lncRNA與肝癌相關(guān)性研究進(jìn)展

靳秀麗，李異玲

中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，遼寧 沈陽 110001

人類基因組中超過90%為轉(zhuǎn)錄組[1-3]，然而轉(zhuǎn)錄組中約有2萬個蛋白質(zhì)編碼基因，少于整個基因組序列的2%[4]。隨著二代測序技術(shù)的快速發(fā)展，成千上萬的長鏈非編碼RNA(long nonprotein coding RNA，lncRNA)在脊椎動物和非脊椎動物體內(nèi)被快速鑒別出來。lncRNA絕大多數(shù)位于細(xì)胞核內(nèi)，他們的生理學(xué)及病理學(xué)功能逐漸被關(guān)注。lncRNA功能廣泛，參與基因表達(dá)的各個方面到蛋白質(zhì)的翻譯及穩(wěn)定，參與細(xì)胞分化，器官形成。同時(shí)參與病理學(xué)改變，與多種疾病密切相關(guān)，如惡性腫瘤、心血管疾病、內(nèi)分泌疾病等。雖然一些lncRNA由RNA聚合酶Ⅲ產(chǎn)生，但大多數(shù)lncRNAs被證實(shí)像編碼基因一樣，也是由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄[5-6]，RNA聚合酶Ⅱ位于細(xì)胞核內(nèi)[7]，因此lncRNA主要在細(xì)胞核內(nèi)產(chǎn)生。lncRNA也經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄后編輯過程，包括5′加帽、選擇性拼接、RNA編輯、聚腺苷酸化，然而，不像編碼RNA，lncRNA不具有開放的閱讀框，不編碼蛋白質(zhì)。根據(jù)lncRNA在染色體上與蛋白編碼基因的相對位置分類，人類基因組中約有一半的lncRNA為基因間長鏈非編碼RNA(long intergenic nonprotein coding RNA，lincRNA)[8]。lncRNA在豐度、基因組定位、亞細(xì)胞定位及代謝特征、表觀遺傳調(diào)控、組織特異性等方面與mRNA不同[9]。lncRNA主要分布在細(xì)胞核、染色質(zhì)或亞核區(qū)域，在細(xì)胞質(zhì)中分布較少[10]。與mRNA相比，lncRNA合成效率低、降解效率高、剪接速度慢[9]。lncRNA比mRNA更大程度地限定在特定的細(xì)胞類型上，有進(jìn)化保守功能，有二級機(jī)構(gòu)，微同源區(qū)域，但有較小的整體序列相似性[11-13]。現(xiàn)在，lncRNA廣為人知，在不斷的研究和探索中，我們意識到非編碼基因組的重要作用。lncRNA通過與其他大分子相互作用，驅(qū)動許多重要的癌癥表型，這些大分子包括DNA、RNA及蛋白質(zhì)[14]。

1 lncRNA的調(diào)控功能

1.1lncRNA調(diào)節(jié)染色質(zhì)重塑lncRNA被發(fā)現(xiàn)能控制染色質(zhì)重塑復(fù)合物，改變核小體間隔[15]。在人類前列腺癌中，基因表達(dá)分析顯示,SWI/SNF 和 lncRNA SChLAP1角色對立，SChLAP1與染色質(zhì)重塑復(fù)合物SWI/SNF的亞基SNF5相互作用，阻止SWI/SNF與染色質(zhì)捆綁，結(jié)果導(dǎo)致全基因組基因活性不被抑制[15]。lncRNA還能與染色質(zhì)修飾劑非特異性結(jié)合,與轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，如lncRNA RMST通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子SOX2與它約一半的結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合促進(jìn)神經(jīng)元的分化[16]。

1.2lncRNA調(diào)節(jié)DNA甲基化許多l(xiāng)ncRNA與多梳復(fù)合物結(jié)合，促進(jìn)PRC占領(lǐng)基因甲基化位點(diǎn)，阻止DNA甲基化[16]。在HOXC簇內(nèi)轉(zhuǎn)錄的HOTAIR RNA與Polycomb抑制因子復(fù)合物2相互作用，導(dǎo)致HOXD位點(diǎn)的幾個基因的甲基化和沉默[17]。

