續(xù)苓健骨湯含藥血清對MC3T3-E1細胞分化及增殖的影響

陳娟 陳賽楠 葉云金 李生強 謝麗華 黃景文 葛繼榮

福建省中醫(yī)藥研究院骨質(zhì)疏松證候基因組學重點研究室，福建 福州 350003

骨質(zhì)疏松癥 (osteoporosis，OP)是一種以骨量低，骨組織微結(jié)構損壞，導致骨脆性增加，骨折風險增高為特征的全身性骨病[1-2]。中醫(yī)學將骨質(zhì)疏松癥歸屬為“骨痿”“骨痹”“骨枯”等范疇，基于中醫(yī)“腎藏精”、“腎主骨”理論，腎精虧虛是本病發(fā)生的基本病機[3]。

續(xù)苓健骨方是課題組葛繼榮研究員在中醫(yī)理論指導下研發(fā)的治療骨質(zhì)疏松癥的經(jīng)驗方，在長期臨床實踐中發(fā)現(xiàn)具有療效明確、安全性好的特點。我們前期研究結(jié)果表明，續(xù)苓健骨方能顯著提高骨質(zhì)疏松模型大鼠的骨密度，增強模型大鼠的骨斷裂點的載荷和應力[4-5]。本研究以MC3T3-E1細胞為研究對象，觀察續(xù)苓健骨湯含藥血清對成骨細胞的增殖及分化的影響，從細胞水平探討續(xù)苓健骨方防治骨質(zhì)疏松癥的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：3月齡清潔級雄性SD大鼠40只，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，實驗動物許可證號：SCXK(滬)2007-0005，合格證編號：2007000530078。在福建省中醫(yī)藥研究院比較醫(yī)學實驗中心飼養(yǎng)[合格證號：SYXK (閩)2009-000]。各組動物在溫度20～22 ℃，相對濕度65%～70%、光照周期12 h/12 h 的環(huán)境中飼養(yǎng)，給予普通飼料、自由飲水和活動。

1.1.2實驗細胞：小鼠顱頂前成骨細胞亞克隆 14(MC3T3-E1 subclone14) 細胞株，購自中國科學院細胞庫(貨號GNM15)。

1.1.3實驗藥物：續(xù)苓健骨方組成：川續(xù)斷(安徽省本草國藥飲片有限公司，批號140708)、白術(安徽省本草國藥飲片有限公司，批號15030801)、陳皮(安徽省本草國藥飲片有限公司，批號150208)、赤芍(安徽省本草國藥飲片有限公司，批號150306)、紅花(安徽省本草國藥飲片有限公司，批號140420)和甘草(安徽省本草國藥飲片有限公司，批號150319)等12味中藥組成，每劑中藥總量為122 g，中藥材購由福建省醫(yī)藥公司。

1.1.4試劑：DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone試劑，Cat.# NYE0876)；胎牛血清 (Gibco公司，Cat.# 8122818)；茜素紅染料 (Alizarin red)、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、抗壞血酸磷酸鹽均購自美國Sigma公司；堿性磷酸酶測試盒(碧云天，Cat.# P0321)；CCK-8試劑盒(Dojindo, Cat.# CK04)；PI-RNase染色液(BD公司，Cat.#550825)；引物(Takara公司)；熒光定量PCR試劑盒(Takara公司，Cat.# DRR041 A)。

1.1.5儀器：CO2培養(yǎng)箱(Thermo Scientific，型號：HERAcell i)；核酸檢測儀Nano2100 (美國Agilent公司)；熒光定量PCR儀7500 FAST(美國ABI公司)；倒置相差顯微鏡(Leica，型號：DM40000 B)；全波長酶標儀(ThermoFisher Scientific)；流式細胞儀(BD 公司，F(xiàn)ACS Calibur)。

