結(jié)合態(tài)雌激素在堆肥過程中的降解與轉(zhuǎn)化研究

王 真，張洪昌，沈根祥*，胡雙慶，錢曉雍，王振旗，李貞金

（1.華東理工大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，上海200237；2.上海市環(huán)境科學(xué)研究院，上海200233）

天然雌激素以自由態(tài)或結(jié)合態(tài)兩種形式存在，自由態(tài)包括雌酮（Estrone，E1）、雌二醇（17β-Estradiol，E2）和雌三醇（Estriol，E3），結(jié)合態(tài)包括硫酸鹽結(jié)合態(tài)和葡糖苷酸鹽結(jié)合態(tài)兩類，結(jié)合態(tài)雌激素主要由動(dòng)物體產(chǎn)生[1]。英國的一項(xiàng)研究表明，人類排放雌激素達(dá)到365 kg·a-1，主要為雌酮和雌二醇，動(dòng)物排放雌激素達(dá)到1520 kg·a-1，其中奶牛場為1058 kg·a-1[2]。動(dòng)物為排出體內(nèi)多余的雌激素，在體內(nèi)磺基轉(zhuǎn)移酶（Sulfotransferases）或葡萄糖苷酸基轉(zhuǎn)移酶（Glucuronosyltransferase）的作用下，將硫酸根或者葡糖苷酸根結(jié)合到自由態(tài)雌激素分子上，增加了其水溶性，更利于通過尿液或糞便排出[3-5]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，豬、雞和牛所排泄的雌激素中分別有96%、69%和42%是以結(jié)合態(tài)形式存在的[6-8]。雖然結(jié)合態(tài)雌激素的雌激素活性很低，但環(huán)境中的微生物能夠?qū)⑵渲匦罗D(zhuǎn)化為自由態(tài)從而激活其雌激素活性[4，9]。重新轉(zhuǎn)化為自由態(tài)的雌激素會(huì)對環(huán)境生物造成一定危害，產(chǎn)生各種不利的生態(tài)影響[6，10-13]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，雌激素在水生環(huán)境中以ng·L-1級別的低濃度存在就足以造成雄魚雌性化[5]，且環(huán)境中90%的天然雌激素來自于畜禽養(yǎng)殖[3，14-15]，因此研究畜禽糞便中雌激素的降解和轉(zhuǎn)化具有重要意義。

除天然雌激素外，還有一些物質(zhì)，如己烯雌酚（Diethylstilbestrol，DES）和乙炔雌二醇（17a-Ethinylestradiol，EE2），盡管在2002 年就被列于“禁止在飼料、動(dòng)物飲用水和畜禽水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中使用的藥物和物質(zhì)清單”，但目前仍能夠從畜禽廢棄物中檢出。辛基酚（Octylphenol，OP）、壬基酚（Nonylphenol，NP）和雙酚A（Bisphenol A，BPA）也可以通過食用含有該物質(zhì)的飼料或飲用污染水體等方式被動(dòng)物攝入體內(nèi)。畜禽養(yǎng)殖場排放至環(huán)境中的雌激素，通過畜禽糞便堆肥還田等方式進(jìn)入到土壤中，并可能流失到水體中，對環(huán)境及生物體構(gòu)成潛在威脅[6，16]。

由于結(jié)合態(tài)雌激素在畜禽糞便的保存過程中具有較高的穩(wěn)定性，畜禽糞便堆肥中大約1/3 的雌激素是以結(jié)合態(tài)的形式存在的[14]。而目前對畜禽糞便引起的污染研究和控制仍主要集中在N、P、重金屬和農(nóng)藥等常規(guī)污染物和大量的微生物、病原菌等項(xiàng)目上[17-20]。雌激素等內(nèi)分泌干擾物尚未得到足夠的重視。目前研究中天然雌激素在堆肥處理過程中的降解主要以自由態(tài)雌激素（包括E1、E2和E3）為主[20-23]，對結(jié)合態(tài)雌激素、自由態(tài)雌激素以及其他具有雌激素效應(yīng)的物質(zhì)的研究仍不足，對堆肥過程中結(jié)合態(tài)與自由態(tài)之間的降解轉(zhuǎn)化行為等缺乏足夠的認(rèn)識(shí)。目前研究中堆肥處理多是在實(shí)驗(yàn)室完成[22]，對試驗(yàn)條件的控制理想化，無法模擬實(shí)際堆肥過程中溫度、濕度等因素的變化，使試驗(yàn)數(shù)據(jù)與現(xiàn)實(shí)堆肥中的情況有一定偏差。

