糞菌移植在腸道微生態(tài)相關(guān)疾病中的應(yīng)用

何文霞，劉 敏，李 強(qiáng)，王玉平，關(guān)泉林，周永寧

1.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院消化科，甘肅 蘭州 730000； 2.甘肅省胃腸病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院腫瘤外科

糞菌移植(fecal microbiota transplantation，F(xiàn)MT)是將健康供體的功能腸道微生物菌群移植到患者腸道內(nèi)，重建或恢復(fù)部分腸道菌群穩(wěn)態(tài)，治療與腸道微生物菌群失調(diào)有關(guān)的疾病。在東晉《肘后備急方》中，已有關(guān)于加工后的糞便用于疾病治療的記載[1]。相對(duì)于傳統(tǒng)口服益生菌治療，F(xiàn)MT對(duì)于腸道菌群改變持續(xù)的狀態(tài)更持久，GREHAN等[2]發(fā)現(xiàn),當(dāng)糞菌菌群一次完整移植后可在患者體內(nèi)保持24周，而一次益生菌口服后，2周后在腸道內(nèi)就已無(wú)法檢測(cè)到。FMT可以避免上消化道消耗、患者依存性差的問(wèn)題，同時(shí)可以在短時(shí)間內(nèi)提高腸道菌群豐度，實(shí)現(xiàn)腸道微生態(tài)的快速重建。

1 FMT在疾病中的應(yīng)用

1.1復(fù)發(fā)性難辨梭狀芽孢桿菌感染(Clostridiumdifficileinfection，CDI) 復(fù)發(fā)性CDI是與抗生素使用相關(guān)的腸道CDI在腸道內(nèi)過(guò)度生長(zhǎng)所致的感染性腸道疾病,同時(shí)也是院內(nèi)偽膜性腸炎的常見(jiàn)原因之一，多表現(xiàn)為腹瀉、腹痛、毒血癥狀，少數(shù)患者可出現(xiàn)中毒性巨結(jié)腸癥、腸麻痹或腸穿孔等較為嚴(yán)重的并發(fā)癥。目前所采用的甲硝唑、萬(wàn)古霉素、甚至非達(dá)霉素治療次優(yōu)反應(yīng)較為常見(jiàn)，有多達(dá)30%的患者出現(xiàn)CDI抗生素治療后復(fù)發(fā)[3]，而FMT可一次性外源性引入足量糞菌，修復(fù)重建由抗生素導(dǎo)致的腸道菌群失衡。2013年以前關(guān)于CDI的FMT治療多為各種小系列文獻(xiàn)和病例報(bào)道，直至VAN NOOD等[4]關(guān)于CDI的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)證實(shí)了FMT重建腸道微生物穩(wěn)態(tài)對(duì)于CDI的臨床療效的可靠性，F(xiàn)MT遂于同年正式列入CDI的英國(guó)治療指南，2015年進(jìn)入美國(guó)胃腸學(xué)會(huì)(AGA)復(fù)發(fā)性CDI的臨床指南。

1.2炎癥性腸病(inflammatoryboweldisease，IBD)我國(guó)學(xué)者高雪姣等[5]通過(guò)將正常大鼠予以健康大鼠、潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)大鼠糞便灌腸，并用正常糞菌分泌的OMVs和UC糞菌分泌的OMVs共孵Caco.2細(xì)胞，證實(shí)了UC腸道細(xì)菌可分泌OMVs激活TLR4受體通路，從而下調(diào)腸道中可以保護(hù)腸道上皮及維持穩(wěn)態(tài)的CYP3A和P-gP的表達(dá)。在人體試驗(yàn)中，已有研究證實(shí)FMT可提高活動(dòng)性UC的臨床緩解率，且不良事件相對(duì)于對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且FMT逆轉(zhuǎn)了甲硝唑AFM單藥治療的持續(xù)性抗菌素相關(guān)的不良反應(yīng)，在抗菌腸道清潔的協(xié)同作用下，促進(jìn)了擬桿菌的合成[6-7]。但目前臨床數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)MT對(duì)于克羅恩病(Crohn’s disease,CD)的治療效果不佳，這可能與CD的發(fā)病部位位于全胃腸道、炎癥浸潤(rùn)深度有關(guān)。

1.3腸易激綜合征(irritablebowelsyndrome，IBS)IBS的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，近期TAP等[8-9]證實(shí),IBS患者腸道內(nèi)微生物菌群多樣性較正常健康人顯著下降，花月等[10]對(duì)12例腹瀉型IBS患者行FMT治療取得良好效果，而對(duì)便秘型IBS患者療效欠佳。有研究[11]證實(shí)，接受FMT治療后有90%的IBS患者排便困難和腹脹癥狀緩解，其中有60%的患者緩解期長(zhǎng)達(dá)9～19個(gè)月。

