鐵膜和磷作用對水稻根尖細(xì)胞壁耐鋁性的影響

王智怡，李文靜，邢承華，李 方，王亞超，陳超發(fā)，蔡妙珍*

（1.浙江師范大學(xué)地理與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 金華321004；2.金華職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院，浙江 金華321007）

鋁毒是酸性土壤中限制作物生長最普遍的非生物因素之一[1]。作物在長期的進(jìn)化過程中，逐漸形成了如分泌螯合物（有機(jī)酸、酚類和黏液）[2]或磷酸根[3]、細(xì)胞壁固定[4]、根系pH 提高[5]、根尖邊緣細(xì)胞[6]以及根表鐵膜[7]等耐鋁能力以適應(yīng)鋁毒環(huán)境。根尖細(xì)胞壁作為植物響應(yīng)鋁毒的第一道屏障，既是鋁毒害的最初位點(diǎn)，也是鋁（Al）積累的主要部位，其在植物耐鋁毒中的作用倍受關(guān)注[8-9]。細(xì)胞壁主要由多糖（果膠、半纖維素）組成，其中果膠的基本結(jié)構(gòu)是聚半乳糖醛酸，其上大量帶負(fù)電荷的羧基是Al 結(jié)合的主要位點(diǎn)[10]?，F(xiàn)有的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，豌豆（Pisumsativum）[11]、紫花苜蓿（Medicago sativa）[12]和水稻（Oryza sativaL.）[13]根尖的細(xì)胞壁果膠含量與根尖Al 積累顯著正相關(guān)。Yang 等[5]指出擬南芥（Arabidopsis thaliana）細(xì)胞壁結(jié)合的Al 有75%分布在半纖維素，20%分布在果膠?？梢?，植物細(xì)胞壁的多糖組分對根系上Al 的積累起到了至關(guān)重要的作用。

淹水環(huán)境中水生植物根系具有特殊的通氣組織能將地上部的氧氣運(yùn)輸至根系，釋放的氧氣把根系周圍的Fe2+氧化形成鐵氧化物膠膜（鐵膜，IP）附著在植物根表[14-15]。鐵膜屬于兩性膠體，與自然界中的鐵氧化物具有相似的特征，它可以通過吸附、共沉淀等作用，改變Cd、Pb、As等重金屬[16-17]及氧化銅納米顆粒[18]的存在形態(tài)，影響其生物有效性。研究已經(jīng)證明，鐵膜能將Al 固定在水稻根表，阻止根系對Al 的吸收以及向地上部的運(yùn)輸[19]。磷（P）作為植物生長發(fā)育的必需元素之一，在植物Al 的吸收和運(yùn)輸中也起到了一定的作用，如于姣妲等[20]發(fā)現(xiàn)磷能夠改變杉木（Cunninghamia lanceolata）幼苗細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活性以及離子轉(zhuǎn)運(yùn)，增加Al向液泡的轉(zhuǎn)移，降低Al在細(xì)胞壁中的積累。此外，細(xì)胞壁組分也參與了和磷相關(guān)的抗鋁毒過程。例如，在缺磷狀態(tài)下，水稻根系的磷脂和果膠的含量降低或者酸性磷酸酶（APA）活性提高以提供更多的磷與Al結(jié)合鈍化，由此提高耐鋁性[21]。磷充足時(shí)，磷通過與Al 在蕎麥根細(xì)胞壁中形成不溶性沉淀[22]或通過降低耐鋁性水稻細(xì)胞壁多糖含量以減少Al結(jié)合位點(diǎn)[23]，表明鋁毒脅迫下磷能通過改變根系細(xì)胞壁組分提高耐鋁性。

以往的研究主要側(cè)重于鐵膜或磷單一因素對水稻耐鋁性的影響，而鐵膜以及吸附于鐵膜上的磷對水稻根尖細(xì)胞壁組分和耐鋁性的影響及其相互作用需要進(jìn)一步探索。因此，本研究以耐鋁能力有顯著差異的兩個(gè)水稻基因型為材料，研究鋁毒作用下鐵膜和覆鐵膜供磷對水稻生長以及細(xì)胞壁多糖含量的影響，從而進(jìn)一步探究鐵膜和磷對水稻鋁耐性的交互作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