1.3轉(zhuǎn)錄干擾許多l(xiāng)incRNA的轉(zhuǎn)錄與蛋白質(zhì)編碼基因的轉(zhuǎn)錄形式非常接近[18]，這些非編碼RNA更有可能產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄干擾作用，在一項(xiàng)研究中，約有一半的lincRNA被轉(zhuǎn)錄在蛋白質(zhì)編碼基因附近(<10 kb)[19]，所以這些非編碼RNA可能是研究鄰近基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的最佳物質(zhì)。

1.4轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)一些lncRNA通過與剪切因子相互作用影響剪切方式，例如lncRNA pnky與剪切因子PTBP1結(jié)合，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的剪切方式，涉及神經(jīng)形成[20]。lncRNA MALAT1是正確拼接的必要條件，它可以在核中分離剪接因子，進(jìn)一步調(diào)節(jié)剪接效率[21]。

1.5lncRNA調(diào)節(jié)RNA代謝這是一個新興的主題，lncRNA在mRNA的穩(wěn)定性控制、剪接和翻譯等方面起重要作用，lncRNA STAU1通過在選擇的mRNAs 3′UTR中與雙鏈RNA相互作用，介導(dǎo)mRNA的衰變。最近有報(bào)道確認(rèn)了lncRNA在維持基因組穩(wěn)定性方面的作用，lncRNA NORAD被證明對染色體穩(wěn)定性有深遠(yuǎn)影響，NORAD從目標(biāo)mRNA中分離出PUMILIO蛋白，PUMILIO蛋白通過降低mRNA的穩(wěn)定性和翻譯能力，對mRNA進(jìn)行負(fù)調(diào)控[14]。lncRNA還能被加工裂解產(chǎn)生小RNA，如miRNA、piRNA等。一些lncRNA還能與小RNA通過堿基配對來調(diào)節(jié)小RNA的活動,如lncRNA可以與miRNA對應(yīng)的靶基因mRNA相互作用, 競爭性地抑制miRNA活性,影響基因表達(dá)[22]。

1.6組蛋白修飾組蛋白修飾復(fù)合物與lncRNA相互作用的1個重要例子是異染色質(zhì)修飾蛋白PRC2，來自于哺乳動物X染色體失活(XI)的研究。X染色體失活特異轉(zhuǎn)錄本(Xist)是X染色體失活中心內(nèi)鑒定出的第1個關(guān)鍵的XI調(diào)控基因，Xist與lncRNA RepA協(xié)同包裹X染色體并募集PRC2，建立H3K27me3引起X染色體失活[23-25]。

1.7作為蛋白質(zhì)和RNA的誘餌lincRNA可通過分離作用抑制蛋白質(zhì)、mRNA和miRNA的活性,如lincRNA Gas5通過形成一種雙鏈結(jié)構(gòu)，結(jié)合糖皮質(zhì)激素受體的DNA結(jié)合域，模擬糖皮質(zhì)激素反應(yīng)素，這種相互作用阻止糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合其靶基因，阻止轉(zhuǎn)錄激活[9]。

1.8編碼微肽有研究報(bào)道一些lncRNA的位點(diǎn)可以發(fā)生改變，產(chǎn)生更小的RNA或重新獲得編碼能力，產(chǎn)生微肽。廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院晏光榮組發(fā)現(xiàn)一個名為lncRNA HOXB-AS3的基因，編碼產(chǎn)生一個53個氨基酸的保守多肽，并證實(shí)了該多肽能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長、克隆形成和侵襲轉(zhuǎn)移，豐富了對lncRNA作用方式和功能機(jī)制的認(rèn)識[26]。

2 lncRNA在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的調(diào)控作用

肝癌作為最常見的惡性腫瘤之一，有著較高發(fā)病率及死亡率，嚴(yán)重威脅人類的健康，給社會及醫(yī)療帶來沉重的負(fù)擔(dān)。目前對于肝癌的早期診斷方法仍極為有限，肝癌的治療及預(yù)后不甚理想。隨著二代測序技術(shù)的發(fā)展，人們逐漸發(fā)現(xiàn)體內(nèi)含有的非編碼RNA發(fā)揮重要的功能。lncRNA已經(jīng)被證實(shí)與肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲及預(yù)后密切相關(guān)，可作為致癌基因誘發(fā)肝癌發(fā)生，加速肝癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移。lncRNA有望成為肝癌新的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，針對lncRNA的研究將為肝癌或肝病患者帶來新希望。

