紅外光譜結(jié)合曲線擬合對自然老化豆類種子的研究

楊衛(wèi)梅 劉剛 歐全宏 安冉 李建美 符致秋 時有明

摘?要?利用傅里葉變換紅外光譜（FTIR）結(jié)合曲線擬合分析（Curve-fitting analysis）及聚類分析（HCA）研究自然老化豆類種子。結(jié)果表明，豆類種子的紅外光譜主要由蛋白質(zhì)及碳水化合物的吸收峰組成，不同老化時間種子的原始光譜整體特征基本相似，但幾個吸收強度比隨老化時間的增加均呈下降趨勢。對原始光譜酰胺Ⅰ帶1700～1600 cm1范圍和多糖1180～980 cm1范圍進行曲線擬合分析，結(jié)果表明，不同老化時間種子的子峰位置和面積比差異較大，老化期間蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中β-折疊、無序結(jié)構(gòu)、α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角成分及多糖中CO、CC和COH成分存在明顯差異。將1800～800 cm1范圍的二階導(dǎo)數(shù)光譜進行聚類分析，聚類準確率達到100%，聚類分析能有效地區(qū)分不同老化時間的種子。本研究結(jié)果表明，F(xiàn)TIR光譜結(jié)合曲線擬合與聚類分析可以快速、有效地區(qū)分自然老化豆類種子。

關(guān)鍵詞?豆類種子; 自然老化; 紅外光譜; 曲線擬合; 聚類分析

1?引 言

種子是重要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料，種子的質(zhì)量直接影響糧食產(chǎn)量和品質(zhì)。種子老化是種子生活力逐漸減弱以至完全喪失的過程，在儲藏過程中，種子發(fā)生膜脂過氧化、酶失活、細胞結(jié)構(gòu)破壞、DNA和RNA降解等質(zhì)變，導(dǎo)致種子發(fā)芽率降低，活力喪失，嚴重影響糧食生產(chǎn)及食品品質(zhì)[1，2]。因此，種子老化的鑒定對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及食品安全都具有重要意義。

目前，已有多種鑒別種子老化的方法[3～11]，但均具有各自的不足。其中，根據(jù)色澤、氣味等的鑒定方法具有較強的主觀性。利用發(fā)芽率、發(fā)芽勢和電導(dǎo)率測定種子活力，如白亞利等[3]研究發(fā)現(xiàn)新麥草種子老化過程的發(fā)芽勢、發(fā)芽率逐漸下降，電導(dǎo)率上升，此方法耗時費力?；菸纳萚4]利用四唑法和標準法檢測蘇丹草種子活力，發(fā)現(xiàn)活力和發(fā)芽率之間呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)，方法方便迅速，但精確度差，且需破壞樣品。分子生物化學(xué)鑒別法準確可靠，但操作繁瑣且損壞樣品成分和結(jié)構(gòu)[6]。Yin等[8]利用高效液相色譜法、抗氧化酶活性及定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)研究陳化水稻種子，發(fā)現(xiàn)過氧化氫酶和抗壞血酸表達下降與活性氧的積累有關(guān)，導(dǎo)致種子喪失活力; Gao等[9]利用二維電泳和矩陣輔助基質(zhì)輔助激光解吸/電離時間飛行質(zhì)譜法研究發(fā)現(xiàn)，雜交水稻種子老化過程中谷胱甘肽相關(guān)蛋白發(fā)生不同程度的變化; Li等[10]采用激光掃描共聚焦顯微鏡和蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究榆樹種子，發(fā)現(xiàn)種子衰老過程中線粒體代謝降低。這些方法測量準確，但需要對樣品進行預(yù)處理，成本高。盧偉等[11]利用熒光光譜檢測水稻種子的發(fā)芽率，具有高的精確度。種子活力是種子品質(zhì)的綜合性指標，僅憑單一活力測定指標難以準確全面判定其總活力水平或健壯度。 因此，有必要提供一種快捷的全面、綜合的分析技術(shù)。

