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    基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移構(gòu)建關(guān)-開(kāi)型復(fù)合熒光探針快速檢測(cè)沙門氏菌

    2019-12-20 09:41:56崔雯雯徐琳琳史艷宇董娜陳萍
    分析化學(xué) 2019年12期
    關(guān)鍵詞:快速檢測(cè)沙門氏菌

    崔雯雯 徐琳琳 史艷宇 董娜 陳萍

    摘?要?將經(jīng)硅烷化以及氨基化修飾的功能化磁珠與沙門氏菌特異性抗體進(jìn)行偶聯(lián),制備功能化免疫磁珠,通過(guò)近紅外光譜、熒光光譜、紫外光譜等技術(shù)對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)和活性表征。將功能化磁珠、抗體和量子點(diǎn)(QDs)進(jìn)行有序組裝,構(gòu)建了集磁性富集分離和檢測(cè)于一體的磁珠-抗體-QDs復(fù)合熒光納米探針?;诖藦?fù)合熒光納米探針中的QDs與金納米粒子(AuNPs)間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移 (FRET) 效應(yīng),建立了快速檢測(cè)沙門氏菌的“關(guān)-開(kāi)”型熒光分析方法。結(jié)果表明,復(fù)合熒光納米探針的熒光恢復(fù)度與菌濃度的對(duì)數(shù)值呈良好的線性關(guān)系,線性回歸方程為y=103.5x+121.4(R2=0.9956),檢出限為102 CFU/mL(S/N=3),檢測(cè)時(shí)間少于2 h。本方法特異性好,檢出限低,靈敏度高,可滿足食品中沙門氏菌快速檢測(cè)的需求。

    關(guān)鍵詞?復(fù)合熒光納米探針;熒光共振能量轉(zhuǎn)移;快速檢測(cè);沙門氏菌

    1?引 言

    沙門氏菌(Salmonella)為腸桿菌科的革蘭氏陰性短小桿菌[1],是引起食源性疾病的主要人畜共患病原菌之一[2],常通過(guò)受污染的食物傳播,是主要的公共衛(wèi)生威脅[3],可引起腸胃炎、傷寒、敗血癥等多種疾病[4,5],嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致休克及意識(shí)障礙[6~8]。沙門氏菌的快速檢測(cè)一直是世界各國(guó)關(guān)注的問(wèn)題。我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.4-2016 《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門氏菌檢驗(yàn)》[9]中的方法需要對(duì)病原菌進(jìn)行分離培養(yǎng)、生理生化鑒定,操作步驟繁瑣,檢測(cè)周期長(zhǎng),一般需要4~7 d才能確定檢測(cè)結(jié)果[10],不能滿足預(yù)防與監(jiān)控中快速檢測(cè)的需求。因此,建立簡(jiǎn)單、安全、快速的沙門氏菌檢測(cè)方法備受關(guān)注[11,12]。

    目前,沙門氏菌的快速檢測(cè)方法主要包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)[13,14]、核酸探針技術(shù)[15]、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)[16]、表面等離子體共振(SPR)[17]等。雖然這些方法在檢測(cè)速度、靈敏度以及特異性等方面較傳統(tǒng)方法有了明顯提高,但大部分檢測(cè)方法需要大型的精密儀器以及繁瑣的樣品前處理過(guò)程,在現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)方面受到了很大限制。隨著納米技術(shù)的發(fā)展,納米材料因其優(yōu)異的性能獲得了廣泛關(guān)注。研究者將納米材料與熒光技術(shù)相結(jié)合,用于微生物的快速檢測(cè)。1998年,Bruchez等[18]以及Warren等[19]將量子點(diǎn)(Quantum dots,QDs)作為熒光標(biāo)記物,用于生物診斷與檢測(cè)領(lǐng)域。Wang 等[20]利用沙門氏菌特異性抗體和金黃色葡萄球菌特異性抗體修飾 Fe3O4磁性納米材料,分別用于分離食品體系中的沙門氏菌和金黃色葡萄球菌,結(jié)合表面拉曼散射分析,方法檢出限達(dá)到103 CFU/ mL。熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence resonance energy transfer,F(xiàn)RET)是一種非輻射能量轉(zhuǎn)移形式,供體基團(tuán)在激發(fā)狀態(tài)下,通過(guò)電偶極子的相互作用,將能量從供體轉(zhuǎn)移到受體。金納米粒子(AuNPs)具有良好的生物相容性和穩(wěn)定性,消光系數(shù)高,在FRET體系中可作為能量受體[21]。FRET基于其檢測(cè)速度快和靈敏度高的優(yōu)勢(shì),近年來(lái)廣泛應(yīng)用于免疫傳感、核酸檢測(cè)和微生物檢測(cè)等多個(gè)領(lǐng)域。Jin等[22]開(kāi)發(fā)了一種基于上轉(zhuǎn)換熒光納米粒子的新型FRET適配體傳感器檢測(cè)細(xì)菌,對(duì)大腸桿菌ATCC 8739的檢測(cè)范圍為5~106 CFU/mL,檢出限為3 CFU/mL,并用于食品及水樣中大腸桿菌的檢測(cè)。免疫磁珠 (Immunomagnetic beads,IMBs) 是一種較好的免疫測(cè)定固相載體,操作簡(jiǎn)便快速。Xiong等[23]將大腸桿菌單克隆抗體與磁珠偶聯(lián)用于捕獲碎牛肉和牛奶中的大腸桿菌O157:H7,捕獲效率分別為94.4%和99.8%,靈敏度高,特異性好。