水稻（Oryza sativaL.）品種選用菲優(yōu)多系1 號（耐鋁毒基因型）和紅良優(yōu)166（鋁毒敏感基因型），種子由三才種業(yè)公司提供[19]。

1.2 植株培養(yǎng)及試驗(yàn)處理

種子經(jīng)0.1%的H2O2消毒30 min后用蒸餾水漂洗并浸種24 h，轉(zhuǎn)移到28 ℃、濕度為80%的培養(yǎng)箱中進(jìn)行催芽，露白后將長勢良好的幼苗轉(zhuǎn)移到含有4 L 的全營養(yǎng)液[24]中進(jìn)行水培育苗，待水稻長至兩葉時(shí)轉(zhuǎn)移到16 孔的塑料板上，將塑料板放入含10 L 全營養(yǎng)液的塑料桶中培養(yǎng)，每孔種2 株，每3 d 更換一次營養(yǎng)液。15 d后取長勢一致的水稻，先用去離子水浸泡水稻根系3 次，再用0.05 mmol·L-1CaCl2浸泡30 min，然后用去離子水清洗3 次去除根表的CaCl2溶液后進(jìn)行鐵膜、磷和鋁毒誘導(dǎo)，過程分為如下5組：（1）CK，全營養(yǎng)液（pH5.0）培養(yǎng)；（2）Al，50 μmol·L-1Al3+溶液（含0.05 mmol·L-1CaCl2，pH5.0）處理48 h；（3）IP+Al，40 mg·L-1Fe（Ⅱ）的全營養(yǎng)液（pH5.0）處理24 h 后，用去離子水清洗根部3 次，再用0.05 mmol·L-1CaCl2浸泡30 min，接著用去離子水清洗3次去除根表的CaCl2溶液，再全部轉(zhuǎn)移到50 μmol·L-1Al3+溶液（含0.05 mmol·L-1CaCl2）中，處理48 h；（4）IP+Al+P15，40 mg·L-1Fe（Ⅱ）的全營養(yǎng)液處理24 h 誘導(dǎo)鐵膜形成，經(jīng)去離子水和0.05 mmol·L-1CaCl2溶液清洗完全后轉(zhuǎn)移至15 mg·L-1磷水平的NaH2PO4溶液（pH5.0）中處理24 h，之后繼續(xù)用去離子水和CaCl2溶液洗凈根部，再進(jìn)行50 μmol·L-1Al3+溶液（含0.05 mmol·L-1CaCl2）處理48 h；（5）IP+Al+P30，40 mg·L-1Fe（Ⅱ）的全營養(yǎng)液處理24 h誘導(dǎo)鐵膜形成，經(jīng)去離子水和CaCl2溶液清洗，再轉(zhuǎn)移至30 mg·L-1磷的NaH2PO4溶液（pH5.0）中處理24 h，之后繼續(xù)用去離子水和0.05 mmol·L-1CaCl2溶液洗凈根部，再進(jìn)行50 μmol·L-1Al3+溶液（含0.05 mmol·L-1CaCl2）處理48 h。Al3+均以AlCl3·6H2O 形態(tài)供應(yīng)，F(xiàn)e（Ⅱ）均以Fe（Ⅱ）-EDTA 形態(tài)供應(yīng)，磷均以NaH2PO4·2H2O 形態(tài)供應(yīng)，各處理溶液pH 每日均用1 mol·L-1NaOH 和1 mol·L-1HCl 調(diào)節(jié)至pH5.0，各處理組水稻總生長天數(shù)一致。

1.3 測定方法

1.3.1 水稻生物量測定

水稻收獲后，用去離子水沖洗干凈，分離地上部和根系兩部分，地上部于105 ℃殺青30 min 后，放在70 ℃烘干至恒質(zhì)量，稱量即為地上部干質(zhì)量。根系先用連二亞硫酸鈉-檸檬酸鈉-碳酸氫鈉（DCB）浸提除去鐵膜后用去離子水洗凈，殺青烘干至恒質(zhì)量，稱量即為根系干質(zhì)量，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3.2 水稻根尖Al測定

