條帶 PCR 擴(kuò)增陽性產(chǎn)物直接送上海生工生物技術(shù)公司測序。

1.3.5PCR陽性產(chǎn)物測序及序列分析 通過美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)站點(diǎn)，利用BLAST“Sequence Similarity Searching”工具，與GenBank中的無形體基因序列進(jìn)行相似性比較，序列分析采用DNAStar、MEGA7.0等軟件。

1.3.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用R軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用Chi-square Test、Fisher’s Exact Test比較不同海拔梯度、性別、生境及季節(jié)間野外鼠形動物嗜吞噬細(xì)胞無形體感染情況，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1野外鼠形動物感染情況 本次調(diào)查共捕獲野外鼠形動物3目5科12屬17種665只，共抽取野外鼠形動物3目5科12屬17種407只進(jìn)行嗜吞噬細(xì)胞無形體檢測，總陽性率為3.19%(13/407)；其中有3種野外鼠形動物感染嗜吞噬細(xì)胞無形體，即黃胸鼠(Rattustanezumi)、斯氏家鼠(Rattussteini)和大足鼠(Rattusnitidus)，其感染率分別為6%(6/100)、4.94%(4/81)和21.43%(3/14)(見表1)。

對13份野外鼠形動物陽性樣本巢式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，均得到389 bp左右的目的片段(見圖1)，符合預(yù)計(jì)目標(biāo)條帶。

2.2不同海拔梯度、性別、生境及季節(jié)間嗜吞噬細(xì)胞無形體感染情況 隨著海拔梯度升高，野外鼠形動物感染嗜吞噬細(xì)胞無形體有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.219)；不同性別野外鼠形動物感染率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=0.441，P=0.506)；本次檢測的所有陽性樣本均采集自林地，但不同生境間野外鼠形動物感染率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=0.386，P=0.534)；不同季節(jié)野外鼠形動物感染率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.044)，其中春季感染率最高7.53%(7/93)(表2)。

表1 不同種類鼠形動物感染嗜吞噬細(xì)胞無形體情況

Tab.1 Infection rate ofAnaplasmaphagocytophilumin different mammals species

鼠形動物種類檢測樣本數(shù)陽性數(shù)感染率(%)黃胸鼠10066.00 斯氏家鼠8144.94 錫金小鼠4400 針毛鼠4100 臭鼩鼱3200 毛猬2800 短尾鼩2400大足鼠14321.43青毛鼠900 滇絨鼠900 大絨鼠700灰麝鼩600 樹鼩400 長尾大麝鼩300 白腹鼠200 社鼠200 板齒鼠100 合計(jì)407133.19

2.316S rRNA基因序列同源性分析 將13份陽性樣本的16S rRNA基因序列的測序結(jié)果經(jīng)Megalign對比分析，顯示本次調(diào)查所有樣本16S rRNA基因序列完全一致。使用DNAstar對所測得的序列拼接后進(jìn)行BLAST，通過與GenBank中收錄的部分嗜吞噬細(xì)胞無形體相對應(yīng)的片段進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)本次調(diào)查所得到的基因序列與來自中國東北(GQ412339.1)、俄羅斯(HM366583.1)、浙江(HM439430.1)、吉林(DQ449948.1)、加拿大(HG916766.1)、云南(MF134887.1)及安徽(EF211110.2)的嗜吞噬細(xì)胞無形體16S rRNA基因序列同源性為100%；與日本(AB196721.1)、韓國(AF70699.1)及湖北(HM538192.1)的無形體序列同源性分別為98.6%、98.6%及97.9%；而與意大利(EF520690.1)和韓國(GU556626.1)的無形體序列同源性分別為97.6%和96.5%(見圖2)。

注：M為DNA marker ；PC為陽性對照 ；NC為陰性對照；BC為空白對照；037-393號為陽性擴(kuò)增產(chǎn)物。圖1 嗜吞噬細(xì)胞無形體巢式PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Result of nest PCR for Anaplasma phagocytophilum

表2 不同海拔梯度、性別、生境及季節(jié)間嗜吞噬細(xì)胞無形體感染情況

Tab.2 Comparison of the infection rate ofAnaplasmaphagocytophilumin different elevation gradients, gender,habitat and seasons

因素檢測樣本數(shù)陽性樣本數(shù)感染率(%)χ2值P值海拔/m0.219① 1 000～1 20011765.13 1 200～1 40011954.2 1 400～1 60011021.82 ≥1 6006100性別②0.4410.506 雌性19152.62 雄性21183.79生境0.3860.534 林地372133.49 耕地林地交界3500季節(jié)0.044① 春季9377.53 夏季7811.28 秋季12010.83 冬季11643.45

注：①Fisher’s Exact Test；②5只鼠形動物未鑒定出性別

圖2 嗜吞噬細(xì)胞無形體16S rRNA序列的同源性比較Fig.2 Homology analysis for 16S rRNA gene of Anaplasma phagocytophilum

注：△的樣本為本次檢測的梁河樣本圖3 嗜吞噬無形體16S rRNA基因序列進(jìn)化分析Fig.3 Phylogentic tree based on 16S rRNA gene of Anaplasma phagocytophilum