1.2 實驗方法

1.2.1實驗分組及續(xù)苓健骨湯含藥血清[6]的制備：3月齡SPF級雄性SD大鼠40只，隨機分成空白含藥血清對照組、續(xù)苓健骨湯低劑量含藥血清組[6.35 g/(kg.d)]、中劑量含藥血清組[12.7 g/(kg.d)]、高劑量含藥血清組[25.4 g/(kg.d)]，每組10只。續(xù)苓健骨湯的低、中、高劑量組，相當于成人臨床用量的0.5、1、2倍。適應性飼養(yǎng)7 d后，按上述劑量進行灌胃給藥，每天2次，連續(xù)7 d，對照組給予等量生理鹽水。末次給藥后1 h，腹腔注射戊巴比妥鈉30 mg/kg，麻醉。無菌條件下，進行腹主動脈采血5～6 mL。所得血液靜置1 h后，3 000 r/min離心l0 min，取上層血清。同組動物血清合并, 56 ℃水浴30 min滅活補體，0.22 μm微孔濾膜抽濾除菌，分裝，-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2細胞培養(yǎng)：MC3T3-E1細胞系以基礎培養(yǎng)基(MEM培養(yǎng)基+10%胎牛血清)培養(yǎng)，隔天換液，取對數(shù)生長期細胞用于本實驗。根據(jù)分組，分別添加體積分數(shù)為15%的不含藥血清進行干預。

1.2.3CCK-8細胞增殖實驗：細胞按2×103cells/100 μL密度接種于96孔培養(yǎng)板，每板設空白孔(僅有培養(yǎng)基，無細胞)，每組設3個復孔。加入不同濃度的含藥血清，培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL CCK8，37 ℃孵育3 h，檢測450 nm 波長吸收值。

1.2.4FACS檢測細胞周期：取對數(shù)生長期的細胞，加入0.25%胰蛋白酶消化后，冷PBS清洗2遍；加入70%的冷乙醇固定過夜；次日加入10 mg/L的RNA酶，37 ℃孵育30 min；加入500 μL PI(50 mg/L)，避光，4 ℃孵育30 min，流式細胞儀檢測細胞周期分布，并用ModFit LT V3.0 軟件進行細胞周期擬合，得到細胞各個時期的分布狀態(tài)，計算增殖指數(shù)(proliferation index，PI)和S期百分比(S phase fraction，SPF)。公式為：

PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100；SPF=S/(G0/G1+S+G2/M)×100%。

1.2.5ALP活性檢測：細胞用成骨誘導劑(50μg/mL抗壞血酸磷酸鹽，10 mmol /L β甘油磷酸鈉，10 nmol /L 地塞米松) 誘導，每3 d 換液1次，誘導7 d后，收集各組細胞，添加150 μL 0.2% Triton X-100裂解細胞，4 ℃，15 000 r/min離心15 min，收集上清液作為樣品；向96孔板內(nèi)添加50 μL底物、30 μL緩沖液和20 μL樣品，在微孔板震蕩器上充分振蕩1 min后，37 ℃孵育15 min；添加100 μL反應終止液，在微孔板震蕩器上充分振蕩1 min后，酶標儀測量405 nm處的吸光值；同樣方法進行空白(蒸餾水)對照和標準品的檢測，實驗數(shù)據(jù)取ALP活性與細胞蛋白總量的比值進行統(tǒng)計分析。

1.2.6茜素紅染色及定量：成骨誘導分化14 d，吸走成骨誘導分化完全培養(yǎng)基，用PBS洗2次；每孔加入2 mL 4%中性甲醛溶液，固定30 min；吸走中性甲醛溶液，用PBS洗2次；每孔加入1 mL茜素紅染液染3～5 min；吸走茜素紅染液，用PBS洗2次；每孔加入 1 mL 10%十六烷基吡啶，輕微搖晃 10 min 洗脫染料，吸取200 μL 加入96孔板中，分光光度計檢測 540 nm 處吸光值。