2.1lncRNA-ATB促進(jìn)肝癌的轉(zhuǎn)移細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長因子β被發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞癌細(xì)胞中誘導(dǎo)lncRNA-ATB過表達(dá)，在上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中，lncRNA-ATB競爭性地結(jié)合miR-200激活了ZEB1和ZEB2的表達(dá)，ZEB1和ZEB2與白細(xì)胞介素-11 mRNA的相互作用增強(qiáng)了Stat3信號，促進(jìn)肝細(xì)胞癌轉(zhuǎn)移，加速器官受累等[14,27]。

2.2lncRNAHULC影響肝癌的增殖侵襲和預(yù)后與正常肝組織相比，lncRNA HULC在肝癌中表現(xiàn)出高表達(dá)水平，在埃德蒙森等級分類中，高級別的癌癥中HULC的表達(dá)水平更高，并與疾病侵襲相關(guān)[28]。在肝癌中明顯上調(diào)的lncRNA HULC存在于肝細(xì)胞癌患者的血液中[29]。研究還發(fā)現(xiàn)HULC吸引幾個miRNA，如miR-372，導(dǎo)致靶基因即轉(zhuǎn)錄因子CREB的轉(zhuǎn)錄抑制，在HULC啟動子內(nèi)的CREB通過一個自動調(diào)節(jié)機(jī)制抑制miR-372的功能，支持在肝癌內(nèi)CREB介導(dǎo)的HULC表達(dá)上調(diào)，此外，HULC與乙肝病毒X蛋白的上調(diào)有關(guān)，乙肝病毒X蛋白是肝細(xì)胞癌發(fā)生的重要病因，也可增強(qiáng)HULC的表達(dá)[30]。研究還發(fā)現(xiàn)，HULC介導(dǎo)的腫瘤抑制因子P18的下調(diào)可促進(jìn)肝細(xì)胞癌的細(xì)胞增殖[31]。lncRNA HULC在肝轉(zhuǎn)移癌中過表達(dá)提示生存率低。上述研究支持HULC具有作為肝癌生物標(biāo)志物的潛能。

2.3肝癌中表達(dá)異常的lncRNAHOTTIP和lncRNAHOXABlncRNA HOTTIP和lncRNA HOXAB的表達(dá)上調(diào)與肝細(xì)胞癌的發(fā)展和預(yù)后相關(guān)[32]。具體作用機(jī)制尚不清楚。

2.4lncRNAHOTAIR促進(jìn)肝癌的發(fā)生LI等[33]研究證實(shí)，lncRNA HOTAIR通過對SETD2的下調(diào)來促進(jìn)人類肝癌干細(xì)胞的惡性生長。他們在18例人類肝癌組織中檢測到HOTAIR，與對應(yīng)的相同患者相鄰非癌組織進(jìn)行配對，進(jìn)行RT-PCR，結(jié)果顯示人肝癌組織中HOTAIR水平顯著高于配對的相鄰非癌組織。免疫組化實(shí)驗(yàn)顯示，在肝細(xì)胞癌組織中SETD2的表達(dá)與相鄰癌旁組織相比減少。綜上，在人類原發(fā)性肝癌中，HOTAIR上調(diào)表達(dá)與SETD2下調(diào)表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。他們的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，HOTAIR降低了CREB、P300、RNApoⅢ在SETD2啟動子區(qū)域的重新分配，從而抑制了SETD2的表達(dá)和磷酸化，使SETD2對基質(zhì)組蛋白H3的結(jié)合能力下降，觸發(fā)組蛋白H3的第36個賴氨酸的三甲基化降低，因此，H3K36me3-hMSH2-hMSH6-skp2復(fù)合物也隨之減少，這種復(fù)合物在染色質(zhì)上的含量隨之降低，可阻止錯配的DNA修復(fù)，降低了skp2的降解能力(skp2可降解老化的組蛋白，代之以新的組蛋白，對DNA修復(fù)極為重要)，老化的組蛋白H3與受損的DNA結(jié)合，損傷的DNA未被修復(fù)，引起微衛(wèi)星不穩(wěn)定和細(xì)胞周期相關(guān)基因的異常表達(dá)，可觸發(fā)肝細(xì)胞癌的發(fā)生[33]。