每個(gè)處理選取30個(gè)1 cm 長的根尖經(jīng)去離子水和0.05 mmol·L-1CaCl2清洗后置于1.5 mL 的離心管中，加入1 mL 2 mol·L-1HCl 溶液振蕩浸提24 h。浸提液經(jīng)ICP-AES測定Al含量。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3.3 根表鐵膜的Fe含量測定

水稻先用去離子水和0.05 mmol·L-1CaCl2去除根表殘留的營養(yǎng)液后，選取每組中長勢相同的3 株水稻根系，經(jīng)DCB 處理提取鐵膜，將去除鐵膜后的3 株水稻根用去離子水反復(fù)沖洗干凈后烘干，稱量其干質(zhì)量。采用ICP-AES測定DCB提取液中的Fe含量。用鐵膜中的Fe含量表示鐵膜含量，單位為g·kg-1DW。

1.3.4 根尖細(xì)胞壁多糖組分的測定

水稻先用去離子水和0.05 mmol·L-1CaCl2去除根表殘留的營養(yǎng)液后，參照Zhong 等[25]的細(xì)胞壁組分的提取方法。取各組提取所得的上清液150 μL 進(jìn)行細(xì)胞壁多糖組分測定，加入250 μL 冰乙酸中和后加入硫酸-硼砂2.4 mL，100 ℃下水浴5 min，在冰中立即冷卻后加入40 μL 0.15%間羥基聯(lián)苯，放置20 min 后在520 nm 下比色，標(biāo)準(zhǔn)空白以0.5% NaOH 代替間羥基聯(lián)苯。果膠、半纖維素含量用糖醛酸含量表示。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3.5 根尖酸性磷酸酶（APA）活性測定

水稻先用去離子水和0.05 mmol·L-1CaCl2去除根表殘留的營養(yǎng)液后，參照秦麗鳳APA 活性的測定方法，酶活性以單位時(shí)間內(nèi)每克蛋白水解對硝基苯磷酸二鈉（ρ-NPP）生成對硝基苯酚（NP）的量（gNP·g-1Pr·h-1）表示[26]。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)1.3中各指標(biāo)測定所得數(shù)據(jù)計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差，采用Excel 2013 軟件制圖，并用SPSS 21.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵膜和磷對鋁毒下水稻生物量的影響

Al 處理下菲優(yōu)多系1 號和紅良優(yōu)166 地上部和根系生長受到顯著抑制，根系干質(zhì)量分別比對照下降了32.4%和35.8%，地上部干質(zhì)量分別比對照下降了26.5%和37.9%，其中鋁敏感基因型紅良優(yōu)166 降幅較大（圖1）。IP+Al 處理的紅良優(yōu)166 根系和地上部干質(zhì)量顯著高于Al 處理組水稻。較IP+Al 處理，15 mg·L-1磷處理后的兩基因型水稻的地上部和根系干質(zhì)量變化差異不明顯，而當(dāng)30 mg·L-1磷處理時(shí)根系干質(zhì)量達(dá)顯著差異，分別增加了20.4%和22.6%，表明水稻根表鐵膜形成后能有效緩解鋁毒，較高濃度的外源磷處理覆鐵膜水稻，能進(jìn)一步降低Al 對水稻根系的損傷。

2.2 鐵膜和磷對鋁毒下水稻根尖Al含量的影響

單Al 處理下菲優(yōu)多系1 號和紅良優(yōu)166 根尖Al含量明顯增多，均比對照增加433.3%（圖2）。IP+Al處理下菲優(yōu)多系1 號和紅良優(yōu)166 的根尖Al 含量分別比單Al 處理降低了15.6%和33.3%，說明鐵膜有效降低了水稻根尖Al 含量，這種改善的效果在敏感型水稻紅良優(yōu)166 中更明顯。同時(shí)，隨著外源磷處理濃度增加，菲優(yōu)多系1號的根尖Al含量也逐漸降低，IP+Al+P30 處理時(shí)菲優(yōu)多系1 號根尖Al 含量比IP+Al 處理降低55.6%，表明鐵膜與外源磷的聯(lián)合處理能有效降低根尖Al含量，該種作用對菲優(yōu)多系1號更有效。