1.2.7實時熒光定量PCR(qRT-PCR)：提取總RNA。定量后，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄獲得定量 PCR模板。引物序列見表1，熒光定量PCR反應體系均如下：SYBR?Premix Ex TaqTMGC 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，dH2O 9.5 μL，cDNA 2 μL，25 μL體系。反應條件如下：①預變性：95 ℃ 10 s，②變性：95 ℃ 5s，③退火、延伸：60 ℃ 31 s，40個循環(huán)。采用ABI 7500 Real time PCR儀檢測各樣本中mRNA的表達情況。以Gapdh作為內(nèi)參照，每組均做3個重復，取均數(shù)。本實驗采用2-ΔΔCT法對基因進行半定量分析。

表1 引物序列Table 1 Primers for quantitative real time PCR

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差表示，多組間比較，方差齊的數(shù)據(jù)采用 One-way ANOVA 檢驗, 對于方差不齊數(shù)據(jù)的多組間比較，采用 Kruskal-WallisH檢驗，如統(tǒng)計具有差異時再以Bonferroni 法進行組間多重比較，定義P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 續(xù)苓健骨湯含藥血清對MC3T3-E1細胞增殖的影響

我們以不同濃度的續(xù)苓健骨湯含藥血清干預MC3T3-E1細胞，以空白含藥血清組為實驗對照，結(jié)果表明(表2)，與對照組比較，中、高劑量續(xù)苓健骨湯含藥血清組能明顯促進MC3T3-E1細胞的增殖(P<0.01)，而低劑量續(xù)苓健骨湯與對照組比較增殖速度無顯著性差異, 呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。

組別48 h(OD450)對照組0.466±0.030低劑量含藥血清組0.490±0.014中劑量含藥血清組0.730±0.050??高劑量含藥血清組0.890±0.180??

注：與對照組比較，**P<0.001。

2.2 續(xù)苓健骨湯含藥血清對MC3T3-E1細胞周期的影響

流式細胞術檢測細胞周期分布，以PI指數(shù)和SPF指數(shù)表示細胞群體的增殖狀態(tài)和DNA的合成速度。結(jié)果顯示：中、高劑量續(xù)苓健骨湯含藥血清兩組的SPF和PI指數(shù)均高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而低劑量續(xù)苓健骨湯含藥血清和對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(表3)。

組別SPF指數(shù)PI指數(shù) 對照組低劑量含藥血清組中劑量含藥血清組高劑量含藥血清組34.62±3.2533.66±1.1536.21±2.26?36.92±2.17?50.61±2.1253.17±1.66?54.57±1.17?56.28±1.57?

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.3 續(xù)苓健骨湯含藥血清促進MC3T3-E1細胞的成骨分化

與空白對照組相比，續(xù)苓健骨湯含藥血清干預7 d，可提高MC3T3-E1細胞合成分泌ALP的活性，且該作用以高劑量組最為顯著(P<0.01)，呈現(xiàn)一定的量效關系(圖1)。成骨誘導14 d 后，中、高劑量續(xù)苓健骨湯含藥血清組鈣結(jié)節(jié)的數(shù)量和體積明顯高于對照組，茜素紅半定量結(jié)果顯示其成骨能力強于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(圖2)。

圖1 不同劑量續(xù)苓健骨湯含藥血清對MC3T3-E1成細胞分化能力的影響(**P<0.01)Fig.1 The effect of Xuling strong bone decoction containing serum on the differentiation of MC3T3-E1 cells (**P<0.01)

2.4 續(xù)苓健骨湯含藥血清對MC3T3-E1細胞成骨分化基因的影響

qRT-PCR結(jié)果顯示，與空白對照組比較，中、高劑量續(xù)苓健骨湯含藥血清組成骨分化標志基因Runx2、OC、BMP2、Col1a1mRNA水平明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖2)。

圖2 不同劑量續(xù)苓健骨湯含藥血清對MC3T3-E1成細胞分化基因的影響(**P<0.01,***P<0.001)Fig.2 The effect of Xuling strong bone decoction containing serum on mRNAs of the differentiation-related genes of MC3T3-E1 cells (**P<0.01,***P<0.001)

