核酸適配體在病原生物學(xué)中的應(yīng)用研究進(jìn)展

賀宏斌

核酸適配體（Aptamer，亦名核酸適體或適配子）是利用核苷酸之間嚴(yán)格的識別能力和親和力而設(shè)計的人工合成寡核苷酸，并通過指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技術(shù)篩選獲得［1，2］。核酸適配體的靶標(biāo)類型非常廣泛，包括離子、小分子、多肽、蛋白質(zhì)，乃至是整個活細(xì)胞、細(xì)菌、病毒和寄生蟲等。除了對靶標(biāo)物具有高特異性和高親和力外，核酸適配體還具有合成簡單、相對分子質(zhì)量低、化學(xué)穩(wěn)定性高、毒性低、免疫原性低、價格低廉、程序可控和便于體外修飾上多種功能基團(tuán)或材料等優(yōu)點。核酸適配體作為一種新型的識別分子，目前已發(fā)展成為一種備受關(guān)注的新型檢測和治療工具，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用，已廣泛應(yīng)用于病原檢測、藥物研發(fā)、疾病診斷和治療等方面，并且顯示出巨大的應(yīng)用潛力和廣闊的應(yīng)用前景。本文簡要介紹核酸適配體在病原生物學(xué)中的研究應(yīng)用。

一、核酸適配體的篩選

從隨機單鏈寡核苷酸文庫中進(jìn)行篩選，得到特異性很強的核酸適配體，主要依賴于SELEX這種體外篩選技術(shù)。1990年Ellington和Szostak［3］首次運用該技術(shù)成功地從隨機RNA文庫中篩選出能與有機染料特異性和親和性結(jié)合的隨機寡核苷酸，并命名為“aptamer”。核酸適配體的篩選過程主要包括以下步驟：一是將體外化學(xué)合成的隨機單鏈寡核苷酸文庫與靶標(biāo)混合、孵育，結(jié)合形成靶標(biāo)-核酸適配體復(fù)合物；二是運用離心、濾膜過濾、電泳等方法將未與靶標(biāo)結(jié)合的核酸分離、去除，以獲得與靶標(biāo)穩(wěn)定結(jié)合的核酸適配體；三是以此能與靶標(biāo)穩(wěn)定結(jié)合的核酸分子序列為模板進(jìn)行PCR擴增生成次級寡核苷酸文庫，再進(jìn)行下一輪的篩選。經(jīng)過反復(fù)多輪的篩選，淘汰未與靶標(biāo)結(jié)合或結(jié)合弱的DNA或RNA分子，隨著寡核苷酸庫中對靶標(biāo)物高親和性的不斷富集，最后從隨機文庫獲得能與靶標(biāo)物分子特異性結(jié)合具有高親和性的寡核苷酸鏈，即靶標(biāo)的核酸適配體。

傳統(tǒng)的SELEX方法操作繁瑣，篩選周期長，有時需要幾個月才能篩選出與靶標(biāo)具有特異性結(jié)合高親和性的核酸適配體。隨著SELEX等技術(shù)的快速發(fā)展，很多新型的篩選方法不斷涌現(xiàn)［5，6］，如在提高核酸適配體親和力的篩選方法、提高核酸適配體普適性的復(fù)合靶篩選方法、增加核酸適配體穩(wěn)定性篩選方法、縮短篩選周期的篩選方法、提高目標(biāo)核酸適配體篩選機率的篩選方法以及增大核酸適配體應(yīng)用范圍的更優(yōu)化的新型核酸適配體篩選方法做了大量工作。根據(jù)不同靶標(biāo)物的具體情況以及研究目的等選擇和發(fā)展合適的篩選方法，這些新的篩選技術(shù)和方法大大提高了篩選周期和篩選效率，增加其穩(wěn)定性和親和力，拓展了核酸適配體的應(yīng)用范圍，促進(jìn)了核酸適配體在各個領(lǐng)域中的研究應(yīng)用前景［7］。