因此，本研究選取15 種雌激素類物質(zhì)作為目標(biāo)化合物，包括結(jié)合態(tài)雌激素[雌酮3-硫酸鈉（Estrone 3-Sulfate Sodium Salt，E1-3S）、雌酮3-（β-D-葡糖苷酸）鈉鹽（Estrone β-D-Glucuronide Sodium Salt，E1-3G）、17β-雌二醇3-硫酸鈉鹽（17β-Estradiol 3-OSulfate Sodium Salt，E2-3S）、17β-雌二醇17-硫酸鉀鹽（17β-Estradiol 17-Sulfate Potassium Salt，E2-17S）、17β-雌二醇3-（β-D-葡糖苷酸）鈉鹽（17β-Estradiol 3-β-D-Glucuronide，E2-3G）、17β-雌二醇-17-β-D葡糖苷酸（17β-Estradiol 17β-D Glucuronide，E2-17G）和雌三醇-3-O-β-D 葡糖苷酸鈉鹽（Estriol 3-O-β-D-Glucuronide Sodium Salt，E3-3G）]、自由態(tài)雌激素（E1、E2 和E3）和其他類雌激素（OP、NP、BPA、DES 和EE2）。評價(jià)堆肥過程對目標(biāo)雌激素的降解效果，并對比葡糖苷酸鹽和硫酸鹽結(jié)合態(tài)的降解速率，研究在實(shí)際堆肥過程中結(jié)合態(tài)雌激素與自由態(tài)雌激素的降解轉(zhuǎn)化規(guī)律，確定最終可能通過糞肥還田方式進(jìn)入到環(huán)境中的雌激素含量。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用牛糞為上海市某奶牛場提供的新鮮混合牛糞。固相萃取柱選用美國Waters 公司的Oasis HLB 小柱（500 mg，6 mL）和Sep Pak Aminopropyl NH2小柱（500 mg，6 mL）。

試劑：試驗(yàn)所用甲醇、乙腈、丙酮和正己烷均為HPLC級，購自德國Merck公司。甲基叔丁基醚（HPLC級）、檸檬酸鈉（98%），購自沃凱。檸檬酸為優(yōu)級純，購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。試驗(yàn)用水均為Milli-Q 超純水。試驗(yàn)所用標(biāo)準(zhǔn)品信息見表1，上述標(biāo)準(zhǔn)品均用甲醇配成標(biāo)準(zhǔn)溶液，并配制濃度為10 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，于-20 ℃冰箱中保存。

緩沖溶液：分別配制0.1 mol·L-1的檸檬酸和檸檬酸鈉溶液，以體積比41∶59 混合得到pH=5 的檸檬酸緩沖溶液。

儀器：島津30A-AB5500Q-trap 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國AB 公司），CEM MARS CLASSIC 型微波萃取儀（美國CEM 公司），6通道全自動(dòng)固相萃取儀（廈門?？苾x器有限公司），全自動(dòng)氮吹濃縮儀（廈門

?？苾x器有限公司），S220 型pH 計(jì)（梅特勒-托多儀器有限公司），Milli-Q 超純水器（美國Millipore 公司），TW223L 電子天平（日本島津公司），LDG-0.3C低溫真空冷凍干燥機(jī)（上海昊博低溫真空設(shè)備有限公司），2300TH 型數(shù)控超聲波清洗器（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司），DW130A 氮?dú)獍l(fā)生器（上海登晨生物醫(yī)療科技有限公司），LY280型翻拋機(jī)。

表1 目標(biāo)雌激素和內(nèi)標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)品信息Table 1 Information of target compounds

續(xù)表1 目標(biāo)雌激素和內(nèi)標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)品信息Continued table 1 Information of target compounds

