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    調(diào)治天癸方對(duì)不育癥模型大鼠睪丸組織病理形態(tài)的觀察※

    2019-12-20 00:30:56袁軼峰朱文雄陳其華賀菊喬
    中醫(yī)藥通報(bào) 2019年5期
    關(guān)鍵詞:調(diào)治生精不育癥

    ●袁軼峰 朱文雄 沈 磊 劉 濤 陳其華 周 興 賀菊喬

    近年來,隨著人們生活水平的普遍提高,傳統(tǒng)的生活方式發(fā)生了較大的改變,諸如生活節(jié)奏越來越快,工作壓力、心理壓力越來越大,精神壓抑、暴飲暴食、長期熬夜等,使得男性生殖能力下降[1],男性不育癥的發(fā)病率逐年提高[2],精子質(zhì)量越來越差,導(dǎo)致男性不育癥的病因日趨復(fù)雜化[3]。如何有效提高男性生殖能力,提高精子活力成為當(dāng)下關(guān)注的焦點(diǎn)。目前,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療不育癥的研究仍集中于人工授精、試管嬰兒等輔助生殖技術(shù)及感染、梗阻等方面,臨床尚無解決不育癥的根本辦法[4]。中藥治療不育癥歷史悠久,具有創(chuàng)傷小、毒副作用少、效果明顯等優(yōu)點(diǎn)[5]。我院國家級(jí)名老中醫(yī)賀菊喬教授根據(jù)多年治療男性不育癥的臨床經(jīng)驗(yàn),制定出效驗(yàn)方藥——調(diào)治天癸方。通過前期研究及臨床實(shí)踐積累,發(fā)現(xiàn)調(diào)治天癸方能改善男性不育癥,療效確切,但具體作用機(jī)制不明確。本實(shí)驗(yàn)觀察調(diào)治天癸方對(duì)不育癥模型大鼠睪丸病理組織的影響以探討其作用機(jī)制。

    1 實(shí)驗(yàn)材料

    1.1 動(dòng)物具有生育能力SPF 級(jí)健康成年雄性Wistar 大鼠72 只,1.5 月齡,體重(160~200)g,北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供,合格證號(hào):SCXK-(京)2018-2019。

    1.2 藥品調(diào)治天癸方,藥由酒炙黃芪、酒炙黃精、鹽炒菟絲子、枸杞子、炒車前子、熟地黃、酒萸肉、紫河車等組成。由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房統(tǒng)一提供,并由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院煎藥房統(tǒng)一熬制成0.16g/mL 濃度的藥液。生精膠囊,由遵義廖元和堂藥業(yè)有限公司提供,國藥準(zhǔn)字Z20027672,規(guī)格:0.4g/粒,產(chǎn)品批號(hào)20170905。

    1.3 主要試劑及儀器腺嘌呤、0.9%生理鹽水、波因氏固定液:購自長沙市化學(xué)試劑公司;不銹鋼三用電熱恒溫水箱,購自北京東霞科學(xué)儀器廠;隔水式恒溫培養(yǎng)箱,購自上海一恒科技有限公司;BA200Digital數(shù)碼三目攝像顯微攝像系統(tǒng),購自麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司。

    2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.1 動(dòng)物分組及給藥72 只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后,按體重隨機(jī)分為6組,每組12只,即模型對(duì)照組、正常對(duì)照組、調(diào)治天癸方大劑量組、調(diào)治天癸方中劑量組、調(diào)治天癸方小劑量組、生精膠囊組。除正常對(duì)照組外,其余5組均按文獻(xiàn)[6]腺嘌呤改進(jìn)法造模:將腺嘌呤按500mg/mL濃度配置,并加入與腺嘌呤1:10比例的阿拉伯膠助溶,以5mL/100g/d 劑量連續(xù)灌胃10天,一次性成功。造模結(jié)束后,停止腺嘌呤灌胃,開始調(diào)治天癸方灌胃治療。正常對(duì)照組與模型對(duì)照組用等量生理鹽水灌胃治療,按人與大鼠等效劑量換算[10],調(diào)治天癸方組分別每日用大劑量組(2.24g/100g)、中劑量組(1.12g/100g)、小劑量組(0.56g/100g)天癸方灌胃。生精膠囊組每日用(0.48/100g)生精膠囊灌胃,連續(xù)灌胃48天。