二、核酸適配體在細(xì)菌方面的應(yīng)用

細(xì)菌致病菌的檢測，傳統(tǒng)方法主要包括形態(tài)檢查和生化方法，準(zhǔn)確性和靈敏性較高，但涉及的實驗較多，需要進(jìn)行細(xì)菌分離、培養(yǎng)及一系列生化反應(yīng)，操作繁瑣、需要時間較長且成本高。利用適配體人工模擬抗體的特性可用于檢測致病菌，近年已開展適配體用于結(jié)核分枝桿菌和傷寒桿菌檢測的研究探索，馬占忠和蔡江麗等分別以結(jié)核桿菌分泌蛋白ESAT-6和分泌蛋白64編碼基因作為靶標(biāo)，通過SELEX技術(shù)篩選獲得ESAT-6和分泌蛋白64抗體的核酸適配體，為研究開發(fā)結(jié)核病的診斷和治療試劑提供了平臺和基礎(chǔ)?；赟ELEX技術(shù)篩選的結(jié)核桿菌分泌蛋白64抗體適配體，進(jìn)一步建立了混合夾心ELISA檢測體系，應(yīng)用于230例臨床血清標(biāo)本的檢測，結(jié)果表明適配體混合夾心ELISA法用于結(jié)核病的血清學(xué)檢測具有一定的診斷價值［8］。潘勤等以IVB型纖毛結(jié)構(gòu)蛋白prepilS為靶標(biāo)，通過體外構(gòu)建一個含有30個隨機序列的單鏈DNA（ssDNA）文庫，PCR擴增為雙鏈DNA隨機文庫后，體外轉(zhuǎn)錄構(gòu)建RNA隨機文庫，經(jīng)8輪篩選獲得具有特異性高親和力prepilS蛋白的RNA適配體，該RNA適配體可顯著抑制傷寒桿菌侵入THP-1細(xì)胞，為開發(fā)預(yù)防、治療傷寒桿菌腸熱癥的新型藥物提供了基礎(chǔ)。

基于核酸適配體的可視化檢測方法具有靈敏度高、特異性強、分析時間短等優(yōu)點，核酸適配體的可視化檢測方法研究一直是近年的研究熱點。利用納米金在高鹽濃度下發(fā)生團(tuán)聚溶液顏色由紅色變?yōu)樽仙怂徇m配體吸附在納米金表面時，在高鹽條件下可保護(hù)納米金防止其發(fā)生團(tuán)聚，溶液顏色則不發(fā)生變化仍為紅色，這樣通過觀察顏色變化就可直接快速判斷結(jié)果，Wu WH等［9］開發(fā)的納米金-適配體生物傳感器檢測方法檢測大腸桿菌O157∶H7和鼠傷寒沙門氏菌，可在20 min或更短的時間內(nèi)檢測低至105菌落形成單位（cfu）／mL的靶標(biāo)菌，且特異性達(dá)100%，這種簡便不需要專門儀器的方法可望今后用于快速檢測細(xì)菌?；诩{米金結(jié)合放大信號技術(shù)的適配體傳感器具有更高的靈敏度，能檢測到更低濃度的致病菌。2015年Wu SJ等［10］基于磁性納米金與特定的適配體結(jié)合開發(fā)了一種簡單的比色傳感器系統(tǒng)用于檢測副溶血性弧菌，表面包覆著大量HRP的納米金與適配體連接作為信號放大器，用此方法檢測靶標(biāo)菌副溶血性弧菌的范圍為10～106cfu／mL，檢測限可達(dá)10 cfu／mL。Yuan等［11］利用生物素與親和素結(jié)合技術(shù)將適配體固定在微孔板上作為捕獲探針，用適配體識別結(jié)合納米金發(fā)展了一種比色傳感器方法檢測金黃色葡萄球菌，其檢測范圍為10～106cfu／mL，檢測限達(dá)9 cfu／mL；基于適配體識別結(jié)合酪胺信號放大技術(shù)Yuan等進(jìn)一步開發(fā)了一種金黃色葡萄球菌視覺檢測方法，檢測金黃色葡萄球菌范圍為10～107cfu／mL，檢測限可達(dá)8 cfu／mL。Yuan等［12］利用核酸適配體識別技術(shù)，結(jié)合納米金標(biāo)記和銀信號放大技術(shù)，建立了一種靈敏檢測鼠傷寒沙門氏菌的方法，可對樣品中的鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行快速檢測，其檢測范圍為10～106cfu／mL，檢測限則可達(dá)7 cfu／mL，這些基于核酸適配體的高敏感性和特異性的可視化檢測技術(shù)為現(xiàn)場快速檢測病原菌提供了新的方法。

利用抑制性適配體可直接結(jié)合于病原體靶物質(zhì)的表位，理論上可以阻斷病原體與生物機體的結(jié)合從而使疾病得到控制。在抑制性適配體方面也有初步的探索報道，楊清武等在成功構(gòu)建含40個隨機序列的單鏈DNA（ssDNA）文庫的基礎(chǔ)上，采用液相篩選方法經(jīng)過4輪篩選，以內(nèi)毒素（LPS）蛋白為靶標(biāo)，建立了從隨機單鏈DNA文庫篩選LPS寡核苷酸適配體的SELEX技術(shù)，為進(jìn)一步開展抑制性適配體用于臨床膿毒癥的防治研究提供了平臺和參考［13］。