續(xù)表1 目標(biāo)雌激素和內(nèi)標(biāo)物的標(biāo)準(zhǔn)品信息Continued table 1 Information of target compounds

1.2 堆肥試驗(yàn)

為研究實(shí)際農(nóng)業(yè)堆肥過程中結(jié)合態(tài)雌激素的降解過程，確保研究過程中結(jié)合態(tài)雌激素降解行為能夠反映生產(chǎn)中的實(shí)際情況，堆肥處理在上海市某奶牛場堆肥現(xiàn)場完成，堆肥周期為70 d。

所用牛糞為新鮮混合糞便，堆肥輔料為菌渣。將牛糞和堆肥輔料（菌渣）按照適當(dāng)?shù)谋壤?∶2）混合均勻后，含水率控制在51.07%±10%。

利用翻拋機(jī)將物料充分混合，并在設(shè)有頂棚的水泥地面上堆制成窄長條垛，斷面為三角形，條垛的寬度為3.0～4.0 m、高度為1.5～2.0 m，并采用翻拋機(jī)對物料進(jìn)行定期（7 d）翻堆，使內(nèi)外層分解程度不同的物質(zhì)重新混合均勻。

1.3 樣品的采集與提取

采集堆肥第0、4、10、15、21、36、47 d和70 d樣品。采集深度為10～30 cm，所采集樣品均為堆體6個(gè)隨機(jī)點(diǎn)（每點(diǎn)間隔至少2 m）的等比例混合樣。由于不同性別、生長階段、生長條件的牛所排放的雌激素含量不同[2，15，23-25]，本試驗(yàn)在兩個(gè)月內(nèi)采集7 次牛糞樣品，所采集牛糞為上海市某奶牛場新鮮混合糞便。樣品經(jīng)冷凍干燥、研磨、過篩后，保存在-20 ℃冰箱中，并于7 d內(nèi)測定新鮮牛糞中雌激素含量。

結(jié)合態(tài)雌激素的提取：準(zhǔn)確稱取2.000 g 堆肥樣品，加入50 mL 甲醇-緩沖溶液（V∶V=1∶1），于95 ℃微波萃取40 min 提取結(jié)合態(tài)雌激素；收集提取液，經(jīng)0.7 μm 玻璃纖維濾膜過濾去除顆粒懸浮物后稀釋至500 mL，用4 mol·L-1鹽酸調(diào)節(jié)pH 至3±0.1；依次用甲基叔丁基醚、甲醇和水活化固相萃取柱，將水樣通過預(yù)活化的Oasis HLB 小柱富集目標(biāo)雌激素，利用體積濃度10%的甲醇-水溶液、pH=3 的超純水、體積濃度比為2∶10∶88的氨水-甲醇-水溶液淋洗，經(jīng)甲醇洗脫HLB 小柱，并收集洗脫液，再通過經(jīng)甲醇活化的NH2小柱凈化。

自由態(tài)和其他類雌激素的提?。簻?zhǔn)確稱取2.000 g 堆肥樣品，加入50 mL 甲醇-丙酮（V∶V=1∶3），于100 ℃微波萃取60 min 提取目標(biāo)雌激素。收集提取液，水浴加熱40 ℃條件下氮吹濃縮至近干，用10 mL乙腈重新溶解，然后用10 mL 正己烷進(jìn)行液-液萃取，并移除正己烷層，該操作重復(fù)兩次；所得乙腈層溶液稀釋至250 mL后經(jīng)0.7 μm玻璃纖維濾膜過濾去除顆粒懸浮物，用4 mol·L-1鹽酸調(diào)節(jié)pH 至3±0.1；依次用甲醇和水活化固相萃取柱，將水樣通過預(yù)活化的Oasis HLB 小柱富集目標(biāo)雌激素，利用超純水和體積濃度5%的甲醇-水溶液淋洗，經(jīng)甲醇洗脫HLB 小柱，并收集洗脫液。

在微波萃取前加入指示回收率的內(nèi)標(biāo)物。洗脫液在水浴加熱40 ℃條件下氮吹濃縮至近干，用體積濃度為70%的甲醇-水溶液定容至1 mL，并通過孔徑為0.22 μm 的有機(jī)相濾膜，最后利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀定量目標(biāo)雌激素。