    本研究基于QDs與AuNPs之間的FRET效應(yīng),建立了“關(guān)-開(kāi)”型熒光探針免疫分析方法。原理如圖1所示,將功能化磁珠、抗體和量子點(diǎn)進(jìn)行組裝,構(gòu)建“磁珠-抗體-量子點(diǎn)”復(fù)合熒光納米探針。此熒光探針中經(jīng)巰基丙酸修飾后的量子點(diǎn)含有羧基(COOH),帶負(fù)電荷;經(jīng)巰基乙胺修飾后的金納米粒子溶液(CS-AuNPs)含有氨基(NH2),帶正電荷,兩種納米材料由于靜電作用拉近了彼此間的距離,且AuNPs的吸收光譜與QDs的發(fā)射光譜有很好的重疊,可發(fā)生有效的FRET[24],熒光探針的熒光被顯著淬滅。加入目標(biāo)菌后,目標(biāo)菌通過(guò)抗原抗體反應(yīng)與熒光探針結(jié)合,熒光探針與CS-AuNPs之間的距離增大,F(xiàn)RET效應(yīng)被削弱,因FRET而淬滅的熒光信號(hào)恢復(fù)。本研究基于QDs和AuNPs間的FRET效應(yīng)構(gòu)建熒光關(guān)-開(kāi)體系,建立了快速檢測(cè)沙門氏菌的關(guān)-開(kāi)型熒光探針免疫分析技術(shù)。此方法受背景基質(zhì)干擾低,具有選擇性高、快速、靈敏的優(yōu)點(diǎn),為沙門氏菌的快速檢測(cè)提供了一種準(zhǔn)確有效的方法。

    2?實(shí)驗(yàn)部分

    2.1?儀器與試劑

    COIC熒光顯微鏡(重慶光電儀器有限公司);傅立葉近紅外光譜儀、Zeta電位分析儀、UV1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司);F-4500 型熒光分光光度計(jì)(日本日立公司)。

    巰基乙酸(TGA,上海國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司);3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、正硅酸乙酯(TEOS)、氯金酸(HAuCl4·4H2O)、1-乙基(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl),均購(gòu)于阿拉丁公司;沙門氏菌抗體(博士德生物工程有限公司);巰基丙酸(MPA)修飾的CdTe量子點(diǎn)溶液(0.05 μmol/L,天津倍思樂(lè)色譜技術(shù)開(kāi)發(fā)中心);實(shí)驗(yàn)菌種沙門氏菌 (ASII859)、福氏志賀菌(CMCC51252)、金黃色葡萄球菌(ASII861)、大腸桿菌(LE392)等均由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品安全教研室保藏。所用試劑均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水為超純水(>18.0 MΩ cm)。

    2.2?Fe3O4@SiO2@NH2的制備

    采用共沉淀法[25,26]制備裸磁珠(Fe3O4)和經(jīng)SiO2包被的氨基化磁珠(Fe3O4@SiO2@NH2)。對(duì)Fe3O4和Fe3O4@SiO2@NH2進(jìn)行近紅外光譜表征分析,將Fe3O4@SiO2@NH2與抗體進(jìn)行偶聯(lián)制得免疫磁珠。取50 mL裸Fe3O4磁珠,加入50 mL無(wú)水乙醇和2 mL TEOS,通氮?dú)?,?0℃下攪拌反應(yīng)10 h,磁分離,用無(wú)水乙醇和超純水分別洗滌3~5次,定容至100 mL。取50 mg上述磁珠,用4 mL PBS緩沖液分散,超聲30 min,加入2.5 mL 25%戊二醛,室溫振蕩反應(yīng)3 h,用PBS緩沖液清洗3遍,最終將活化后的磁珠分散于緩沖液中,得到10 mg/mL Fe3O4@SiO2@NH2溶液。取1 mL(約10 mg)上述活化后的磁珠,加入6 mL沙門氏菌特異性抗體(1∶500稀釋),室溫振蕩反應(yīng)2 h,用PBS緩沖液洗滌3次,制得沙門氏菌特異性免疫磁珠,于4℃保存。

