Rab3IP對(duì)食管癌患者預(yù)后的評(píng)估價(jià)值*

張嵐，周利娟，肖旭陽(yáng)

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 胸外科，遼寧 錦州 121000；2.錦州醫(yī)科大學(xué) 護(hù)理學(xué)院，遼寧 錦州 121000）

盡管近20年來(lái)癌癥治療技術(shù)得到了快速發(fā)展，但是食管癌患者預(yù)后依然不甚理想，我國(guó)食管癌 5年生存率僅為30%[1-3]。尋找有效指標(biāo)用于判斷患者預(yù)后具有重要意義。Rab3A 相互作用蛋白（Rab3A interacting protein,Rab3IP）首次在Hela 細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，與SSX2 共同錨定于細(xì)胞核，與腫瘤細(xì)胞的形成密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)胃癌、涎腺癌組織中Rab3IP 表達(dá)明顯上調(diào)，并且與患者不良預(yù)后密切相關(guān)[4-5]。本研究通過(guò)分析Rab3IP 表達(dá)與食管癌患者臨床資料的關(guān)系，探討Rab3IP 對(duì)食管癌預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年7月—2018年7月于錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院行食管癌根治性切除術(shù)的109例食管癌患者。所有患者經(jīng)術(shù)后病理學(xué)證實(shí)為食管癌，術(shù)前未行放化療或其他抗癌治療，臨床資料完整，有隨訪記錄。排除圍手術(shù)期嚴(yán)重并發(fā)癥或術(shù)中死亡患者。其中男性62例，女性47例；年齡45 ～79 歲，平均（61.17±7.15）歲?；颊吲R床分期參考國(guó)際抗癌聯(lián)盟與美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)食管癌病理分期標(biāo)準(zhǔn)（第8 版）[6]，Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ期患者分別有15、35 及59例。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者術(shù)前均被詳細(xì)告知手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)和受益，并自愿簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 所有患者術(shù)中同時(shí)切取癌組織及其癌旁組織，癌組織為距腫瘤切緣＜1 cm，病理證實(shí)為食管癌組織；癌旁組織為距腫瘤切緣≥2 cm，病理證實(shí)為正常食管組織。樣本組織取出后，立即置于液氮冷凍，再置于-80℃冰箱保存。

1.2.2 免疫組織化學(xué)法 取出樣本組織，自然融化，4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，制成5μm 切片。切片常規(guī)脫蠟、水化后，加入3%過(guò)氧化氫封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，微波加熱抗原修復(fù)，10%正常羊血清孵育20 min。滴加兔抗人RAB3IP 多克隆抗體（1 ∶100，美國(guó)Abcam 公司），4℃冰箱中過(guò)夜。次日磷酸鹽緩沖液振蕩清洗后滴加生物素標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白G 抗體（上海碧云天生物技術(shù)研究所，二抗），孵育1 h，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水、透明后，中性樹(shù)脂封片。由2 位病理科醫(yī)生閱片，染色半定量分析Rab3IP 表達(dá)，染色強(qiáng)度：無(wú)染色計(jì)0 分，淡黃色計(jì)1 分，棕黃色計(jì)2 分，棕褐色計(jì)3 分。陽(yáng)性細(xì)胞所占面積比：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)0 分，＞0%～10%計(jì)1 分，＞10%～50%計(jì)2 分，＞50%計(jì)3 分。將染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞所占面積比之積為最終染色評(píng)分，Rab3IP 評(píng)分≤3 分為低表達(dá)，＞3 分為高表達(dá)，并分別作為低表達(dá)組和高表達(dá)組。

1.2.3 Western blotting 從109 份食管癌組織和配對(duì)的癌旁組織中隨機(jī)選擇3 份進(jìn)行Western blotting 檢測(cè)。取約200 mg 樣本組織，冰浴上打成勻漿，4℃、12 000 r/min 離心10 min，取上清液，BCA 法檢測(cè)蛋白含量。加入上樣緩沖液將蛋白煮沸5 min 變性，取50μg 總蛋白SDS-PAGE 電泳分離，電泳后半干法轉(zhuǎn)移至PVDF，5%脫脂奶粉孵育2 h。PBST 洗膜后加入Rab3IP 抗體（1 ∶250，美國(guó)Abcam 公司），4℃孵育過(guò)夜。次日加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗（1 ∶1 000，武漢博士德生物工程公司）振蕩孵育2 h，回收二抗，TBST 洗膜3 次，用伯樂(lè)凝膠成像儀進(jìn)行條帶成像與分析。