1.4 儀器檢測方法

利用美國AB 公司的AB5500Q-trap 三重四極桿質(zhì)譜儀，配島津30A 液相色譜，對15 種雌激素進(jìn)行檢測。色譜柱選用Shim-Pack XR-ODSII C18 柱（75 mm×2 mm，1.0 μm），流動(dòng)相A 為體積濃度為0.1%氨水-超純水溶液，流動(dòng)相B 為HPLC 級甲醇。色譜柱溫40 ℃，流動(dòng)相流速為0.3 mL·min-1。質(zhì)譜為三重四極桿質(zhì)量分析器，在電噴霧離子源負(fù)離子模式ESI-下，選用多反應(yīng)監(jiān)測模式MRM 掃描方式進(jìn)行檢測。離子源溫度為550 ℃，噴霧電壓為-4500 V，氣簾氣壓力（CUR）為241.32 kPa，霧化器壓力（GS1）為344.74 kPa，輔助氣壓力（GS2）為344.74 kPa，碰撞氣CAD 為Medium，碰撞氣為高純氮?dú)狻?/p>

結(jié)合態(tài)雌激素（E1-3S、E1-3G、E2-3S、E2-17S、E2-3G、E2-17G 和E3-3G）梯度洗脫程序：0～2 min，10%B；2.0～2.2 min，10%B～50%B；2.2～3.5 min，50%B；3.5～3.8 min，50%B～97%B；3.8～5.5 min，97%B；5.5～5.6 min，97%B～10%B；10 min，10%B。

自由態(tài)和其他類雌激素（E1、E2、E3、OP、NP、BPA、DES 和EE2）梯度洗脫程序：0～3.0 min，30%B；3.0～4.0 min，30%B～93%B；4.0～7.0 min，93%B；7.0～8.0 min，93%B～30%B；8.0～10.0 min，30%B。

采用內(nèi)標(biāo)法，以牛糞作為樣品進(jìn)行加標(biāo)檢測，得到15 種雌激素的加標(biāo)回收率在70%～110%。目標(biāo)雌激素的母離子、子離子、定量限、檢測限和標(biāo)準(zhǔn)曲線等如表2 所示，R2均大于0.998，高分辨率、低檢出限可用來定量環(huán)境中痕量存在的目標(biāo)雌激素。

2 結(jié)果與討論

2.1 堆肥材料中目標(biāo)雌激素含量

本試驗(yàn)分7 次采集檢測確定新鮮糞便中雌激素的含量范圍，所述的15 種雌激素在新鮮糞便中均有檢出。15 種雌激素的加標(biāo)回收率及其在新鮮糞便和菌渣中的含量見表3。

堆肥0 d 樣品中15 種雌激素含量如圖1 所示，同新鮮糞便中雌激素含量比例相似，主要以結(jié)合態(tài)雌激素為主，其中E2-17G 高達(dá)636.40 μg·kg-1；自由態(tài)雌激素中，E2 雌激素活性最大[26-28]，濃度最高，為281.98 μg·kg-1；除天然雌激素外，其他5種雌激素，包括人工合成雌激素、增塑劑和工業(yè)化學(xué)品均有檢出，其中工業(yè)化學(xué)品NP含量最高，濃度為477.91 μg·kg-1。

2.2 堆肥處理對目標(biāo)雌激素的降解

結(jié)合態(tài)雌激素與其他6 種雌激素（OP、NP、DES、EE2、BPA 和E2）濃度隨著堆肥的進(jìn)行呈持續(xù)下降趨勢，降解率如圖2 所示。其中BPA 和DES 在堆肥第4 d 已經(jīng)低于檢測限；E1-3S、E2-3S、E2-17S、E3-3G 和OP 的降解主要發(fā)生于堆肥0～4 d，堆肥至第4 d 降解率均≥43%，在4 d之后降解速率明顯降低；而E1-3G、E2-3G、E2-17G、E2 和EE2 的降解主要發(fā)生于堆肥4～15 d；圖2所示13種雌激素濃度均在堆肥36 d之后趨于平穩(wěn)，在堆肥70 d 降解率（除NP 外）均≥95.75%；NP在堆肥過程中降解緩慢，第4 d降解20.5%，4～21 d僅降解16.3%，堆肥70 d 降解51.16%。Bartelt-Hunt等[23]研究證實(shí)堆肥能有效降解79%～87%的激素。Derby 等[20]在堆肥期間發(fā)現(xiàn)E1 和E2 總濃度降低了74%（靜態(tài)堆肥）和79%（好氧堆肥）。與本研究結(jié)果相似，證明堆肥能去除大部分雌激素類物質(zhì)，但不能將其完全降解。