2.416S rRNA基因序列進(jìn)化分析 本次調(diào)查得到的13份陽性樣本均檢測到的389 bp左右的16S rRNA基因序列，并與GenBank收錄的部分無形體16S rRNA基因序列一起采用MEGA7.0軟件進(jìn)行進(jìn)化分析，進(jìn)化分析采用Maximum Likelihood方法推測(見圖3)。進(jìn)化分析表明本次調(diào)查所有陽性樣本基因序列與中國東北(GQ412339.1)、俄羅斯(HM366583.1)、浙江(HM439430.1)、吉林(DQ449948.1)、加拿大(HG916766.1)云南(MF134887.1)、安徽(EF211110.2)等地不同宿主動物(如鼠、蜱等)感染無形體株聚在同一分支。與日本(AB196721.1)及韓國(AF70699.1)的嗜吞噬細(xì)胞無形體株具有較高的同源性，同屬一個(gè)大分支，但相距較遠(yuǎn)。而湖北(HM538192.1)邊緣無形體(A.marginale)、韓國(GU556626.1)牛無形體(A.bovis)、意大利(EF520690.1)中央無形體(A.centrale)則處于外圍。

3 討 論

嗜吞噬細(xì)胞無形體是一種經(jīng)蜱叮咬傳播的細(xì)胞胞漿內(nèi)專性寄生菌，能侵染人末梢血中性粒細(xì)胞引起人粒細(xì)胞無形體病，其主要的傳播媒介為全溝硬蜱(Ixodespersulcatus)，可感染野鼠、狗、羊、馬及牛等宿主動物[8-11]。本次調(diào)查檢測嗜吞噬細(xì)胞無形體16S rRNA基因序列是由于該基因序列的高變區(qū)具有細(xì)菌屬、種的特征，尤其是為發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)專性寄生菌提供了迅速精準(zhǔn)的方法。本次實(shí)驗(yàn)采用巢氏PCR方法對云南省梁河縣野外鼠形動物進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)野外鼠形動物嗜吞噬細(xì)胞無形體感染率為3.19%，提示梁河縣為人粒細(xì)胞無形體病的自然疫源地。隨著海拔梯度升高，野外鼠形動物感染嗜吞噬細(xì)胞無形體有降低趨勢，雖然沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但這一結(jié)果與我們前期在海拔較高的劍川縣(2250 m以上)和玉龍縣(2 400 m以上)捕獲到的野外鼠形動物嗜吞噬細(xì)胞無形體感染率較低相一致(劍川縣感染率為0，玉龍縣感染率為0.36%)，這也可能與生境特點(diǎn)、鼠種動物構(gòu)成情況等有關(guān)，有待進(jìn)一步深入研究。野外鼠形動物不同的性別及其棲息環(huán)境間嗜吞噬細(xì)胞無形體感染率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明這兩個(gè)因素與野外鼠形動物感染嗜吞噬細(xì)胞無形體無關(guān)；不同季節(jié)野外鼠形動物嗜吞噬細(xì)胞無形體感染率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但冬春季感染率較高而夏秋季較低，這一現(xiàn)象與媒介蜱的季節(jié)性消長并不一致，需進(jìn)一步調(diào)查研究闡釋該現(xiàn)象出現(xiàn)的原因。

經(jīng)序列同源性分析，本次實(shí)驗(yàn)檢出的13份嗜吞噬細(xì)胞無形體16S rRNA基因序列與我國云南、浙江、吉林及俄羅斯、加拿大等地檢出的7個(gè)相對應(yīng)序列同源性為100%，確證本次研究測得的序列為嗜吞噬細(xì)胞無形體16S rRNA基因序列。通過與日本等國家進(jìn)行嗜吞噬細(xì)胞無形體16S rRNA基因序列同源性比較發(fā)現(xiàn)所測序列與日本(AB196721.1)及韓國(AF70699.1)嗜吞噬細(xì)胞無形體基因序列具有較高的同源性，但不同地區(qū)嗜吞噬細(xì)胞無形體16S rRNA基因序列存在小幅度的變異，這可能是由于不同地區(qū)嗜吞噬細(xì)胞無形體宿主動物或媒介生物不同所致。

進(jìn)化分析顯示所測序列與安徽省某醫(yī)院感染嗜吞噬細(xì)胞無形體患者血中檢測的序列(EF211110)屬同一分支，提示梁河縣境內(nèi)嗜吞噬細(xì)胞無形體存在對人致病的可能[4]。此外，無形體屬其它成員湖北(HM538192.1)邊緣無形體(A.marginale)及意大利(EF520690.1)中央無形體(A.centrale)雖與嗜吞噬細(xì)胞無形體相距較遠(yuǎn)，但同屬一個(gè)大分支，說明嗜吞噬細(xì)胞無形體與邊緣無形體(A.marginale)及中央無形體(A.centrale)親緣關(guān)系較近。

本次調(diào)查表明云南省梁河縣野外鼠形動物存在嗜吞噬細(xì)胞無形體低度感染，但尚不清楚無形體株是否能對人類致病以及與鼠疫發(fā)生和流行是否有關(guān)系，有必要進(jìn)行深入研究。

(大理大學(xué)魏兆飛、趙秋芳、徐丹丹、周蕓、王夢迪參與了現(xiàn)場標(biāo)本采集工作，在此表示感謝！)

利益沖突：無