1.2.4 資料收集 收集患者臨床資料，包括性別、年齡、腫瘤大小、病灶部位、分化程度、侵襲深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM 分期等。查閱患者隨訪資料，術(shù)后患者進(jìn)行常規(guī)隨訪，術(shù)后第1 ～2年每3 個(gè)月隨訪 1 次；術(shù)后3 ～5年每6 個(gè)月隨訪1 次。生存時(shí)間從手術(shù)當(dāng)天開(kāi)始計(jì)算，截止日期為死亡日期或末次隨訪日期，本研究隨訪截止日期為2018年7月31日。記錄患者總生存時(shí)間和無(wú)瘤生存時(shí)間。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 和GraphPad Prism 7.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)；Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，比較用Log-rank χ2檢驗(yàn)；影響因素分析用Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 食管癌組織和癌旁組織中Rab3IP 的表達(dá)

Rab3IP 表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，陽(yáng)性蛋白被染成棕色或棕褐色顆粒。食管癌組織Rab3IP 高表達(dá)率為70.6%（77/109），癌旁組織為52.3%（57/109），經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.747，P=0.005），癌組織高于癌旁組織。見(jiàn)圖1。

圖1 Rab3IP 在食管癌和癌旁組織中的表達(dá) （免疫組織化學(xué)×200）

2.2 Rab3IP 在食管癌和癌旁組織中的表達(dá)

食管癌組織Rab3IP 相對(duì)表達(dá)量為（0.718±0.018），癌旁組織為（0.236±0.013），經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=37.599，P=0.000），癌組織高于癌旁組織。見(jiàn)圖2。

圖2 Rab3IP 在食管癌和癌旁組織中的表達(dá)

2.3 兩組患者不同因素的Rab3IP 陽(yáng)性率比較

兩組患者不同腫瘤直徑、浸潤(rùn)深度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM 分期的Rab3IP 陽(yáng)性率比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.4 影響食管癌患者總生存時(shí)間的單因素和多因素分析

單因素和多因素分析顯示，Rab3IP 表達(dá)是影響食管癌患者術(shù)后總生存時(shí)間的獨(dú)立預(yù)后因素（P＜0.05）。Rab3IP 高表達(dá)組患者術(shù)后3年總生存率為42.1%，低表達(dá)組為70.6%，經(jīng)Log rank χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.027，P=0.025），低表達(dá)組高于高表達(dá)組。見(jiàn)表2和圖3A。

表1 兩組患者不同因素的Rab3IP 陽(yáng)性率比較例

2.5 影響食管癌患者無(wú)瘤生存時(shí)間的單因素和多因素分析

Rab3IP 表達(dá)是影響食管癌患者術(shù)后無(wú)瘤生存時(shí)間的獨(dú)立預(yù)后因素（P＜0.05）。Rab3IP 高表達(dá)組患者術(shù)后3年無(wú)瘤生存率為39.5%，低表達(dá)組為67.5%，經(jīng)Log rank χ2檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.275，P=0.007），低表達(dá)組高于高表達(dá)組。見(jiàn) 表3和圖3B。

表2 影響食管癌患者總生存時(shí)間的單因素和多因素分析參數(shù)

表3 影響食管癌患者無(wú)瘤生存時(shí)間的單因素和多因素分析參數(shù)