三、核酸適配體在病毒方面的應(yīng)用

隨著SELEX新技術(shù)的發(fā)展，已篩選出針對逆轉(zhuǎn)錄酶、解螺旋酶和病毒衣殼蛋白等各類型病毒靶分子的適配體。這些可特異性的識別病毒的適配體可用于疾病診斷，而能識別并且能結(jié)合到病毒的特定部位上直接影響病毒的復(fù)制或抑制病毒的適配體可望用于疾病的防治和治療。Li等［14］以感染新加坡石斑魚虹彩病毒（Singapore grouper iridovirus，SGIV）的細(xì)胞為靶標(biāo)，篩選出高特異性和親和力的適配體Q3，并以此適配體替代抗體發(fā)展了一種適配體-ELASA檢測方法，該檢測方法靈敏度高，可檢測到低至2×104病毒感染的細(xì)胞數(shù)，并且當(dāng)與病毒感染細(xì)胞結(jié)合的時間短至1 min時仍可檢測到。Zhou等［15］利用特異性結(jié)合的適配體A10，開發(fā)了快速診斷赤點石斑魚神經(jīng)壞死癥病毒（Red spotted grouper nervous necrosis virus，RGNNV）的適配體sandwich ELASA方法，檢測病毒感染的細(xì)胞數(shù)可低至4×103。這些基于適配體的ELASA法不僅其檢測結(jié)果與PCR方法基本一致，而且適配體-ELASA法還具有操作簡便快捷、穩(wěn)定性強的優(yōu)點。Gopinath等［16］設(shè)計了以全病毒作為靶標(biāo)篩選核酸適配體的策略，篩選獲得針對A型流感病毒H3N2株血凝素HA區(qū)域的RNA適配體，可通過結(jié)合到靶毒株的HA蛋白上以有效地抑制HA介導(dǎo)的膜融合，從而抑制流感病毒的感染，其與HA的親和性比單克隆抗體約高15倍，可用于鑒定A型流感病毒的不同亞型。Jeon等報道以血凝素蛋白HA為靶標(biāo)，篩選了作用于HA受體結(jié)合區(qū)域的DNA適配體，體內(nèi)試驗結(jié)果表明適配體不僅抑制病毒的凝血能力，還可防止病毒結(jié)合和進(jìn)入細(xì)胞，從而抑制病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合阻斷流感病毒感染細(xì)胞。

核酸適配體在肝炎和艾滋病等嚴(yán)重影響人民身體健康的重大傳染病方面也有研究報道。Butz等［17］報道利用多肽適配體篩選系統(tǒng)以HBV核心抗原蛋白為靶標(biāo)篩選出了8個核酸適配體，其中適配體C1-1能有效抑制HBV病毒衣殼的形成，從而影響病毒的復(fù)制和病毒的生產(chǎn)，為開發(fā)具有特異性抗病毒作用的乙肝治療提供了新的基礎(chǔ)?；卺槍BV表面抗原的核酸適配體結(jié)合磁性分離和免疫化學(xué)發(fā)光技術(shù)報道也可用于HBsAg的檢測，其檢測靈敏度可達(dá)0.1 ng／mL。Tomai等以RNA聚合酶為靶標(biāo)篩選出針對HCV3a亞型的適配體，可抑制RNA聚合酶的活性，從而干擾HCV病毒的復(fù)制。Kikuchi等［18］報道篩選獲得分別可特異性結(jié)合HCV的內(nèi)核糖體位點（the internal ribosome entry site，IRES）區(qū)域Ⅱ和區(qū)域Ⅲ的適配體，可以抑制IRES依賴的轉(zhuǎn)錄，通過影響病毒mRNA的轉(zhuǎn)錄從而影響HCV病毒的復(fù)制，并且結(jié)合區(qū)域Ⅱ位點的核酸適配體的抑制效率比結(jié)合區(qū)域Ⅲ的要大約10倍。NS3為一種對HCV的復(fù)制和病毒擴增非常重要的多功能酶，F(xiàn)ukuda等篩選出了針對HCV NS3的適配體，在細(xì)胞水平上該核酸適配體顯示能抑制病毒的繁殖，這些能直接影響病毒的生成、病毒的轉(zhuǎn)錄復(fù)制或抑制病毒繁殖的核酸適配體可望為肝炎的治療提供了新的途徑。Yamamoto等［19］報道篩選獲得了能與HIV-1 Tat蛋白特異性結(jié)合的RNA適配體（RNATat），在細(xì)胞水平上可以使HIV-1的復(fù)制減少，可以明顯抑制HIV的活性，表明利用針對反轉(zhuǎn)錄激活因子蛋白的適配體，在病毒反轉(zhuǎn)錄的早期從細(xì)胞水平上可干擾HIV的復(fù)制和表達(dá)，并且毒性小，較少形成耐藥株，為艾滋病的治療提供了一種新的途徑。