2.5lncRNACUDR促進(jìn)肝癌干細(xì)胞增殖，影響肝癌預(yù)后PU等[34]研究發(fā)現(xiàn),lncRNA CUDR協(xié)同CyclinD1，或協(xié)同PTEN的減少，可加速肝癌干細(xì)胞生長和肝臟干細(xì)胞在體內(nèi)、體外的惡性轉(zhuǎn)化，CUDR高表達(dá)的患者比低表達(dá)的患者預(yù)后更差。在大多數(shù)哺乳動物中，PTEN已被鑒定為人類肝癌中常見的腫瘤抑制因子之一，在腫瘤發(fā)展過程中，PTEN的突變和缺失會導(dǎo)致酶活性喪失，從而導(dǎo)致細(xì)胞增殖增加，死亡減少[35]。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)和癌非干細(xì)胞相比，CUDR轉(zhuǎn)錄水平在癌干細(xì)胞中顯著升高。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞中PTEN的減少可導(dǎo)致CUDR對CyclinD1的結(jié)合能力增強(qiáng)，絕緣體CTCF招募CUDR-CyclinD1復(fù)合物形成CUDR-Cyclin D1-絕緣體CTCF復(fù)合物，此復(fù)合物定位于c-myc基因啟動子區(qū)域，增加了癌基因c-myc的產(chǎn)生，c-myc可導(dǎo)致肝癌干細(xì)胞和肝細(xì)胞樣干細(xì)胞的惡性增殖[34]。

2.6lncRNA廣泛參與干細(xì)胞的維護(hù)和分化例如，lncTCF7是肝癌干細(xì)胞自我更新和腫瘤增殖所必需的。從機(jī)制上講，在TCF7啟動子區(qū)域由lncRNA TCF7招募來SWI/SNF復(fù)合物，以激活Wnt信號，維護(hù)肝癌干細(xì)胞的自我更新[36]。也體現(xiàn)了lncRNA在腫瘤生長和繁殖中的作用。

2.7lncRNANEAT1影響肝癌的發(fā)生和預(yù)后lncRNA NEAT1促進(jìn)肝癌的發(fā)生，且lncRNA NEAT1的高表達(dá)提示肝癌的預(yù)后差，現(xiàn)在已有幾個研究小組證實(shí)了lncRNA NEAT1是P53的靶基因，通過促進(jìn)表達(dá)致癌基因的細(xì)胞存活，使腫瘤在體內(nèi)發(fā)生，如激活鼠模型體內(nèi)的Kras，使細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)紊亂，細(xì)胞增殖失控而癌變[37-39]。

2.8lncRNAMT1DP為肝癌的抑制劑MT1DP的過表達(dá)減少細(xì)胞增殖和集落形成，增加肝癌細(xì)胞的凋亡，而敲低該lncRNA出現(xiàn)相反的作用，表明MT1DP起到腫瘤抑制劑的作用。研究還發(fā)現(xiàn)，Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)和Yes相關(guān)蛋白(YAP)能夠通過直接啟動子結(jié)合抑制lncRNA MT1DP的表達(dá)，F(xiàn)oxA1蛋白對YAP和Runx2表達(dá)起著積極的作用。從而證實(shí)，Rnux2和YAP通過依賴FoxA1而相互作用，抑制腫瘤抑制因子lncRNA MT1DP的表達(dá)，在肝癌細(xì)胞中起著促癌作用[40]。

