補(bǔ)骨生髓方對(duì)去勢(shì)骨質(zhì)疏松大鼠Smad/ERK信號(hào)通路的影響

孫凱 魏戌* 謝雁鳴 張平 王源 章軼立 唐彬 陳琳

1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院，北京 100102 2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100700 3.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種全身骨代謝性疾病，其主要特征是骨量減少及骨微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，伴隨骨強(qiáng)度下降、骨脆性增加及骨折危險(xiǎn)性增加等特點(diǎn)[1]。隨著人口老齡化社會(huì)的到來，OP已成為各國(guó)常見的嚴(yán)重危害人們健康的慢性疾病之一[2-4]，尤其是骨質(zhì)疏松導(dǎo)致的椎體骨折嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，并增加了死亡率[5-6]。近年來，以MAPK/ERK、Smad為代表的信號(hào)通路及靶點(diǎn)是研究OP發(fā)生機(jī)制與效應(yīng)機(jī)制的熱點(diǎn)。

Smad4、ERK 等蛋白在成骨細(xì)胞的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，能夠參與成骨細(xì)胞的分化、增殖和凋亡等，尤為重要的是，ERK蛋白磷酸化能通過影響Smad蛋白的表達(dá)從而影響Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的效應(yīng)和成骨細(xì)胞的分化，其可能是治療OP的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)[7-10]。本研究的補(bǔ)骨生髓方臨床療效確切，臨床顯效率和總有效率分別為46%和82%[11]；前期基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)表明其可以顯著提高去勢(shì)大鼠OP(低轉(zhuǎn)換型)模型的骨密度，具有雌激素、雄激素樣作用及促性腺激素樣作用等[12]，但其對(duì)成骨細(xì)胞作用的關(guān)鍵信號(hào)通路和效應(yīng)靶點(diǎn)機(jī)制卻尚未闡明。因此，本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，擬建立去勢(shì)OP動(dòng)物模型并探討補(bǔ)骨生髓方對(duì)去勢(shì)骨質(zhì)疏松大鼠Smad/ERK信號(hào)通路的影響，以期為今后的研究提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)雄性大鼠，每只體重為250 g左右，10個(gè)月齡，共30只，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心技術(shù)有限公司(許可證號(hào)：SCXK(京) 2016-0006)，由獲得資格認(rèn)可的人員標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)于中國(guó)科學(xué)院自動(dòng)化研究所動(dòng)物房。實(shí)驗(yàn)室為SPF級(jí)，濕度48%左右，溫度25 ℃左右，大鼠自由進(jìn)食、進(jìn)水，定時(shí)更換滅菌墊料。

1.1.2藥物及試劑：(1)補(bǔ)骨生髓方的藥物組成：狗脊10 g，三七3 g，人參6 g等，藥材來源于康美藥業(yè)股份有限公司，經(jīng)鑒定均為合格產(chǎn)品。(2)相關(guān)試劑：乙醇(北京市化工廠，規(guī)格：500 mL，批號(hào)：20120507)；EDTA(北京市化工廠，規(guī)格：250 g，批號(hào)：20120418)；二抗(德國(guó)DAKO公司，規(guī)格：15 mL，批號(hào)：10063211)；DAB(德國(guó)DAKO公司，規(guī)格：5 mL，批號(hào)：00080066)；一抗(ERK1/2北京市博士德生物技術(shù)有限公司，規(guī)格：0.2 mL，批號(hào)：BM4326)；一抗(p-ERK1/2北京市博奧森生物技術(shù)有限公司，規(guī)格：0.2 mL，批號(hào)：Bs-3016R)；一抗Smad4(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，規(guī)格：0.1 mL，批號(hào)：bs-0585R)等。

1.1.3主要實(shí)驗(yàn)儀器：BX51顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；Ti-U(TE2000-S)型倒置顯微鏡(日本Nikon株式會(huì)社)；EG1150H包埋機(jī)(德國(guó)LEICA公司)；RM2235切片機(jī)(德國(guó)LEICA公司)；H I1 210 攤片機(jī)(德國(guó)LEICA公司)等。