1.4便秘(constipation) 既往對(duì)于慢性便秘患者的治療主要為膳食結(jié)構(gòu)調(diào)整、富纖維素飲食、促進(jìn)胃腸動(dòng)力，我國(guó)學(xué)者李寧團(tuán)隊(duì)對(duì)FMT治療慢性便秘患者取得突破性成果，在隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)慢性便秘FMT的治愈率、改善率可分別達(dá)到36.7%、53.3%[12]，并對(duì)FMT技術(shù)加以改良，方便患者的長(zhǎng)期口服。

1.5代謝綜合征(metabolicsyndrome，MS) 目前的研究已證實(shí)，MS多以胰島素抵抗為病理生理基礎(chǔ)。而在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，高脂喂養(yǎng)小鼠腸道的緊密連接蛋白的基因表達(dá)下降，腸道通透性增加，并伴有低度炎癥反應(yīng)[13]，細(xì)菌可經(jīng)腸壁引起局部或全身低度慢性炎癥和胰島素抵抗。BROWN等[14]發(fā)現(xiàn)，非肥胖糖尿病(NOD)小鼠體內(nèi)含有誘發(fā)糖尿病的腸道微生物，糖尿病基因菌群可以通過(guò)抗生素暴露在生命早期被放大，移植益生菌后仍不能阻止其影響。而HARTSTRA等[15]將健康男性的糞便植入MS患者后，發(fā)現(xiàn)其對(duì)于胰島素的敏感性顯著增加，并可豐富其腸道菌群的類(lèi)型。

1.6慢性病毒性肝炎與肝性腦病肝臟通過(guò)腸-肝循環(huán)，吸收腸道的有害物質(zhì)，維持免疫激活功能，釋放抗菌物質(zhì)，分泌膽汁，促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，使有害物質(zhì)排出。在慢性肝炎時(shí)，腸道菌群環(huán)境發(fā)生改變[16]，CHOU等[17]發(fā)現(xiàn)，在幼齡鼠體內(nèi)，通過(guò)TLR4依賴(lài)通路，在幼齡鼠體內(nèi)形成HBV免疫耐受的通路，而成年小鼠由于腸道菌群的成熟刺激了肝臟的免疫，可使HBV快速清除。在肝性腦病時(shí),腸-肝循環(huán)進(jìn)一步受損，腸道通透性改變，有害物質(zhì)吸收增加，腸道細(xì)菌繁殖使自發(fā)性腹膜炎風(fēng)險(xiǎn)增加。WANG等[18]研究發(fā)現(xiàn)，接受大鼠FMT治療后，除了可以提高大鼠的認(rèn)知能力以外，可降低肝臟酶學(xué)指標(biāo)，提高腸道中緊密連接蛋白(Claudin-1、Claudin-6和Occludin)，從而降低腸道的通透性，并可以改善肝臟的Toll樣受體反應(yīng)。而在一篇關(guān)于FMT治療肝性腦病的病例報(bào)道中[19]也證實(shí)了連續(xù)的FMT可以改善認(rèn)知、降低血氨水平。

1.7其他疾病FMT的疾病治療也擴(kuò)展至帕金森病、慢性疲勞綜合征、自閉癥、多發(fā)性硬化癥、代謝相關(guān)疾病、兒童過(guò)敏性疾病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、抑郁等方面。但研究多集中于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，病案報(bào)道由于病例數(shù)少，缺乏病例對(duì)照研究，仍需要大量臨床試驗(yàn)進(jìn)一步探索。

2 FMT的操作方法

2.1供體的選擇現(xiàn)行的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)要求供體：(1)3個(gè)月內(nèi)無(wú)抗生素使用病史；(2)無(wú)IBD、IBS、慢性便秘等胃腸道疾病史及胃腸道惡性腫瘤或大的胃腸道手術(shù)史；(3)無(wú)自身免疫性或特異反應(yīng)性疾病，目前未接受免疫調(diào)節(jié)治療；(4)無(wú)MS、超重或肥胖(體質(zhì)量指數(shù)>25 kg/m2)或中-重度營(yíng)養(yǎng)不良；(5)無(wú)惡性疾病史、目前未接受抗腫瘤治療;(6)無(wú)神經(jīng)、精神疾病史。并要求符合上述標(biāo)準(zhǔn)的患者在4周內(nèi)行血清學(xué)和糞便檢測(cè)，排除HAV、HBV、HCV、HIV、梅毒、艱難梭菌、沙門(mén)菌、志賀菌、鼠疫耶爾、森菌等常見(jiàn)病原菌，鞭蟲(chóng)、隱孢子蟲(chóng)及其他寄生蟲(chóng)和蟲(chóng)卵感染[20]。