2.9lncCAMTA1影響肝癌的發(fā)生和預(yù)后DING等[41]使用lncRNA微陣列分析，發(fā)現(xiàn)了一種新型lncRNA，稱之為lncCAMTA1，發(fā)現(xiàn)它在肝癌干細(xì)胞和肝細(xì)胞癌中均增加。體外和體內(nèi)功能實(shí)驗(yàn)顯示，lncCAMTA1的過表達(dá)促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、癌干細(xì)胞樣性質(zhì)和腫瘤發(fā)生，敲低lncCAMTA1的表達(dá)會抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖、癌干細(xì)胞樣性質(zhì)和腫瘤發(fā)生，肝細(xì)胞癌中l(wèi)ncCAMTA1高表達(dá)表明預(yù)后不良。從機(jī)制上，他們證明lncCAMTA1與鈣調(diào)蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活子1(CAMTA1)啟動子相關(guān)，誘導(dǎo)抑制染色質(zhì)結(jié)構(gòu)并抑制CAMTA1轉(zhuǎn)錄，lncCAMTA1和CAMTA1的表達(dá)在肝細(xì)胞癌組織中呈負(fù)相關(guān)。此研究提示，lncCAMTA1有望成為有效的診斷及預(yù)后標(biāo)志物和治療的靶點(diǎn)。

2.10lnc-DILC的抑癌作用WANG等[42]通過微陣列鑒定和實(shí)時(shí)PCR驗(yàn)證等在體外和體內(nèi)對lnc-DILC在肝癌干細(xì)胞中的作用進(jìn)行了評估。研究發(fā)現(xiàn)，lnc-DILC的減少顯著增強(qiáng)了肝癌干細(xì)胞的擴(kuò)展并促進(jìn)肝細(xì)胞癌的發(fā)生和進(jìn)展。數(shù)據(jù)表明，lnc-DILC介導(dǎo)了TNF-α/NF-κB信號傳導(dǎo)和IL-6/STAT3之間的交叉干擾。臨床研究也證實(shí)了肝細(xì)胞癌患者lnc-DILC的減少。 可見，肝細(xì)胞癌患者中l(wèi)nc-DILC的表達(dá)降低可能預(yù)示患者的早期復(fù)發(fā)和短期存活，突出其診斷、治療及預(yù)后評估價(jià)值。

目前，大多數(shù)藥物都表現(xiàn)出抑制的作用機(jī)制，然而在許多遺傳疾病中，在特定條件下，需要基因上調(diào)，如腫瘤抑制因子、生長因子、轉(zhuǎn)錄因子。lncRNA可以上調(diào)或下調(diào)基因表達(dá)和改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)。例如，神經(jīng)退行性疾病，至少在早期治療時(shí)可通過增強(qiáng)神經(jīng)保護(hù)生長因子活性來減緩病情[43]。其他臨床前研究也證實(shí)了以lncRNA為靶點(diǎn)的療效，例如，在小鼠MMTV-PYMT乳腺癌模型中，lncRNA Malat1可以促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，在此模型中，ASOs以Malat1為靶點(diǎn)，通過促進(jìn)囊性分化，增加細(xì)胞黏附，減少遷移，證明了其在體內(nèi)的治療效果[44]。成千上萬的lncRNA從基因組中被識別出來，它們在正常組織和來自同一器官的腫瘤組織之間的轉(zhuǎn)錄差異性，揭示了lncRNA可以作為腫瘤生物標(biāo)志物的巨大潛能[45-46]。

事實(shí)證明,lncRNA不是轉(zhuǎn)錄的廢物，而是正常發(fā)育所必需。目前只有極少部分的lncRNA的生物學(xué)功能得到闡述，對這些分子的作用方式仍然知之甚少。目前絕大多數(shù)針對lncRNA的研究基于體外分化系統(tǒng)進(jìn)行，許多發(fā)現(xiàn)仍缺乏體內(nèi)研究證據(jù)。分析lncRNA功能及作用模式比編碼RNA更復(fù)雜、更艱難。lncRNA通常具有高度的組織特異性，盡管其靶向基因調(diào)控機(jī)制尚不清楚，但不可否認(rèn)lncRNA具有潛在的診斷和治療價(jià)值。所以需要系統(tǒng)的方法來定位和描述lncRNA，必須建立各種遺傳模型系統(tǒng)以了解lncRNA的功能作用，需要大量工作來充分評估其作為治療靶位的潛力。lncRNA已經(jīng)被證實(shí)與肝癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，可作為致癌基因誘發(fā)腫瘤發(fā)生。相信不久的將來，lncRNA能為肝癌乃至肝病的診治帶來巨大的突破。