堆肥處理70 d 能有效降解糞便中的E1-3G、E3-3G、OP、BPA、DES 和EE2，但70 d 后仍檢測到E1-3S、E2-3S、E2-17S、E2-3G、E2-17G、NP、E1 和E2 8 種雌激素，濃度分別為1.75、9.5、16.4、3.89、4.44、233.4、69.28 μg·kg-1和11.98 μg·kg-1，這些雌激素會(huì)隨有機(jī)肥還田進(jìn)入土壤環(huán)境，可能對農(nóng)田生態(tài)產(chǎn)生不利影響。同時(shí)，這些雌激素若隨降雨等地表徑流進(jìn)入水生環(huán)境，會(huì)對水生生物造成內(nèi)分泌干擾，造成一定的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。因此，需對土壤中雌激素做進(jìn)一步評價(jià)分析。

表3 15種雌激素的加標(biāo)回收率及其在新鮮糞便和菌渣中的含量Table 3 Recovery rate of 15 target estrogens and their concentration in fresh manure and mushroom dregs

圖1 堆肥0 d的雌激素含量Figure 1 Concentration of estrogens at 0 d

圖2 目標(biāo)雌激素的降解率Figure 2 Degradation rate of target estrogens

2.3 不同結(jié)合態(tài)雌激素的降解特征

如圖1 所示，天然雌激素在堆肥0 d 主要以葡糖苷酸鹽結(jié)合態(tài)形式存在。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)合態(tài)雌激素在環(huán)境中首先被微生物水解為自由態(tài)雌激素[6]，再進(jìn)一步發(fā)生降解。葡糖苷酸鹽結(jié)合態(tài)雌激素的降解主要發(fā)生在堆肥4～15 d（除E3-3G 以外），降解率均≥98.76%，高于硫酸鹽結(jié)合態(tài)；而硫酸鹽結(jié)合態(tài)主要在0～4 d 降解，3 種硫酸鹽結(jié)合態(tài)在堆肥70 d 后均有檢出，降解率在92.74%～96.79%。

對各雌激素的降解進(jìn)行模擬發(fā)現(xiàn)：在堆肥期間，

E1-3S（0～47 d）、E1-3G（0～21 d）、E2-17S（0～70 d）、E2-3G（0～47 d）、E2-17G（0～47 d）和E3-3G（0～21 d）的降解符合一級動(dòng)力學(xué)方程，如圖3 所示，其中E1-3G 和E3-3G 在21 d 已經(jīng)低于檢測限。由方程得到6種結(jié)合態(tài)雌激素在堆肥處理中的降解速率常數(shù)，分別為0.086 38、0.041 48、0.088 03、0.104 66、0.106 86 和0.065 57，計(jì)算得到半衰期分別為8.02、7.87、16.71、6.62、6.49 d 和10.57 d。結(jié)果顯示，在堆肥0～47 d，結(jié)合態(tài)雌激素的降解速率大小依次為：E2-17G＞E2-3G＞E1-3G＞E1-3S＞E3-3G＞E2-17S，表明葡糖苷酸鹽結(jié)合態(tài)降解速率普遍高于硫酸鹽結(jié)合態(tài)，這也與堆肥70 d后的檢測結(jié)果相一致，即硫酸鹽結(jié)合態(tài)在堆肥完成后仍有檢出，葡糖苷酸鹽結(jié)合態(tài)則無檢出。Ben等[29]研究結(jié)合態(tài)雌激素在污水處理中的轉(zhuǎn)化時(shí)發(fā)現(xiàn)，污水中硫酸鹽結(jié)合態(tài)比葡糖苷酸鹽結(jié)合態(tài)水解速率低。Ma 等[30]研究結(jié)合態(tài)雌激素在土壤中的降解發(fā)現(xiàn)，硫酸鹽結(jié)合態(tài)比葡糖苷酸鹽結(jié)合態(tài)存在更持久。在堆肥降解中也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，即葡糖苷酸鹽結(jié)合態(tài)比硫酸鹽結(jié)合態(tài)降解更徹底，硫酸鹽結(jié)合態(tài)相對更加穩(wěn)定。