捐獻(xiàn)者可以是患者親屬、配偶，也可以是無(wú)親緣關(guān)系的健康捐贈(zèng)者。家屬作為供體時(shí)與患者有相似的飲食背景，移植時(shí)的病原體傳播及自身免疫疾病的可能性會(huì)大大降低。而無(wú)親緣關(guān)系的供體則與患者的腸道菌群差異性較大，有利于對(duì)患者原有腸道環(huán)境的重塑。既往研究顯示，F(xiàn)MT治療CDI時(shí)，親屬供體治療成功率為84%，而非親屬可達(dá)到93%[21]。但應(yīng)注意的是，F(xiàn)MT并無(wú)100%的成功率，最新一項(xiàng)MOAYYEDI等[22]所做的關(guān)于FMT治療UC隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)中，出現(xiàn)了患者只對(duì)6個(gè)供體糞便中的1個(gè)供體糞便敏感的情況。因此，供體的選擇對(duì)于FMT的成功具有重要意義。理想條件下，應(yīng)該是在移植前、移植中通過(guò)生物指標(biāo)或臨床指標(biāo)來(lái)判定供體的糞便是否有效，但目前尚無(wú)技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。OLESEN等[23]建立數(shù)字模型，建議通過(guò)“貝葉斯分配策略”遴選出最佳供體，但模型的有效性還需要大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.2患者準(zhǔn)備針對(duì)CDI患者，為抑制腸道內(nèi)的梭狀芽孢桿菌的生長(zhǎng)，患者在FMT前需行甲硝唑、萬(wàn)古霉索或非達(dá)霉素預(yù)灌注至少3 d，停用12～48 h再行FMT治療，針對(duì)其他疾病，不推薦抗生素預(yù)灌注治療，如近期有使用抗生素，需FMT術(shù)前3 d?？股亍Ｈ缃?jīng)上消化道移植，可予以質(zhì)子泵抑制劑口服，以提高菌液中的活菌數(shù)量，如經(jīng)下消化道移植，可行腸道清潔準(zhǔn)備，但也有報(bào)道稱(chēng)未經(jīng)腸道清潔的患者也有較高的移植成功率，因此在2016年歐洲FMT共識(shí)中，腸道清潔的證據(jù)質(zhì)量低、推薦強(qiáng)度弱[24]。為延長(zhǎng)糞液在腸道內(nèi)停留的時(shí)間，F(xiàn)MT當(dāng)天可予以服用減少腸蠕動(dòng)及分泌的藥物。在術(shù)前還應(yīng)完善感染學(xué)指標(biāo)檢測(cè)，簽署知情同意書(shū)，告知患者FMT的手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)及術(shù)后可能發(fā)生的急、慢性并發(fā)癥。

2.3移植菌液的制備在獲得供體糞便后盡快儲(chǔ)存和準(zhǔn)備，糞菌樣品應(yīng)≥30 g，先用生理鹽水稀釋、攪拌，再用濾網(wǎng)、紗布、過(guò)濾器過(guò)濾，除去不溶顆粒制備為混懸液，制備過(guò)程越短越好。如不能在6 h內(nèi)及時(shí)使用，可加入質(zhì)量濃度為100 g/L的甘油，并儲(chǔ)存于-80 ℃的環(huán)境內(nèi)，在需要使用時(shí)，可以在37 ℃的水浴中解凍后在6 h內(nèi)使用，但應(yīng)避免反復(fù)解凍或融化?？诜悍盅b冷凍膠囊也可達(dá)到同樣的臨床療效[25]，但儲(chǔ)配條件較為苛刻。目前糞菌智能化分離系統(tǒng)可替代人工分離菌液中的細(xì)菌、蟲(chóng)卵，獲得高純度化的菌群，提高分離效率。同時(shí)為進(jìn)一步簡(jiǎn)化操作，國(guó)外成立了Open Biome等多家“糞便銀行”，我國(guó)也在2015年建立中華糞菌庫(kù)(fecal microbiota transplantation bank，F(xiàn)mtBank)，旨在實(shí)現(xiàn)糞菌異地緊急救援治療，實(shí)現(xiàn)糞菌分配、制備、保存的標(biāo)準(zhǔn)化。