1.2 方法

1.2.1分組與造模：按照隨機(jī)數(shù)字表的方法將大鼠分成2組：正常對(duì)照組6只，造模組24只。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始造模，造模組采取去性腺法(摘除睪丸法)建立OP實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。摘除睪丸法(ORX)方法：在麻醉下(0.3%的戊巴比妥鈉)施行無菌手術(shù)，取仰臥位固定，腹部去毛暴露術(shù)野，以75%的酒精及碘酊消毒，腹部正中切口進(jìn)入腹腔，完整摘除雙側(cè)睪丸后逐層縫合。切口縫合后，外部敷以消炎粉。大鼠造模過程順利，未出現(xiàn)意外死亡。摘除雙側(cè)睪丸術(shù)后2個(gè)月再將造模組大鼠隨機(jī)分為4組：模型組、補(bǔ)骨生髓方高劑量組、補(bǔ)骨生髓方中劑量組、補(bǔ)骨生髓方低劑量組，每組6只。

1.2.2給藥方案：補(bǔ)骨生髓方煎藥方法：將中藥飲片放入容器內(nèi)，加入適量純凈水，浸泡水面沒過藥材3 cm，充分浸泡1 h，通過液體真空濃縮煎藥機(jī)進(jìn)行煎煮，40 min后瀝出藥汁至清潔容器；再次加入適量純凈水煎煮40 min后倒渣取汁，將兩次煎煮藥汁混合，80 ℃水浴箱濃縮后，保存于4 ℃冰箱備用。造模成功后補(bǔ)骨生髓方高、中、低劑量組分別以生藥13.46 g/(kg·d)、6.73 g/(kg·d)、3.36 g/(kg·d)灌胃給藥，每只每日給藥一次，連續(xù)給藥2個(gè)月。正常對(duì)照組和模型組去勢(shì)大鼠按照同樣的方法灌服等量體積的蒸餾水。

1.2.3取材及染色：灌胃給藥結(jié)束后，根據(jù)大鼠的體重用戊巴比妥鈉進(jìn)行腹腔注射麻醉。然后迅速處死各組大鼠，取大鼠腰椎(L1-L4)及右側(cè)股骨，采用雙能X線骨密度測(cè)量?jī)x檢測(cè)骨密度；取右側(cè)脛骨，制作石蠟切片，用于免疫組織化學(xué)染色。染色步驟：將切片脫蠟放入蒸餾水中，用PBS洗2～3次各5 min后進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS洗2～3次，每次各5 min，3%的H2O2孵育10 min，PBS再?zèng)_洗2～3次，每次5 min，加入一抗(1∶100稀釋)，在一抗作用下37 ℃ 2 h取出，PBS洗3次，每次各5 min，滴加二抗，在二抗作用下37 ℃ 1 h取出，PBS洗3次，每次各5 min，DAB顯色5 min，PBS沖洗，運(yùn)用哈瑞蘇木素復(fù)染色，分色，返藍(lán)，脫水，最后封片，鏡檢。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 骨密度測(cè)定

與正常對(duì)照組相比，補(bǔ)骨生髓方低劑量組及模型組的大鼠腰椎骨密度、右側(cè)股骨骨密度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，補(bǔ)骨生髓方高劑量組、中劑量組的腰椎骨密度、右側(cè)股骨骨密度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而低劑量組腰椎骨密度、右側(cè)股骨骨密度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1各組大鼠骨密度比較

Table1Comparison of bone mineral density of rats in each group

組別腰椎骨密度(g/m2)右側(cè)股骨骨密度(g/m2)正常對(duì)照組(n=6)0.1913±0.02240.2178±0.0160模型組(n=6)0.1471±0.0157?0.1758±0.0141?補(bǔ)骨生髓方低劑量(n=6)0.1641±0.0082?0.1809±0.0180?補(bǔ)骨生髓方中劑量(n=6)0.1713±0.0146■0.1980±0.0108■補(bǔ)骨生髓方高劑量(n=6)0.178±0.0215■0.2067±0.019■