高光譜成像技術(shù)是一種結(jié)合光譜和圖像技術(shù)的無損檢測技術(shù)，高光譜成像技術(shù)（HIS）和近紅外光譜（NIR）已被用于農(nóng)作物種子活力的檢驗研究。吳小芬等[12]利用高光譜成像技術(shù)對種子活力進行快速無損檢測，建立的判別分析模型可準確區(qū)分老化和未老化種子，發(fā)現(xiàn)不同老化品種水稻存在差異。李毅念等[13]利用近紅外光譜技術(shù)測試雜交水稻種子的發(fā)芽率，建立偏最小二乘法回歸模型鑒別不同老化時間水稻種子的發(fā)芽率。羅麗萍等[14]使用近紅外光譜技術(shù)檢測人工老化的白菜和芥菜種子，并建立了預(yù)測模型，可準確地預(yù)測種子活力; 李歡歡等[15]采用光聲光譜技術(shù)結(jié)合最小二乘支持向量機回歸對高溫高濕人工老化的水稻種子活力進行鑒別研究，通過協(xié)方差和主成分分析對光譜進行降維，建立偏最小二乘回歸和反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測模型，具有較好的預(yù)測精度。Ambrose等[16]利用傅立葉變換近紅外和拉曼光譜方法比較評估玉米種子的生存能力，利用主成分分析和偏最小二乘判別分析進行預(yù)測評估，準確率可達到100%。傅里葉變換紅外光譜（FTIR）具有指紋特征性，反映官能團的振動模式，是一種直接、快速的光譜鑒別方法[17]。Chen等[18]利用FTIR結(jié)合二維相關(guān)紅外光譜（2D-IR）技術(shù)研究中國第一艘宇宙飛船攜帶的大青種子飛行前后的化學(xué)變化，得出飛行前后兩種光譜在500～1200 cm1范圍內(nèi)的峰位相差7 cm1，且蛋白質(zhì)含量在飛行后發(fā)生變化。Lu等[19]利用FTIR和光聲光譜（PAS）對不同品種的油菜籽進行分類，采用主成分分析（PCA）研究分離情況，利用偏最小二乘法分析（PLS-DA）和支持向量機（SVM）進行分類，發(fā)現(xiàn)SVM模型在標定和預(yù)測集上實現(xiàn)了較好分類，并優(yōu)于PLS-DA。

豆類種子含有豐富的蛋白質(zhì)及碳水化合物，本研究利用FTIR譜技術(shù)，結(jié)合曲線擬合及聚類分析研究不同老化時間的豆類種子，探討豆類種子老化的光譜變化規(guī)律，以期為豆類種子老化以及相關(guān)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和糧食儲存加工提供參考。

2?實驗部分

2.1?儀器設(shè)備

Frontier型傅里葉變換紅外光譜儀（美國Perkin Elmer公司），配備DTGS探測器，測定范圍4000～400 cm1，累計掃描32次（掃描時自動扣除H2O和CO2的干擾），分辨率為4 cm1，采用YP-2壓片機進行壓片。

2.2?樣品檢測及光譜預(yù)處理

選用云南省陸良縣生產(chǎn)的蠶豆、紅豆和黃豆種子進行實驗，所有樣品均在2013年11月收集并在室溫下儲藏，每年11月對樣品進行測量。3種樣品每次各測試10個樣品，采用KBr壓片法測試光譜。將樣品放入瑪瑙研缽中磨細，再加入適量的KBr攪磨均勻，壓片后測試光譜。光譜采集使用Spectum 10軟件，使用Omnic 8.2紅外光譜處理軟件對所采集的原始光譜進行自動基線校正、平滑、縱坐標歸一化及平均譜圖預(yù)處理; 利用Origin8.6軟件對10次測量的平均紅外光譜的原始光譜及曲線擬合處理; 利用SPSS20.0 統(tǒng)計軟件進行聚類分析。