    2.3?復(fù)合熒光納米探針的構(gòu)建

    取等量0.024 mol/L Na2S溶液和0.032 mol/L ZnCl2溶液,在快速攪拌并通氮?dú)鈼l件下逐滴交替滴加到MPA修飾的CdTe QDs溶液中,在60℃條件下密閉攪拌反應(yīng)1 h,得到MPA-CdTe@ZnS QDs溶液。將溶液轉(zhuǎn)移到干凈干燥的玻璃瓶中,密封后,在室溫下靜置。將制備好的QDs溶液與等體積的丙酮混勻,振蕩5 min,10000 r/min離心5 min,用超純水離心洗滌沉淀,再用超純水懸浮,備用。

    用EDC/NHS活化QDs表面的羧基。取100 μL MPA-CdTe@ZnS QDs溶液,向其中加入28.75 μL EDC(33.4 mmol/L,使用前現(xiàn)配)和27 μL NHS(70.9 mmol/L)溶液。充分混勻,在室溫振蕩反應(yīng)15 min。取45 μL合成的免疫磁珠,加入到活化后的MPA-CdTe@ZnS QDs溶液中,25℃恒溫避光輕微振蕩反應(yīng)2 h,然后進(jìn)行磁分離,用PBS緩沖液重復(fù)洗滌3次,制得復(fù)合熒光納米探針,于4℃下儲(chǔ)存,備用。

    2.4?金納米粒子的合成

    根據(jù)文獻(xiàn)[27]的方法制備34 nm的巰基乙胺修飾的金納米粒子(CS-AuNPs):將0.213 mol/L半胱胺鹽酸鹽和50 mL 1.4 mmol/L HAuCl4混合,在室溫避光攪拌20 min后,迅速加入12.5 μL 10 mmol/L新制備的NaBH4溶液,繼續(xù)劇烈攪拌30 min,制得的酒紅色溶液用0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾后,于4℃保存。34 nm 的金納米粒子的摩爾消光系數(shù)為6.06×109 L/(mol·cm) [28],由朗伯比爾定律可知,CS-Au NPs的濃度約為 0.83 nmol/L。

    2.5?特異性抗體與AuNPs結(jié)合pH的優(yōu)化

    取數(shù)個(gè)1.5 mL離心管,分別加入1 mL CS-AuNPs,用0.1 mol/L K2CO3溶液分別調(diào)節(jié)至pH 4、5、6、7、8、9、10,分別加入到96孔板的孔中,并做3個(gè)平行,在每個(gè)CS-AuNPs的孔中各加入6 μL稀釋后的特異性抗體,混勻后靜置5 min,再加入100 μL 10% NaCl溶液,室溫靜置10 min,觀察溶液顏色的變化,并測(cè)定上清液在520 nm處的吸收值(OD)。

    2.6?復(fù)合熒光納米探針與金納米粒子結(jié)合體積比的優(yōu)化

    取10個(gè)1.5 mL 離心管,分別對(duì)其進(jìn)行1~10標(biāo)號(hào),分別加入CS-AuNPs溶液100 μL,然后依次加入1、2、4、8、16、32、64、128、256、512倍比稀釋后的CS-AuNPs各10 μL,混勻后在室溫下放置15 min,再加入100 μL 10% NaCl,混勻后靜置5 min,測(cè)定其在520 nm處的吸收值。

    2.7?熒光關(guān)-開(kāi)型檢測(cè)方法的建立

    2.7.1?復(fù)合熒光納米探針對(duì)沙門氏菌的檢測(cè)?取100 μL CS-AuNPs溶液于EP管中,加入10 μL復(fù)合熒光納米探針,混合均勻后,于室溫靜置15 min,進(jìn)行磁分離。取9個(gè)1.5 mL 離心管,1號(hào)管為空白管,2~9號(hào)管分別加入1 mL菌液濃度為1×101、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108 CFU/mL的沙門氏菌菌液,再分別取100 μL 被CS-AuNPs淬滅后的復(fù)合熒光納米探針加入各管中,將上述溶液恒溫振蕩反應(yīng)20 min,磁分離,洗滌3次后,測(cè)定各溶液的熒光強(qiáng)度。