圖3 不同結(jié)合態(tài)雌激素在堆肥期間的降解動(dòng)力學(xué)曲線Figure 3 Biodegradation kinetics curves of conjugated estrogens during composting

2.4 結(jié)合態(tài)與自由態(tài)雌激素的轉(zhuǎn)化

本研究中自由態(tài)雌激素E2在堆肥過程中持續(xù)降解，而E1、E3 濃度先升高后降低（圖4）。堆肥過程中存在的自由態(tài)雌激素主要為E1，同Derby 等[20]研究結(jié)果一致，盡管E2 初始濃度（0～4 d）高于E1，但隨著堆肥處理的進(jìn)程E1 含量始終高于E2（4～70 d）。如圖4所示，E1、E3 濃度在0～10 d 持續(xù)增高，在堆肥10 d 達(dá)到最大濃度（192.15、56.82 μg·kg-1），增加了5～7倍，主要原因是結(jié)合態(tài)雌激素在堆肥過程中水解為自由態(tài)[9，12]。Hammett等[31]在堆肥處理中發(fā)現(xiàn)E1在第7 d由17.4 ng·L-1逐漸增加至50.0 ng·L-1，第10 d顯著增加至137.8 ng·L-1，在各種家禽糞便混合物中自由態(tài)雌激素（E1和E2）檢測中發(fā)現(xiàn)，堆肥10 d雌激素含量（E1+E2）增加至3～10 倍，這與本研究結(jié)果一致。而本試驗(yàn)中E1在36 d達(dá)到另一個(gè)峰值（212.5 μg·kg-1）。

對結(jié)合態(tài)雌激素降解率曲線（圖2）和自由態(tài)雌激素濃度變化曲線（圖4）進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)：堆肥初期（0～10 d），E1和E3濃度升高，主要發(fā)生結(jié)合態(tài)雌激素的水解反應(yīng)；堆肥10～21 d，E1和E3濃度降低，自由態(tài)降解速率明顯大于結(jié)合態(tài)水解速率，E1、E3分別降解峰值濃度（10 d）的59.65%、70.22%；堆肥21～36 d，E1含量持續(xù)增大，而E3 持續(xù)降解，但速率下降，表明結(jié)合態(tài)水解為E1 的速率＞E3 降解速率＞結(jié)合態(tài)水解為E3 的速率；36 d 之后，E3 已經(jīng)低于檢出限。E1 在47 d之后降解速率明顯下降。在堆肥過程中，初期主要發(fā)生結(jié)合態(tài)的水解反應(yīng)，36 d 之后水解反應(yīng)緩慢，至47 d雌激素濃度趨于穩(wěn)定。

試驗(yàn)結(jié)果表明，堆肥過程中結(jié)合態(tài)雌激素的水解產(chǎn)物主要為E1、E3。Zheng 等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在牛糞堆積過程中E2 會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)镋1。在Khanal 等[3]研究中，E2在污水中首先被生物轉(zhuǎn)化為E1，再進(jìn)一步發(fā)生降解。也就是說，盡管部分結(jié)合態(tài)雌激素水解反應(yīng)只脫去葡糖苷酸鹽基團(tuán)或硫酸鹽基團(tuán)從而轉(zhuǎn)化為其自由態(tài)形式（如E2-3G 脫去葡糖苷酸鹽基團(tuán)水解為E2），也會(huì)最終轉(zhuǎn)化為E1，從而進(jìn)一步降解。在本試驗(yàn)中，由于E2 濃度波動(dòng)不大，因此將E1 作為結(jié)合態(tài)雌激素主要的水解產(chǎn)物。Ma 等[30]研究土壤中結(jié)合態(tài)雌激素的降解過程，發(fā)現(xiàn)結(jié)合態(tài)雌激素在土壤環(huán)境中首先被微生物水解，而主要代謝產(chǎn)物為E1。與本研究中E1 濃度變化趨勢一致，表明結(jié)合態(tài)雌激素和E2 在環(huán)境中主要被微生物轉(zhuǎn)化為E1。