注：與正常對(duì)照組相比，*P<0.05；與模型組相比，■P<0.05。

2.2 HE染色

從HE染色發(fā)現(xiàn)，各組大鼠骨結(jié)構(gòu)均有不同程度的變化，正常對(duì)照組大鼠骨小梁排列緊密，間距較小，分布相對(duì)均勻，且互相連接成致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。而模型組去勢(shì)大鼠的骨小梁結(jié)構(gòu)排列較稀疏，間距增大且分布不勻稱，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)連接不緊密。補(bǔ)骨生髓方各中藥干預(yù)組的骨小梁結(jié)構(gòu)均存在不同程度的變化，以高劑量組最為明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠HE染色(×400倍)A：正常對(duì)照組；B：模型組；C：補(bǔ)骨生髓方高劑量組；D：補(bǔ)骨生髓方中劑量組；E：補(bǔ)骨生髓方低劑量組。Fig.1 HE staining (×400). A: Normal control group; B: Model group; C: High-dose group of Bu Gu Sheng Sui decoction; D: Middle-dose group of Bu Gu Sheng Sui decoction; E: Low-dose group of Bu Gu Sheng Sui decoction.

2.3 免疫組織化學(xué)染色

2.3.1補(bǔ)骨生髓方對(duì)OP大鼠ERK蛋白表達(dá)的影響：與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠ERK蛋白的表達(dá)差異有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組進(jìn)行對(duì)比，補(bǔ)骨生髓方高劑量組與中劑量組表達(dá)差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而低劑量組與模型組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2、圖2。

表2補(bǔ)骨生髓方對(duì)OP大鼠ERK蛋白表達(dá)的影響

Table2Effect of Bu Gu Sheng Sui decoction on ERK protein expression in OP rats

組別OD值正常對(duì)照組(n=6)0.3160±0.0188模型組(n=6)0.2584±0.0298?補(bǔ)骨生髓方低劑量(n=6)0.2691±0.0104補(bǔ)骨生髓方中劑量(n=6)0.2870±0.0162■補(bǔ)骨生髓方高劑量(n=6)0.2996±0.0254■

注：與正常對(duì)照組相比，*P<0.05；與模型組相比，■P<0.05。

圖2 補(bǔ)骨生髓方對(duì)OP大鼠ERK蛋白表達(dá)的影響 A：正常對(duì)照組；B：模型組；C：補(bǔ)骨生髓方高劑量組；D：補(bǔ)骨生髓方中劑量組；E：補(bǔ)骨生髓方低劑量組。Fig.2 Effect of Bu Gu Sheng Sui decoction on ERK protein expression in OP rats. A: Normal control group; B: Model group; C: High-dose group of Bu Gu Sheng Sui decoction; D: Middle-dose group of Bu Gu Sheng Sui decoction; E: Low-dose group of Bu Gu Sheng Sui decoction.

2.3.2補(bǔ)骨生髓方對(duì)OP大鼠p-ERK蛋白表達(dá)的影響：與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠p-ERK蛋白的表達(dá)降低，差異有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組進(jìn)行比較，補(bǔ)骨生髓方高劑量組表達(dá)差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，中劑量組也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而低劑量組與模型組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3、圖3。

表3補(bǔ)骨生髓方對(duì)OP大鼠p-ERK蛋白表達(dá)的影響

Table3Effect of Bu Gu Sheng Sui decoction on p-ERK protein expression in OP rats

組別OD值正常對(duì)照組(n=6)0.5247±0.0903模型組(n=6)0.3573±0.0388?補(bǔ)骨生髓方低劑量(n=6)0.3724±0.0374補(bǔ)骨生髓方中劑量(n=6)0.4247±0.0673■補(bǔ)骨生髓方高劑量(n=6)0.5685±0.0658■

注：與正常對(duì)照組相比，*P<0.05；與模型組相比，■P<0.05。

圖3 補(bǔ)骨生髓方對(duì)OP大鼠p-ERK蛋白表達(dá)的影響 A：正常對(duì)照組；B：模型組；C：補(bǔ)骨生髓方高劑量組；D：補(bǔ)骨生髓方中劑量組；E：補(bǔ)骨生髓方低劑量組。Fig.3 Effect of Bu Gu Sheng Sui decoction on p-ERK protein expression in OP rats. A: Normal control group; B: Model group; C: High-dose group of Bu Gu Sheng Sui decoction; D: Middle-dose group of Bu Gu Sheng Sui decoction; E: Low-dose group of Bu Gu Sheng Sui decoction.