2.3 鐵膜和磷對鋁毒下水稻根表鐵膜厚度的影響

外源Fe（Ⅱ）處理下，IP+Al、IP+Al+P15、IP+Al+P30 的水稻根表鐵膜中的Fe 含量顯著高于無Fe（Ⅱ）處理的CK 和Al 處理，與Al 處理相比菲優(yōu)多系1 號和紅良優(yōu)166 各組的增幅達(dá)434.5%和488.8%、621.3%和265.5%、295.3%和344.3%，紅良優(yōu)166 根表的鐵膜厚度高于菲優(yōu)多系1號（圖3）。表明Fe（Ⅱ）處理誘導(dǎo)根表形成大量鐵膜。

圖1 鐵膜和磷對鋁毒下水稻根系和地上部干質(zhì)量的影響Figure 1 Effects of iron plaque and P on dry weight of rice roots and shoots under aluminum toxicity

圖2 鐵膜和磷對鋁毒下兩個(gè)基因型水稻根尖Al含量的影響Figure 2 Effects of iron plaque and P on Al content in root tips of rice under aluminum toxicity

2.4 鐵膜和磷對鋁毒下水稻根尖果膠含量的影響

Al 處理下菲優(yōu)多系1 號和紅良優(yōu)166 根尖細(xì)胞壁果膠含量分別比對照增加18.6%和27.8%（圖4）。IP+Al處理時(shí)兩基因型水稻根尖細(xì)胞壁果膠含量分別比Al 處理減少了22.6%和29.9%。隨著外源磷的加入，兩基因型水稻根尖細(xì)胞壁果膠含量均顯著降低，與Al 處理組相比，菲優(yōu)多系1 號和紅良優(yōu)166 在IP+Al+P15 處理下根尖果膠含量分別下降了33.7%和45.7%，在IP+Al+P30 處理下根尖果膠含量降幅達(dá)43.3%和57.8%，表明根表有鐵膜存在時(shí)，水稻根尖的細(xì)胞壁果膠含量隨著磷處理濃度增加而降低，水稻根尖果膠含量的變化同時(shí)說明了磷能夠有效降低覆鐵膜水稻根尖細(xì)胞壁果膠含量。

圖3 鐵膜和磷對鋁毒下兩個(gè)基因型水稻根表鐵膜中Fe含量的影響Figure 3 Effect of Fe（Ⅱ）and P treatment on iron plaque formation on root surface of rice under aluminum toxicity

圖4 鐵膜和磷對鋁毒下水稻根尖細(xì)胞壁果膠含量的影響Figure 4 Effects of iron plaque and P on pectin content in cell wall of root tips under aluminum toxicity

2.5 鐵膜和磷對鋁毒下水稻根尖半纖維素1含量的影響

與對照相比，單Al處理下菲優(yōu)多系1號和紅良優(yōu)166 的半纖維素1 含量分別增加了66.1%和182.7%，紅良優(yōu)166 增幅遠(yuǎn)大于菲優(yōu)多系1 號（圖5）。IP+Al處理的根尖細(xì)胞壁半纖維素1 含量較Al 處理下降22.6%和29.9%，鐵膜和磷共同處理下根尖細(xì)胞壁半纖維素1 含量比鐵膜單獨(dú)處理時(shí)降幅更大，其中IP+Al+P15 處理組降幅分別為21.0%和41.5%，IP+Al+P30 處理組降幅分別為20.5%和40.2%，表明鐵膜能夠降低Al處理下根尖細(xì)胞壁半纖維素1的產(chǎn)生，外源磷能進(jìn)一步降低覆鐵膜水稻半纖維素1的含量。

2.6 鐵膜和磷對鋁毒下水稻根尖半纖維素2含量的影響

根尖細(xì)胞壁半纖維素2含量變化與半纖維素1含量變化基本一致（圖6）。單Al處理下，根尖細(xì)胞壁半纖維素2含量與對照相比顯著上升，但與單Al處理相比，菲優(yōu)多系1 號和紅良優(yōu)166 根尖細(xì)胞壁半纖維素2 含量在IP+Al 處理下分別下降了28.4%和28.1%，IP+Al+P15 處理降低42.7%和43.0%，IP+Al+P30 處理降低了44.8%和45.3%。表明根表鐵膜和外源磷處理能有效降低Al誘導(dǎo)的細(xì)胞壁半纖維素2含量的增加。