3 討論

骨質(zhì)疏松的發(fā)病機制是骨形成與骨吸收呈負平衡，從而造成骨重建失衡引起的骨量丟失[7]。成骨細胞在骨重建過程中起關鍵作用，其數(shù)量與功能的變化與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展直接相關。因此，研究成骨細胞增殖、分化是防治骨質(zhì)疏松癥研究的重要課題之一[8]。本研究結(jié)果證實，中高劑量續(xù)苓健骨湯含藥血清能促進MC3T3-E1 細胞的增殖和細胞周期的進展，并且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。同時，中高劑量續(xù)苓健骨湯含藥血清能顯著上調(diào)骨形成相關基因Runx2、OC、BMP2、Col1a1的表達水平，提高堿性磷酸酶活性和促進MC3T3-E1細胞的礦化。說明，在一定濃度范圍內(nèi)，續(xù)苓健骨湯含藥血清對骨形成具有一定的促進作用。

中醫(yī)基于 “腎主骨藏精”理論，認為腎精虧虛是骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的基本病機[9-10]。中醫(yī)強調(diào)根據(jù)骨質(zhì)疏松癥的中醫(yī)證候遣方用藥，主要以補腎壯骨、補腎健脾、活血祛瘀理論來指導用藥，并從整體方面進行調(diào)節(jié)[11]。目前研究表明，補腎中藥具有促進成骨分化的作用[12]。張曉瑋等[13]研究表明，補腎健脾活血中藥能夠促進成骨細胞表達骨形狀發(fā)生蛋白的作用，從而能有效提高骨密度。陶樂維等[14]采用中藥血清藥物化學的方法，發(fā)現(xiàn)六味地黃丸對MC3T3-E1細胞有促增殖作用。左歸丸在體外可提高MC3T3-E1堿性磷酸酶的活性和礦化能力，從而促進成骨細胞分化[15]。在對其他補腎強骨復方的研究中也發(fā)現(xiàn)可以促進骨髓間充質(zhì)干細胞增殖和成骨分化[16]。續(xù)苓健骨方為課題組葛繼榮研究員在中醫(yī)理論指導下，經(jīng)過長期臨床試驗而研發(fā)的治療骨質(zhì)疏松癥的經(jīng)驗方，以補腎壯骨治本。本研究中我們也證實，續(xù)苓健骨含藥血清在體外能促進成骨細胞的增殖、骨形成和礦化能力。

除了中藥復方，單味中藥及有效成分的研究也證實補腎中藥具有促進骨形成的作用。續(xù)苓健骨方以川續(xù)斷、骨碎補為君藥，功取其補肝腎、強筋骨之效。劉介等[17]通過續(xù)斷總皂甙對成骨細胞的體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在一定濃度范圍內(nèi)續(xù)斷總皂甙可促進成骨細胞增殖、分化和提高細胞增殖指數(shù)，可能是該藥防治骨質(zhì)疏松的機制之一。在體外骨髓間充質(zhì)干細胞誘導為成骨細胞過程中，川續(xù)斷皂苷可促進骨髓間充質(zhì)干細胞向成骨細胞增殖和分化，從而具有促進骨形成的作用[18]。骨碎補含藥血清對乳鼠顱骨成骨細胞進行干預后，細胞增殖率、骨鈣素分泌量、鈣鹽沉積量明顯增加[19]。劉國巖等[20]研究表明骨碎補可以顯著促進大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖及成骨分化。因此，我們推測續(xù)苓健骨方對成骨細胞骨形成的促進作用，與補腎中藥川續(xù)斷、骨碎補的作用機制有關。

本研究發(fā)現(xiàn)續(xù)苓健骨方在體外具有促進成骨細胞增殖和分化的效應，這對續(xù)苓健骨方在骨質(zhì)疏松癥的臨床應用及基礎研究提供良好的鋪墊。由于中醫(yī)藥治療疾病具有多靶點多方面的優(yōu)勢和特點，強調(diào)從整體方面進行調(diào)節(jié)。續(xù)苓健骨方除了補腎治本外，兼有健脾、活血、行氣等治則，對于其抗骨質(zhì)疏松癥的其他方面的作用效應及分子機制，還有待進一步的深入研究。