3?結(jié)果與討論

3.1?原始紅外光譜分析

自然老化的蠶豆、紅豆和黃豆種子的平均原始紅外光譜（圖1（蠶豆）、圖2（紅豆）、圖3（黃豆））中的典型吸收峰為：在3300 cm1附近為蛋白質(zhì)的NH和多糖的OH的伸縮振動吸收峰; 在2926和2855 cm1附近分別為亞甲基的反對稱和對稱伸縮振動[20]; 在1649、1541和1243 cm1附近的峰分別為蛋白質(zhì)的酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ帶的特征吸收峰[17]; 在1152、1075和1055 cm1附近的吸收峰為糖類分子中的CO伸縮振動[21]; 在900 cm1以下是碳水化合物OH的彎曲振動及糖環(huán)振動的吸收峰[22]; 3種豆類種子的主要成分為蛋白質(zhì)和碳水化合物。不同老化時間種子的原始光譜整體特征基本相似，但幾個特征峰吸收強度比存在一定差異，蠶豆吸收峰強度比A1649/A2926從收獲當(dāng)年至老化第五年分別為2.373、1.972、1.692、1.830和1.762，A1649/A1538相應(yīng)比值分別為1.792、1.684、1.570、1.647和0.942，A1649/A1240分別為3.401、3.049、2.71、2.985和2.793; 紅豆吸收峰強度比A1652/A2931從收獲當(dāng)年至老化第五年分別為2.070、2.068、2.047、1.936、和1.838; A1652/A1050相應(yīng)比值分別為2.012、1.996、1.853、1.667和1.431，A1652/A1244分別為3.521、3.368、3.152、2.732和2.786; 黃豆吸收峰強度比A1652/A2927從收獲當(dāng)年至老化第五年分別為1.588、1.233、1.112、1.222和1.224，A1057/A2927相應(yīng)比值分別為0.928、0.538、0.559、0.565和0.615。老化過程中幾個吸收峰強度比總體趨勢下降。

3.2?曲線擬合分析

豆類原始紅外光譜分析中，不同老化時間豆類種子在蛋白質(zhì)和多糖區(qū)域存在明顯差異，選用蛋白質(zhì)酰胺 I 帶1700～1600 cm1和多糖1180～980 cm1范圍進行曲線擬合分析，為了分析種子老化過程中蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和糖類區(qū)域中相對含量變化[23]，3種豆類種子老化過程中酰胺 I 帶出現(xiàn)9個子峰（位置見圖4以及電子版文后支持信息圖S1和S2），多糖范圍出現(xiàn)7個子峰（電子版文后支持信息圖S3～S5），其中1600～1640 cm1歸屬為β-折疊[22]，1640～1650 cm1為無序結(jié)構(gòu)[23]，1650～1660 cm1 為α-螺旋[24]，1660～1700 cm1歸屬為β-轉(zhuǎn)角[25]，990和1080 cm1附近為CO伸縮振動[26]，1020和1050 cm1附近為CC伸縮振動[27]，1100和1120 cm1附近為COH伸縮振動[28]，1160 cm1附近為CC和CO的伸縮振動[28]。 酰胺 I 帶和多糖的面積百分比（10次測量光譜）見表1和表2。

由表1可知，不同老化年份豆類的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)面積百分比差異明顯，對于β-折疊，蠶豆和黃豆種子從收獲當(dāng)年到老化第三年后下降，而紅豆種子上升，且3種樣品隨老化時間增加總體呈上升趨勢。無序結(jié)構(gòu)成分，3種樣品在老化一年后都增加，但3種樣品隨老化時間增加呈下降趨勢。對于α-螺旋，3種樣品隨老化時間增加也呈現(xiàn)下降趨勢。對于β-轉(zhuǎn)角，除了紅豆在老化第二年后上升，而3種樣品隨老化時間增加總體趨勢下降。結(jié)果表明，隨著老化時間增加，蛋白質(zhì)酰胺I帶的β-折疊、無序結(jié)構(gòu)、α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角區(qū)域的面積百分比均發(fā)生下降趨勢。