四、核酸適配體在寄生蟲等方面應(yīng)用

寄生蟲病仍然是嚴(yán)重威脅著人類生命健康的疾病，特別是在欠發(fā)達(dá)國家和地區(qū)迫切需要研究探索新的診療方法和發(fā)展藥物的新策略。近年來研究報道篩選到分別可特異識別血吸蟲蟲卵［20］、錐蟲（T.cruzi）［21-23］、白蛉中的利什曼原蟲［24］、血液中的瘧原蟲［25，26］以及瘧原蟲感染的紅細(xì)胞［27］等各種適配體，為開發(fā)新型人體寄生蟲檢測及控制方法提供了新的途徑。

為獲得可特異識別血吸蟲蟲卵的核酸適配體，Long等［20］建立了一個含有1013～1016個單鏈DNA隨機文庫，在第一輪和第二輪篩選中用日本血吸蟲蟲卵作為陽性對照，以最大可能富集單鏈DNA序列，然后再用中華分支睪吸蟲蟲卵與寡核苷酸池混合溫育，以去除未結(jié)合的非特異性序列，通過重復(fù)多輪篩選，最后篩選獲得了兩個具有較強穩(wěn)定性并能與日本血吸蟲蟲卵表面特異性結(jié)合的核酸適配體LC6和LC15，可用于體外檢測日本血吸蟲的蟲卵，另外，結(jié)果表明LC15還可以識別肝腸組織中的日本血吸蟲蟲卵。這種能特異性結(jié)合于宿主組織內(nèi)血吸蟲蟲卵的核酸適配體，為探索建立一種新型血吸蟲病精準(zhǔn)診療方法提供了新的平臺，在此基礎(chǔ)上利用納米金等新材料及將SELEX技術(shù)與ELISA、定量PCR等結(jié)合，以及進(jìn)一步探索研究篩選具有高特異性和親和力的其他血吸蟲相關(guān)核酸適配體，不斷提高其特異性和親和性以及現(xiàn)場血吸蟲病檢測和診療的實用性，可望用于血吸蟲病的精準(zhǔn)診斷和療效考核，為探索開發(fā)血吸蟲病新型診療方法提供了新的途徑。

Ramos等［28，29］篩選鑒定了兩個能識別重組和內(nèi)源利什曼原蟲裂解物H2A和H3蛋白的適配體AptLiH2A1和AptLiH2A2，為進(jìn)一步探索開發(fā)新的利什曼原蟲診斷技術(shù)提供了新的方法。Guerra等［30］篩選獲得了三個針對利什曼原蟲poly（A）結(jié)合蛋白（PABP）具有較高特異性親和力的適配體ApPABP3、ApPABP7和ApPABP11，其中ApPABP11主要靶向利什曼原蟲poly（A）結(jié)合位點可影響蛋白質(zhì)的合成，可能為一種有希望的治療利什曼病新的途徑。

Hall等［21］使用多西環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)篩選了一種含有BRC蛋白基序的RNA適配體，在體內(nèi)可增加DNA損傷的敏感性和抑制布氏錐蟲（T.brucei）的增殖。利用傳送內(nèi)聚體如多肽適配體進(jìn)入細(xì)胞核可有效隔離靶標(biāo)并影響寄生蟲的存活，1μmol／L的針對錐蟲的RNA適配體能抑制50% ～70%錐蟲的入侵，提供了一種有希望的新的防控途徑。de Araujo FF等［31］報道基于適配體為主檢測疾病生物標(biāo)志物的新方法還有望用于新藥對美洲錐蟲?。–hagas）療效的評估。