2.3.3補(bǔ)骨生髓方對(duì)OP大鼠Samd4蛋白表達(dá)的影響：與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠Samd4蛋白的表達(dá)較低，差異有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組進(jìn)行比較，補(bǔ)骨生髓方高劑量組和中劑量組表達(dá)差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而低劑量組與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4、圖4。

表4補(bǔ)骨生髓方對(duì)OP大鼠Samd4蛋白表達(dá)的影響

Table4Effect of Bu Gu Sheng Sui decoction on Samd4 protein expression in OP rats

組別OD值正常對(duì)照組(n=6)0.4276±0.0303模型組(n=6)0.3071±0.0389?補(bǔ)骨生髓方低劑量(n=6)0.3245±0.0371補(bǔ)骨生髓方中劑量(n=6)0.3506± 0.0311■補(bǔ)骨生髓方高劑量(n=6)0.4101± 0.0331■

注：與正常對(duì)照組相比，*P<0.05；與模型組相比，■P<0.05。

圖4 補(bǔ)骨生髓方對(duì)OP大鼠Samd4蛋白表達(dá)的影響 A：正常對(duì)照組；B：模型組；C：補(bǔ)骨生髓方高劑量組；D：補(bǔ)骨生髓方中劑量組；E：補(bǔ)骨生髓方低劑量組。Fig.4 Effect of Bu Gu Sheng Sui decoction on Samd4 protein expression in OP rats. A: Normal control group; B: Model group; C: High-dose group of Bu Gu Sheng Sui decoction; D: Middle-dose group of Bu Gu Sheng Sui decoction; E: Low-dose group of Bu Gu Sheng Sui decoction.

3 討論

OP是一種發(fā)病相對(duì)隱匿、并發(fā)癥嚴(yán)重、致死率較高的疾病，世界衛(wèi)生組織已經(jīng)將其列為中老年三大疾病之一，在常見病中居第7位[1，13]。目前，OP目前仍然缺乏有效的治療手段，中醫(yī)藥在其防治方面具有一定的優(yōu)勢(shì)，中醫(yī)認(rèn)為其發(fā)生發(fā)展是多臟腑共同作用導(dǎo)致的，與腎、脾、肝等臟腑密切相關(guān)，其中腎虧為主要病因，肝虛乃關(guān)鍵因素，脾虛是重要病因[14-15]。補(bǔ)骨生髓方的組方思路來源于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，中醫(yī)理論認(rèn)為腎主骨生髓，肝主筋，脾主肌肉，本方補(bǔ)中有行，以補(bǔ)益為主，兼顧活血止痛。長(zhǎng)期臨床實(shí)踐表明補(bǔ)骨生髓方治療OP患者療效確切，但其治療的相關(guān)作用機(jī)制卻尚未明確，因而其臨床應(yīng)用與推廣受到限制。因此，在前期研究的基礎(chǔ)上，成功建立了去勢(shì)大鼠OP動(dòng)物模型并初步探討補(bǔ)骨生髓方對(duì)其關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響。