2.7 鐵膜和磷的作用對鋁毒下水稻根尖APA 活性的影響

Al 處理48 h 后菲優(yōu)多系1 號的APA 活性在各處理組均無顯著性差異，IP+Al 處理96 h APA 的活性顯著增加（圖7），而紅良優(yōu)166 的IP+Al 處理組的APA活性在Al 處理48 h 和96 h 下均顯示出明顯的增強(qiáng)，表明低磷狀態(tài)是水稻根系A(chǔ)PA 活性急劇增加的主要原因，較短時(shí)間內(nèi)覆鐵膜的菲優(yōu)多系1 號能更有效地吸收可溶性磷來對抗低磷環(huán)境，同時(shí)耐受型水稻顯示出更強(qiáng)的抗低磷能力。

圖5 鐵膜和磷對鋁毒下水稻根尖細(xì)胞壁半纖維素1含量的影響Figure 5 Effects of iron plaque and P on hemicellulose 1 content in cell wall of root tips under aluminum toxicity

圖6 鐵膜和磷對鋁毒下水稻根尖細(xì)胞壁半纖維素2含量的影響Figure 6 Effects of iron plaque and P on hemicellulose 2 content in cell wall of root tips under aluminum toxicity

圖7 鐵膜和磷對鋁毒下水稻根尖APA含量的影響Figure 7 Effects of iron plaque and P on APA content in rice root tips under aluminum toxicity

3 討論

鐵膜能吸附Cd、As 等有害金屬[27]，有效緩解其對植物生長的損傷[28-29]。Chen 等[30]發(fā)現(xiàn)水稻根表鐵膜可以將Al 吸附在根表，同時(shí)鐵離子能預(yù)飽和水稻根尖Al 的結(jié)合位點(diǎn)，減輕根系對Al 的吸收。本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)Fe（Ⅱ）處理后水稻根表鐵膜大量形成（圖3），顯著減少了根尖Al含量（圖2），緩解了鋁毒導(dǎo)致的水稻根系以及地上部生物量的降低（圖1），說明鐵膜的存在能有效阻止Al 進(jìn)入水稻根尖，減緩鋁毒對水稻生長的抑制作用。Dai等[31]在對紅樹林的研究中發(fā)現(xiàn)施加外源磷增強(qiáng)了鐵膜對Cd 的吸附能力。因此，本實(shí)驗(yàn)采用覆鐵膜水稻經(jīng)不同濃度外源磷處理來分析鐵膜對水稻耐鋁的作用。結(jié)果表明外源磷處理明顯降低鋁耐受型水稻菲優(yōu)多系1號的根尖Al含量，磷濃度達(dá)30 mg·L-1時(shí)，兩基因型水稻根系干質(zhì)量顯著增加，菲優(yōu)多系1 號的根尖Al含量進(jìn)一步降低（見圖1～圖3），由此表明，外源磷降低了Al 在耐受型覆鐵膜水稻根尖的積累，較高濃度的磷能緩解Al 對覆鐵膜水稻根系生長的抑制，增強(qiáng)了水稻的耐鋁效應(yīng)。

水稻根表鐵膜是一個(gè)磷儲藏庫，能從貧營養(yǎng)環(huán)境吸附磷從而滿足植物生長的需要[32]。Batty 等[33]提出Al 能與磷酸鹽共沉淀形成難溶的磷酸鋁，Al 脅迫下鐵膜的形成和磷處理后鐵膜上吸附磷的增加為磷和Al 在鐵膜表面的反應(yīng)與沉積提供了條件，因此在菲優(yōu)多系中觀察到磷處理后根尖Al 含量的降低可能是由于鐵膜上的磷酸鹽和Al 反應(yīng)形成穩(wěn)定的鋁磷酸鹽絡(luò)合物[34]，而降低了根尖Al的積累。