堆肥70 d 能有效降解E3，卻不能完全降解E1。堆肥70 d 后E1 降解了峰值濃度（36 d）的67.39%，最終經(jīng)還田進(jìn)入到土壤環(huán)境的濃度高于堆肥初始濃度，約為堆肥0 d的3倍。

圖4 自由態(tài)雌激素濃度變化曲線Figure 4 Concentration of free estrogens during composting

2.5 堆肥過程中雌激素活性變化

雌激素活性取決于其化學(xué)結(jié)構(gòu)[32]，天然雌激素中自由態(tài)比結(jié)合態(tài)活性高[14，27]，而自由態(tài)雌激素中E2的雌激素活性為E1 和E3 的5～1000 倍[27-28]。本文采用雌二醇當(dāng)量EEQ（17β-estradiol equivalents）表征雌激素活性，計(jì)算公式[33]如下：

式中：MEC為雌激素實(shí)測濃度，μg·kg-1；EEF為雌二醇當(dāng)量因子。

以雌激素同細(xì)胞內(nèi)雌激素受體ER（Estrogen receptor）的最大結(jié)合能力[12]作為EEF進(jìn)行計(jì)算。雖然結(jié)合態(tài)雌激素的生物活性比自由態(tài)雌激素低幾個(gè)數(shù)量級[34]，但是考慮到結(jié)合態(tài)雌激素首先轉(zhuǎn)化為自由態(tài)雌激素從而激活其雌激素活性[3，7，31]，且試驗(yàn)結(jié)果表明結(jié)合態(tài)水解產(chǎn)物主要為E1，因此結(jié)合態(tài)雌激素的EEF以E1計(jì)算。堆肥前后的雌二醇當(dāng)量（μg·kg-1）計(jì)算結(jié)果和雌激素對應(yīng)的雌二醇當(dāng)量因子如表4所示。

表4 雌激素對應(yīng)的雌二醇當(dāng)量因子和堆肥前后的雌二醇當(dāng)量（μg·kg-1）Table 4 The estradiol equivalent factor，and the calculated estradiol equivalent at 0 d and 70 d（μg·kg-1）

堆肥0 d 的EEQ為1942 μg·kg-1，雌激素活性主要由結(jié)合態(tài)雌激素、DES、E2和EE2貢獻(xiàn)，其中結(jié)合態(tài)雌激素占54.11%；至堆肥結(jié)束70 d 的EEQ為75.18 μg·kg-1，其中E1 貢獻(xiàn)55.29%，結(jié)合態(tài)雌激素 為28.71%；以雌二醇活性（EEQ）變化評價(jià)堆肥過程對雌激素的降解效果，雌激素去除率約96.13%。

3 結(jié)論

（1）牛糞中雌激素以結(jié)合態(tài)雌激素為主，其中主要為葡糖苷酸鹽結(jié)合態(tài)。

（2）結(jié)合態(tài)雌激素在堆肥初期（0～10 d）首先被微生物轉(zhuǎn)化為以E1 為主的自由態(tài)雌激素，再進(jìn)一步降解。其中，硫酸鹽結(jié)合態(tài)相較于葡糖苷酸鹽結(jié)合態(tài)在環(huán)境中更加穩(wěn)定。

（3）目標(biāo)雌激素（除NP 外）在堆肥過程中能有效降解，NP 的殘留率為48.84%。但堆肥70 d 后仍有8種雌激素被檢出，EEQ為75.18 μg·kg-1，最終可能經(jīng)糞肥還田過程將雌激素排放至土壤環(huán)境，并進(jìn)一步經(jīng)地表徑流污染水生環(huán)境，造成生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。