在多糖1180～980 cm1范圍，不同老化年份的面積百分比（表2）也有明顯差異，蠶豆種子所有子峰的面積百分比隨老化時間增加呈下降趨勢; 紅豆種子在995、1018和1099 cm1附近的面積百分比隨著老化時間增加總體呈下降趨勢; 黃豆種子在992和1050 cm1附近的面積百分比在第四年出現(xiàn)下降趨勢，但在1079、1090和1160 cm1附近出現(xiàn)上升趨勢。因此，3種豆類種子在老化過程中，多糖的CO、CC和COH所對應(yīng)峰的面積百分比發(fā)生了明顯變化。曲線擬合結(jié)果表明，種子老化過程中蛋白質(zhì)β-折疊、無序結(jié)構(gòu)、α-螺旋成分和β-轉(zhuǎn)角相對成分以及多糖中CO、CC和COH所對應(yīng)面積百分比存在差異。

3.3?聚類分析

系統(tǒng)聚類法是一種無監(jiān)督模式識別分類法，根據(jù)研究對象的特征在數(shù)值上存在的相似性程度，將其聚合為不同點群的一種多元統(tǒng)計分析方法，距離越近越易聚在一起，形成一類物質(zhì)[29]。為了準確鑒別出不同老化時間的種子，利用SPSS20.0軟件并采用歐氏距離對不同老化時間的50個樣品在1800～800 cm1波數(shù)范圍的二階導(dǎo)數(shù)光譜進行聚類分析。

蠶豆種子的聚類結(jié)果（圖5）表明，在距離5左右，老化第五年的種子聚為一類; 在距離6左右，老化第二年和第四年種子各自聚為一類; 在距離9左右，第三年種子聚為一類; 在距離15左右，收獲當(dāng)年種子聚為一類; 在距離9左右，第四年和第五年種子聚為一類; 在距離10左右，第二年和第三年種子聚為一類; 在距離25左右，所有年份種子聚為一類。紅豆種子（圖6），在距離5左右，老化第二年和第三年種子各自聚為一類; 在距離7左右，第四年和第五年種子各自聚為一類; 在距離11左右，收獲當(dāng)年種子聚為一類; 在距離15左右，老化第二至第五年種子聚為一類; 除了兩個樣品聚類有誤外，在距離25左右，所有年份種子聚為一類。黃豆種子（圖7），在距離2左右，老化第四年種子聚為一類; 在距離3左右，第三年和第五年種子各自聚為一類; 在距離4左右，第二年種子聚為一類; 在距離8左右，收獲當(dāng)年種子聚為一類; 在距離12左右，老化第二至第五年種子聚為一類; 在距離25左右，所有年份種子聚為一類。3種豆類種子的聚類準確率都達到100%，即采用聚類分析，可以區(qū)分不同老化時間的豆類種子。

4?結(jié) 論

利用紅外光譜結(jié)合曲線擬合可快速地對豆類種子自然老化過程進行研究，結(jié)果表明，不同老化時間種子的吸收峰強度比隨老化時間延長呈下降趨勢。進一步分析發(fā)現(xiàn)，不同老化時間種子的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)酰胺Ⅰ帶和多糖特征峰吸收區(qū)曲線擬合處理結(jié)果存在差異，各子峰出現(xiàn)的位置和面積百分比也存在較大差異。老化期間蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中β-折疊、無序結(jié)構(gòu)、α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角成分及多糖中CO、CC和COH存在明顯差異。3種豆類種子在1800～800 cm1波數(shù)范圍內(nèi)的二階導(dǎo)數(shù)聚類分析準確率達到100%。本研究結(jié)果表明，傅里葉變換紅外光譜結(jié)合曲線擬合及聚類分析可快速無損地鑒別研究不同老化時間豆類種子。

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