    2.7.2?選擇性實(shí)驗(yàn)?以沙門氏菌為目標(biāo)菌,大腸桿菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌為非目標(biāo)菌,用建立的沙門氏菌的熒光關(guān)-開(kāi)檢測(cè)方法對(duì)其進(jìn)行檢測(cè),考察此檢測(cè)方法的特異性。

    2.7.3?人工模擬污染沙門氏菌牛奶樣品的檢測(cè)?按照國(guó)標(biāo)GB4789.4-2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)檢驗(yàn)沙門氏菌》[9]的檢測(cè)步驟對(duì)市售新鮮牛奶進(jìn)行檢測(cè),證實(shí)牛奶中不含沙門氏菌。分別隨機(jī)取不同濃度的沙門氏菌菌懸液加入到新鮮的牛奶樣品中,37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。用建立的熒光關(guān)-開(kāi)方法進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。

    3?結(jié)果與討論

    3.1?Fe3O4和Fe3O4@SiO2@NH2的的表征

    利用近紅外光譜(FT-IR)對(duì)裸磁珠(Fe3O4)和硅烷化氨基化修飾的磁珠(Fe3O4@SiO2@NH2)進(jìn)行表征(圖2),由圖2a可知,在574 cm1出現(xiàn)了一個(gè)較強(qiáng)的吸收峰,為處于氧四面體位和氧八面體位的FeO伸縮振動(dòng)峰。通常Fe3O4的吸收峰在580 cm 1處,其微小差距可能由于納米顆粒的尺寸效應(yīng),基團(tuán)頻率發(fā)生位移,由此證明樣品的物相是Fe3O4。在圖2b中,在3402 cm1處的強(qiáng)吸收峰歸屬于羧基中的OH鍵的伸縮振動(dòng),表明修飾后的磁珠表面引入了OH。1080 cm1處較強(qiáng)的吸收峰是SiOSi鍵的伸縮振動(dòng)峰,800 cm1處為SiO的伸縮振動(dòng)峰,表明SiO2成功包裹在Fe3O4磁珠表面。在3402 cm1處出現(xiàn)NH2的特征吸收峰,在1633 cm1處出現(xiàn)NH鍵的彎曲振動(dòng)峰,表明氨基已成功修飾在Fe3O4磁珠表面。近紅外光譜結(jié)果表明,F(xiàn)e3O4磁珠已成功包被SiO2,并在表面修飾上氨基。

    3.2?MPA-CdTe QDs和MPA-CdTe/ZnS QDs的光譜表征

    圖3為MPA-CdTe QDs和MPA-CdTe@ZnS QDs的吸收光譜(A)和熒光光譜(B)。由圖3A可知,MPA-CdTe QDs吸收峰位于446 nm處,MPA-CdTe@ZnS QDs的吸收峰位于456 nm處,與未修飾ZnS的MPA-CdTe QDs相比,MPA-CdTe@ZnS QDs吸收峰紅移10 nm。由圖3B可知,MPA-CdTe QDs和MPA-CdTe@ZnS QDs的熒光發(fā)射峰位于516 nm,修飾ZnS殼后,MPA-CdTe@ZnS QDs的熒光強(qiáng)度增加。

    3.3?金納米粒子對(duì)復(fù)合熒光探針淬滅條件的優(yōu)化

    優(yōu)化了特異性抗體與 CS-AuNPs結(jié)合pH值以及淬滅劑CS-AuNPs用量。隨著pH值增大,溶液在520 nm處的吸光度先增大后減小,顏色由藍(lán)紫色變?yōu)榧t色,再變?yōu)樗{(lán)色,pH=8時(shí)吸光度最大,此時(shí)CS-AuNPs無(wú)明顯變化,pH=9、10時(shí),吸光度開(kāi)始減小。當(dāng)0.1 mol/L K2CO3加入量為40 μL時(shí),溶液的吸光值最大,因此確定熒光探針與CS-AuNPs結(jié)合的最佳pH=8??疾炝瞬煌瑵舛鹊慕鸺{米與抗體結(jié)合的最佳稀釋梯度,確定CS-AuNPs標(biāo)記最適抗體稀釋度為15倍,此時(shí)熒光探針的熒光處于淬滅狀態(tài)。