2.4移植途徑和位置選擇在移植途徑上，目前多采用經(jīng)上消化道(鼻飼管、電子胃鏡)、下消化道(結(jié)腸鏡、灌腸)、造瘺術(shù)(經(jīng)皮內(nèi)鏡下盲腸造口置管術(shù)、經(jīng)皮內(nèi)鏡胃造瘺術(shù))進(jìn)行。糞液通常由胃十二指腸鏡經(jīng)口咽部送至十二指腸降部，由腸鏡經(jīng)肛門(mén)送達(dá)回腸末端或盲腸。經(jīng)上消化道途徑，患者易出現(xiàn)惡心、嘔吐，菌液通過(guò)小腸可能破壞小腸微生物群平衡，但可以延長(zhǎng)移植的微生物群在腸道停留時(shí)間。結(jié)腸鏡的技術(shù)要求高，操作需充氣，部分患者因難以忍受可能在操作完畢后立即排便造成移植菌液的丟失，病情危重的患者可能無(wú)法配合腸鏡操作，但通過(guò)結(jié)腸途徑可直接觀察腸道病變。研究表明，上消化道FMT的臨床緩解率低于下消化道[26]，輕度不良事件高于下消化道，但嚴(yán)重并發(fā)癥則相反[27]。灌腸對(duì)技術(shù)要求低，但只對(duì)直腸、乙狀結(jié)腸病變效果好，對(duì)于直腸括約肌松弛的患者，有移植糞液保留的困難。造瘺術(shù)雖然可以方便多次糞便移植，降低結(jié)腸鏡檢查的風(fēng)險(xiǎn)及費(fèi)用，甚至有患者成功地在家中經(jīng)造瘺口行FMT，但病例報(bào)道較少，造瘺口的護(hù)理要求較高，感染和異物排斥風(fēng)險(xiǎn)增加。因此，在移植途徑選擇上，應(yīng)根據(jù)疾病特點(diǎn)、病變部位和患者的耐受程度綜合考慮。

2.5FMT術(shù)后的觀察、處理在移植操作結(jié)束后，應(yīng)積極監(jiān)測(cè)患者生命體征，部分患者會(huì)立即出現(xiàn)腹脹、腹瀉、腸鳴音活躍、嘔吐、發(fā)熱等表現(xiàn)，成人的耐受性較好，癥狀較輕可暫時(shí)觀察，對(duì)于兒童FMT術(shù)后，如出現(xiàn)腹瀉、嘔吐，必要時(shí)需積極補(bǔ)充電解質(zhì)治療，但上述癥狀一般在1～3 d內(nèi)可自行緩解，住院期間須多次送檢糞便培養(yǎng)。如在操作中出現(xiàn)內(nèi)鏡操作引起穿孔、出血、誤吸及麻醉的相關(guān)并發(fā)癥，應(yīng)立即停止操作，必要時(shí)請(qǐng)求外科協(xié)助。

2.6患者隨訪囑患者院外清潔飲食，避免辛辣刺激食物。目前FMT循證醫(yī)學(xué)證據(jù)匱乏，需嚴(yán)密隨訪，以便觀察長(zhǎng)期療效、并發(fā)癥。針對(duì)兒童隨訪時(shí)間，國(guó)內(nèi)要求在FMT術(shù)后1周、2周、3周、4周、8周、12周隨訪患兒原發(fā)疾病的臨床癥狀、體征、實(shí)驗(yàn)室檢查、生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)，有條件者可行糞便宏基因組檢查[28]。對(duì)于成人來(lái)說(shuō)，隨訪時(shí)間可適度延長(zhǎng)，尤其是對(duì)于有自身免疫性疾病或自身免疫性疾病易感傾向的患者，應(yīng)檢測(cè)其體內(nèi)抗體的變化，對(duì)于術(shù)后因病情需要服用免疫抑制劑的患者，更應(yīng)加強(qiáng)隨訪。

3 FMT相關(guān)并發(fā)癥

FMT術(shù)后相較于短期并發(fā)癥，長(zhǎng)期并發(fā)癥具有難以預(yù)測(cè)的特點(diǎn)，危害性更大。長(zhǎng)期并發(fā)癥包括病原體傳播及腸道菌群改變引起的如MS、哮喘、IBD、非酒精性脂肪肝、IBS、情感障礙、腫瘤等慢性疾病[29-30]。具體的細(xì)胞信號(hào)通路尚未完全明確，但已有研究證實(shí)，由腸道細(xì)菌代謝產(chǎn)生的氧化三甲胺會(huì)導(dǎo)致心血管事件發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)增加[31]。而且供體和受體的個(gè)體差異，導(dǎo)致FMT對(duì)于受體腸道菌群的改變能否令受體絕對(duì)獲益有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

對(duì)于FMT的廣泛開(kāi)展，仍需克服對(duì)于合適供體的選擇、流程標(biāo)準(zhǔn)化、技術(shù)審批及監(jiān)管、長(zhǎng)期治療效果、并發(fā)癥檢測(cè)等問(wèn)題。但作為目前唯一的有確切療效改變腸道微生態(tài)的療法，F(xiàn)MT為臨床疾病的治療提供了新的思路。我們應(yīng)樹(shù)立多學(xué)科協(xié)作觀念，進(jìn)一步探究腸道菌群在疾病中的作用，盡可能使更多的患者在FMT治療后獲益。