細(xì)胞壁在植物應(yīng)對鋁毒時(shí)起著至關(guān)重要的作用。Yang等[35-36]發(fā)現(xiàn)在Al處理后，鋁敏感水稻細(xì)胞壁中的果膠以及Al 含量顯著高于耐鋁水稻，在五加科植物三七[Panaxnotoginseng（Burk.）F.H.Chen]的根中，83%的Al 結(jié)合在根細(xì)胞壁的果膠上，Zhu 等[37]分析了CO2對鋁毒作用下水稻細(xì)胞壁組分的影響，發(fā)現(xiàn)水稻培養(yǎng)環(huán)境中較高的CO2濃度誘導(dǎo)細(xì)胞壁中半纖維素含量降低從而緩解鋁毒對水稻根系的損傷，表明細(xì)胞壁多糖含量與植物鋁耐受性相關(guān)，通過外源介質(zhì)調(diào)控細(xì)胞壁多糖組分含量能夠緩解鋁毒。磷處理顯著降低了覆鐵膜水稻菲優(yōu)多系1 號的根系細(xì)胞壁多糖含量，與IP+Al 相比，IP+Al+P15 處理組的根尖細(xì)胞壁果膠含量降幅為33.7%（圖3），半纖維素1、半纖維素2 含量的降幅分別為21.0%和41.5%（圖4～圖5），IP+Al+P30處理使菲優(yōu)多系的根尖細(xì)胞壁果膠含量進(jìn)一步減少，降幅達(dá)到43.3%，根系細(xì)胞壁多糖的含量變化直接影響了根系細(xì)胞的伸展[38]，細(xì)胞壁多糖的增加引起細(xì)胞壁的硬化[39]，從而抑制了根系的伸長。本試驗(yàn)中細(xì)胞壁多糖含量降低后根細(xì)胞的伸展性得到提高，因此磷緩解了鋁毒對根系生長的抑制作用，增強(qiáng)覆鐵膜水稻尤其是鋁耐受型水稻的耐鋁作用。細(xì)胞壁多糖是重金屬離子的主要結(jié)合位點(diǎn)[5，10，35]。從細(xì)胞壁多糖的成分來看，果膠含量隨著磷處理濃度的增加而降低。果膠富含同聚半乳糖醛酸，在其C6 位上的游離羧基能夠與金屬陽離子結(jié)合[10，40]，其含量降低后Al在根尖的結(jié)合位點(diǎn)減少，從而緩解了鋁毒對水稻根系的損傷。

此外，植物能引發(fā)一系列適應(yīng)性反應(yīng)來抵御低磷環(huán)境，其中包括APA 的誘導(dǎo)和分泌，APA 能將環(huán)境中植物無法吸收的有機(jī)磷轉(zhuǎn)化為利于植物吸收的無機(jī)磷形態(tài)[41]。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)菲優(yōu)多系1 號在48 h 時(shí)各個(gè)處理組根系的APA 含量無顯著差異，在96 h 時(shí)IP+Al+P0組的APA含量顯著增加，而對于紅良優(yōu)166，處理48 h時(shí)IP+Al+P0組的APA 含量已經(jīng)呈現(xiàn)出顯著的差異（圖7），表明磷在鋁敏感型水稻抗鋁過程中具有重要作用，在低磷環(huán)境中水稻通過分泌大量APA 來增加可用的磷，從而提高覆鐵膜水稻的鋁耐受性。

4 結(jié)論

（1）50 μmol·L-1Al 處理顯著降低水稻根系和地上部干質(zhì)量，增加根尖Al 含量和細(xì)胞壁果膠、半纖維素1以及半纖維素2含量。

（2）根表覆鐵膜處理下，菲優(yōu)多系1 號和紅良優(yōu)166 通過降低根尖細(xì)胞壁的果膠、半纖維素1 和半纖維素2 含量，減輕Al 對水稻生長的抑制，增加水稻根系和地上部干質(zhì)量。

（3）覆鐵膜水稻經(jīng)磷處理，根尖細(xì)胞壁的果膠、半纖維素1 和半纖維素2 的含量顯著降低，從而減少Al在根尖的沉積，減輕根生長受抑程度。