研究表明，促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase kinases，MAPK)信號(hào)通路在OP發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮出重要的調(diào)節(jié)作用[16]，而細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)通路是MAPK的主要信號(hào)通路之一，ERK信號(hào)通路是目前國(guó)內(nèi)外骨質(zhì)疏松領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，該信號(hào)通路是多數(shù)生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子調(diào)控細(xì)胞增殖、分化的重要途徑，在成骨分化以及骨骼的形成中都起到至關(guān)重要的作用[17-18]。Kim等[19]研究表明膠原蛋白水解物可以刺激ERK1/2的磷酸化，最終導(dǎo)致成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)分化和增殖，口服膠原蛋白水解物后，去勢(shì)大鼠腰椎骨密度明顯增加；Konosuke Nakayama等[9]發(fā)現(xiàn)ERK信號(hào)通路通過干擾Smad1的轉(zhuǎn)移活性抑制BMP信號(hào)的傳導(dǎo)，ERK可能是通過磷酸化反應(yīng)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性調(diào)控成骨細(xì)胞的分化；激活后的ERK信號(hào)通路可以轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，從而對(duì)細(xì)胞的多種生理功能發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，如進(jìn)入核內(nèi)促進(jìn)血清反應(yīng)因子磷酸化，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性[20]。ERK蛋白的表達(dá)水平能夠在某種程度上反映其信號(hào)通路的功能狀態(tài)。本研究通過免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)補(bǔ)骨生髓方高劑量組與中劑量組可以有效上調(diào)去勢(shì)大鼠ERK、p-ERK蛋白的表達(dá)，與模型組的表達(dá)差異顯著，表明ERK可能是補(bǔ)骨生髓方藥物作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。但ERK信號(hào)通路存在正反饋調(diào)控和負(fù)反饋調(diào)控兩種反饋調(diào)控機(jī)制，有研究認(rèn)為正反饋的調(diào)節(jié)主要是通過磷酸化雙特異性磷酸酶6(DUSP6)的Ser159和Ser197，使蛋白酶降解DUSP6，從而延長(zhǎng)ERK信號(hào)的持續(xù)時(shí)間[20-22]。本研究的結(jié)果可能是發(fā)揮正反饋調(diào)控作用，但具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。

Smad 4蛋白是共同通路型Smad(Co-Smad)中的一員，是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β家族中各種信號(hào)傳導(dǎo)過程共同的作用介質(zhì)，其可以在骨髓板的全區(qū)廣泛表達(dá)，Smad的表達(dá)與骨密度、骨形成及成骨細(xì)胞的數(shù)量密切相關(guān)。Smad信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制和缺陷都能有效地下調(diào)成骨細(xì)胞特異性的轉(zhuǎn)錄因子Runx2與Osterix的表達(dá)，信號(hào)通路的功能障礙通常會(huì)引起骨量和骨形成減少，導(dǎo)致OP的發(fā)生發(fā)展[23-25]。本實(shí)驗(yàn)研究表明補(bǔ)骨生髓方高劑量組和中劑量組與模型組相比，可以明顯提高去勢(shì)大鼠Smad4蛋白的表達(dá)，但低劑量組卻無明顯效果，可能與給藥的劑量等因素有關(guān)。趙小丹[26]研究表明卵巢去勢(shì)大鼠模型組Smad2/4的表達(dá)分布的范圍無明顯改變，但其表達(dá)強(qiáng)度卻明顯減弱，而中藥組則能增強(qiáng)其表達(dá)程度。武密山等[8]研究表明補(bǔ)腎方藥能使靶器官骨組織上調(diào)Smad4的表達(dá)從而有效改善骨密度，其認(rèn)為Smad4在mRNA層面的表達(dá)及蛋白水平的下調(diào)可能是OP發(fā)生的作用機(jī)制之一。本研究表明補(bǔ)骨生髓方可以有效上調(diào)Smad4的表達(dá)，且Smad與ERK信號(hào)通路密切相關(guān)，兩者共同參與由ERK蛋白磷酸化介導(dǎo)的Smad/ERK信號(hào)通路，這可能是其防治OP的重要原因之一。

OP的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，骨重塑的動(dòng)態(tài)和靜態(tài)的平衡受到諸多因素的干擾，多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)通路相互交織，通過抑制或激活一些關(guān)鍵環(huán)節(jié)的靶點(diǎn)來發(fā)揮調(diào)控作用。本研究?jī)H初步表明補(bǔ)骨生髓方能夠影響ERK、p-ERK、Smad4蛋白的表達(dá)，其可能是通過調(diào)控ERK蛋白磷酸化介導(dǎo)的Smad/ERK信號(hào)通路來發(fā)揮作用的，今后可以進(jìn)一步從基因?qū)用鎭砩钊胩接懫渥饔冒悬c(diǎn)及效應(yīng)機(jī)制。