圖3 食管癌患者Rab3IP 表達(dá)的生存曲線

3 討論

Rab 蛋白屬于GTPase 的Ras 超家族蛋白成員，主要通過(guò)胞吞和胞吐的方式參與囊泡的運(yùn)輸，與細(xì)胞器之間的胞內(nèi)蛋白運(yùn)輸有關(guān)[7]。盡管Rab 蛋白的結(jié)構(gòu)高度保守，其功能特異性高，但是當(dāng)某些結(jié)構(gòu)發(fā)生突變時(shí)，可導(dǎo)致蛋白運(yùn)輸錯(cuò)誤，進(jìn)而誘發(fā)某些疾病，如Rab27a 的雙半胱氨酸異戊烯變成單半胱氨酸異戊烯時(shí)，使黑色素小體無(wú)法運(yùn)輸至高爾基體，導(dǎo)致格里塞利綜合征[8]。Rab 結(jié)構(gòu)突變不僅與基因遺傳病有關(guān)，還參與腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。有研究顯示，結(jié)腸癌組織Rab25 蛋白呈顯著高表達(dá)，敲低Rab11 表達(dá)可以抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖和侵襲表型，Rab2A 可部分逆轉(zhuǎn)miR-186-5p 誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞增殖能力減弱[9-10]。Rab3IP 是近年發(fā)現(xiàn)的Rab 蛋白家族新成員，其作為Rab 蛋白的主要激活蛋白，通過(guò)影響胞內(nèi)運(yùn)輸過(guò)程和細(xì)胞骨架重構(gòu)等參與多種疾病的發(fā)生[11]。

Rab3IP 與惡性腫瘤的發(fā)生有關(guān)，有研究表明，Rab3IP 可能通過(guò)調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程參與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，并介導(dǎo)腫瘤患者的不良預(yù)后[12]。HUR 等[13]發(fā)現(xiàn)Rab3IP 可被逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子LINE-1 激活，并參與結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移，Rab3IP 表達(dá)升高與結(jié)直腸癌的不良預(yù)后有關(guān)。本研究首次檢測(cè)了食管癌組織Rab3IP 的表達(dá)，結(jié)果顯示癌組織Rab3IP 表達(dá)明顯高于癌旁組織，并且Rab3IP 高表達(dá)與腫瘤直徑、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM 分期有關(guān)，提示高表達(dá)Rab3IP 可能使食管癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。目前對(duì)Rab 在腫瘤中的作用尚處于初步研究階段，有學(xué)者認(rèn)為Rab3IP 對(duì)囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控作用可能通過(guò)天然免疫調(diào)節(jié)影響腫瘤進(jìn)程的多個(gè)環(huán)節(jié)[14]。此外Rab 蛋白促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，為腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲提供了有利的微環(huán)境[15]。

有研究證實(shí)，Rab3IP 與SSX2 結(jié)合是介導(dǎo)腫瘤不良生物學(xué)行為的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[16]。有體外實(shí)驗(yàn)表明，SSX2通過(guò)ERα 信號(hào)通路調(diào)節(jié)Rab3IP 表達(dá)，使乳腺癌細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)侵襲表 型[17]。REN 等[18]發(fā)現(xiàn)胃癌組織和細(xì)胞Rab3IP 表達(dá)顯著上調(diào)，Rab3IP 高表達(dá)組術(shù)后5年總體生存率明顯低于低表達(dá)組。本研究進(jìn)一步分析了Rab3IP 表達(dá)與食管癌患者生存預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示，Rab3IP 表達(dá)是影響食管癌患者總體和無(wú)瘤生存時(shí)間的獨(dú)立預(yù)后危險(xiǎn)因素，Rab3IP 高表達(dá)的食管癌患者術(shù)后總體生存時(shí)間和術(shù)后無(wú)瘤生存時(shí)間明顯縮短，說(shuō)明Rab3IP 的表達(dá)可以作為食管癌患者生存預(yù)后的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

綜上所述，Rab3IP 在食管癌組織表達(dá)明顯上調(diào)，Rab3IP 高表達(dá)患者總體和無(wú)瘤生存時(shí)間縮短，檢測(cè)Rab3IP 表達(dá)有助于預(yù)測(cè)食管癌生存預(yù)后并指導(dǎo)臨床治療。但是本研究樣本量偏少，且僅為單中心研究，Rab3IP 表達(dá)與食管癌患者的關(guān)系仍需要大樣本證實(shí)。關(guān)于Rab3IP 發(fā)揮的腫瘤生物學(xué)效應(yīng)的具體作用機(jī)制仍需要深入研究。