CFIm25是一種能與poly（A）聚合酶相互作用的RNA結(jié)合蛋白，Pezet等［32］篩選了識別CFIm25的適配體，利用溶組織內(nèi)阿米巴的高吞噬能力，引入這些特異識別CFIm25的RNA適配體以阻斷內(nèi)源性CFIm25，這些內(nèi)聚體可能影響mRNA的翻譯、多聚腺苷酸化及其穩(wěn)定性，改變蛋白質(zhì)的合成而影響阿米巴的生存和增殖，以及其毒力特性，使其成為一種有前途的治療阿米巴的途徑。Cheng等［33］在小鼠外周血管中注射核酸文庫，利用體內(nèi)SELEX方法分離獲得了定位于大腦組織的適配體，表明適配體可以通過血液遷移到達(dá)特定器官或部位，提示類似的方法可用于篩選那些具有增強對寄主細(xì)胞或者寄生蟲本身滲透的適配體以用于寄生蟲病的防控。細(xì)胞穿透肽（Cell penetrating peptides，CPA）是短的陽離子多肽具有通過細(xì)胞膜的能力，Lehto等［34］利用其作為細(xì)胞內(nèi)運輸載體，證實CPA能促進(jìn)適配體進(jìn)入靶細(xì)胞，表明利用適配體-CPA結(jié)合物可將適配體轉(zhuǎn)運至靶標(biāo)寄生蟲或進(jìn)入寄生蟲感染的細(xì)胞以用于寄生蟲病的診斷和治療。

五、討論

與傳統(tǒng)抗體相比，核酸適配體具有特異性和穩(wěn)定性高、免疫原性低不易引起機體的免疫反應(yīng)、可批量生產(chǎn)成本低且各批次間無差異、可耐受較大范圍的酸堿度和溫度等易于存儲、易于修飾改造并能與各種載體結(jié)合、靶標(biāo)物范圍廣泛、可用于病原體檢測和疾病的診斷治療及藥物開發(fā)等眾多優(yōu)點。SELEX技術(shù)自問世之日起就一直成為了研究的熱點，并取得了令人鼓舞的進(jìn)展，核酸適配體已發(fā)展成為現(xiàn)代分子醫(yī)學(xué)中一種非常有希望的替代診療工具。在細(xì)菌、病毒及寄生蟲等生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究結(jié)果表明，適配體對疾病的診斷、治療以及藥物療效的評價等方面均具有重要作用。特別是一些SELEX衍生技術(shù)的發(fā)展，使適配體作為新型檢測、診斷和治療方法逐漸變?yōu)楝F(xiàn)實，其顯示出的優(yōu)勢被逐漸作為抗體試劑的替代或補充［35］，尤其是基于核酸適配體的可視化檢測方法具有簡單、快速、靈敏、肉眼可見等諸多優(yōu)勢，使其在檢測、診斷和治療等方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

要獲得對靶標(biāo)具有更高親和力和特異性的適配體在于不斷探索發(fā)展新的SELEX篩選技術(shù)?，F(xiàn)階段，篩選適配體技術(shù)的效率還不是很高，為提高檢測靈敏度和擴大應(yīng)用范圍，今后需要進(jìn)行更深入地開發(fā)和研究新型篩選技術(shù)，提高篩選效率，篩選出更多靶標(biāo)對應(yīng)的適配體，尤其需要進(jìn)一步關(guān)注非常關(guān)鍵的高親和力、高特異性適配體的篩選，提高適配體可視化的檢測范圍，加快核酸適配體在新型檢測、疾病精準(zhǔn)診斷與治療等方面的應(yīng)用［36，37］。目前核酸適配體熒光探針在生物醫(yī)藥的應(yīng)用剛剛起步，是一門新興學(xué)科和交叉領(lǐng)域，今后需要進(jìn)一步加強核酸適配體熒光探針在生物標(biāo)志物等方面的應(yīng)用研究，以便用于早期診斷，提高治療效率。

總之，核酸適配體在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力，隨著研究的深入發(fā)展適配體技術(shù)將發(fā)揮更加深遠(yuǎn)的影響和作用。今后需要進(jìn)一步開展適配體新型篩選技術(shù)的研究，研發(fā)安全有效的新型藥物，設(shè)計靶標(biāo)導(dǎo)向精準(zhǔn)的治療方案和措施，發(fā)展快速敏感的診斷試劑盒等，大力推動核酸適配體研究盡快走向現(xiàn)場和臨床實際應(yīng)用，系統(tǒng)探索開發(fā)利用核酸適配體新技術(shù)進(jìn)行疾病新型檢測、精準(zhǔn)診斷和治療方面的應(yīng)用研究，突破關(guān)鍵技術(shù)，發(fā)展具有原始創(chuàng)新和臨床應(yīng)用價值的疾病診療新方法和新技術(shù)，真正造福人類社會。