    3.4?金納米粒子對(duì)量子點(diǎn)的熒光淬滅機(jī)制

    如圖4A所示,CS-AuNPs最大吸收峰位于524 nm,光譜呈現(xiàn)出不對(duì)稱分布狀態(tài),與文獻(xiàn)[29,30]報(bào)道相一致。FRET的發(fā)生需要兩個(gè)條件[31]: 一是存在合適的能量供體和受體; 二是供受體間的距離足夠近(< 10 nm)。本研究制備的CS-AuNPs的吸收光譜與量子點(diǎn)的熒光發(fā)射光譜存在較大重疊,這為FRET提供了基礎(chǔ),且發(fā)現(xiàn)隨著受體CS-AuNPs濃度的增加,其吸收強(qiáng)度逐漸增加,而供體的熒光發(fā)射強(qiáng)度逐漸降低,F(xiàn)RET效應(yīng)具有濃度依賴的現(xiàn)象。由熒光探針淬滅前后熒光光譜(圖4B)可知,加入CS-AuNPs后,探針的熒光強(qiáng)度明顯降低,熒光發(fā)生淬滅。由圖4C和4D可知,在最佳pH條件下,體系中CS-AuNPs與QDs的Zeta電位分別為35.7和15.4 mV,進(jìn)一步證明由于靜電引力,兩者可發(fā)生有效的FRET。

    3.5?基于復(fù)合熒光納米探針關(guān)-開(kāi)效應(yīng)檢測(cè)沙門氏菌

    在檢測(cè)體系中加入沙門氏菌,振蕩反應(yīng)20 min后,測(cè)定其熒光強(qiáng)度。

    如圖5所示,隨著沙門氏菌濃度增加,復(fù)合熒光納米探針的熒光逐漸恢復(fù)。體系的熒光恢復(fù)程度(F-F0)與菌液濃度的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系,線性方程為y=103.5x+121.4(R2=0.9956),檢出限為1.7×102 CFU/mL(S/N=3)。

    為了驗(yàn)證此體系的選擇性,考察了非目標(biāo)菌(Shigella flexneri,Escherichia coli,Staphylococcus aureus)對(duì)體系的影響情況。如圖6A所示,隨著沙門氏菌濃度增加,復(fù)合熒光納米探針溶液的熒光強(qiáng)度逐漸增大,而非目標(biāo)菌的加入,未引起體系熒光強(qiáng)度明顯改變。圖6B分別是加入目標(biāo)菌和非目標(biāo)混合菌后的熒光顯微鏡下圖片。通過(guò)明視場(chǎng)與暗視場(chǎng)間的對(duì)比,圖6B-b中菌體發(fā)出熒光,說(shuō)明被淬滅的熒光得到恢復(fù);圖6B-d幾乎觀察不到熒光,說(shuō)明非目標(biāo)菌沒(méi)有使淬滅的熒光恢復(fù)。上述結(jié)果表明,本方法對(duì)沙門氏菌的檢測(cè)具有良好的特異性。

    3.6?牛奶樣品中沙門氏菌的檢測(cè)

    用復(fù)合熒光探針對(duì)人工模擬污染沙門氏菌的牛奶樣品進(jìn)行檢測(cè),并與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)沙門氏菌平板計(jì)數(shù)法[9]的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較,結(jié)果見(jiàn)表2。兩種方法得出的數(shù)值基本一致,由圖7可知,兩種方法測(cè)定結(jié)果的線性相關(guān)方程為y=1.0029x-0.0184(R2=0.9998),表明本研究構(gòu)建的檢測(cè)體系可用于沙門氏菌的定量檢測(cè)。

    4?結(jié) 論

    利用量子點(diǎn)和AuNPs間的FRET效應(yīng),建立了快速檢測(cè)沙門氏菌的關(guān)-開(kāi)型復(fù)合熒光納米探針?lè)治龇椒?。?gòu)建了集磁性富分離和檢測(cè)結(jié)果快速呈現(xiàn)功能于一體的“磁珠-抗體-量子點(diǎn)”復(fù)合熒光納米探針,通過(guò)供體-受體自組裝完成熒光淬滅,沙門氏菌通過(guò)抗原抗體反應(yīng)與探針結(jié)合,使金納米粒子與探針之間的距離增大,F(xiàn)RET效應(yīng)減弱,實(shí)現(xiàn)熒光的turn-on響應(yīng)。結(jié)果表明,熒光探針的熒光恢復(fù)度與菌液濃度的對(duì)數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,檢出限為102 CFU/mL,檢測(cè)時(shí)間在2 h以內(nèi)。本方法操作簡(jiǎn)單,特異性好,靈敏度高,滿足快速檢測(cè)食品中沙門氏菌的需求,具有良好的實(shí)際應(yīng)用前景。

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