    2.2 標(biāo)本采集實(shí)驗(yàn)結(jié)束后各組雄性大鼠采用頸椎脫位處死。處死后解剖摘取雄性大鼠睪丸、附睪,觀察外觀形態(tài)并稱重。摘取所有雄性大鼠睪丸,用波音(Bouin)氏固定液固定,睪丸固定時(shí)持續(xù)灌流,石蠟包埋,HE染色[7-9],切片、封片,進(jìn)行睪組織學(xué)觀察。

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,多組比較采用單因素方差分析,方差齊性用LSD、S-N-K 檢驗(yàn),方差不齊采用秩和檢驗(yàn)。P<0.01 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    4 結(jié)果

    4.1 大鼠一般情況觀察實(shí)驗(yàn)前各組大鼠活動(dòng)自如、反應(yīng)靈敏、狀態(tài)良好、毛色潤澤光滑。造模期間各組大鼠排尿量逐漸增加,并隨劑量加大而加重。造模后除正常對(duì)照組較實(shí)驗(yàn)前無明顯改變外,其余各組均表現(xiàn)為不同程度的活動(dòng)減少、反應(yīng)遲鈍、抱團(tuán)取暖、食欲減退、飲水量增加,毛色枯槁等表現(xiàn);“天癸方”灌胃開始到實(shí)驗(yàn)結(jié)束,正常對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)前無明顯變化,天癸方大、中、小劑量組較造模期均有所好轉(zhuǎn),中劑量組改善最為明顯。

    4.2 大鼠性腺與模型對(duì)照組相比,正常對(duì)照組、生精膠囊組、大、中、小劑量治療組的睪丸質(zhì)量有顯著性差別(P<0.01);與正常對(duì)照組相比調(diào)治天癸方大、中、小劑量治療組睪丸質(zhì)量無顯著性差別(P>0.05)。

    表1 各組大鼠睪丸、附睪重量比較()

    表1 各組大鼠睪丸、附睪重量比較()

    注:與正常對(duì)照組比較,*P<0.01;與模型對(duì)照組比較,#P<0.01。

    4.3 大鼠睪丸組織HE染色各組大鼠睪丸組織切片,HE染色光鏡顯示:正常對(duì)照組大鼠睪丸生精上皮完整、各級(jí)生精細(xì)胞排列規(guī)則,血管豐富,生精小管腔均可見大量成熟精子,生精小管間間質(zhì)無充血水腫,無炎性細(xì)胞浸潤及纖維結(jié)締組織增生(圖1A);模型對(duì)照組睪丸生精上皮變薄、變形、部分生精小管管腔阻塞或塌陷,生精細(xì)胞排列紊亂,大部分曲細(xì)精管發(fā)生退化、變性、各級(jí)生精細(xì)胞變性,數(shù)量減少細(xì)胞間隙增大,支持細(xì)胞連接變寬,間質(zhì)水腫、輪廓不清(圖1B);生精膠囊組和調(diào)治天癸方各劑量治療組治療后(如圖1CDEF)生精小管基膜輪廓變得完整清晰,基膜基本完整,管壁厚而圓,管腔內(nèi)生精細(xì)胞的層次增多,排列也趨于條狀,生精小管管腔中由精子細(xì)胞變態(tài)發(fā)育為精子的數(shù)量相對(duì)模型組大鼠顯著增多,間質(zhì)細(xì)胞成群分布于生精小管之間的疏松結(jié)締組織內(nèi)。

    圖1 200倍鏡下各組睪丸組織

    5 討論

    男性不育癥在我國早有記載,其在古代被稱為“無嗣”“不男”“男子艱嗣”“無子”“絕育”等。中醫(yī)藥治療不育具有悠久的歷史,尤其對(duì)男性不育的生理特點(diǎn)、病因病理、辨證施治等方面都有豐富的記載[11]。但由于封建思想及失傳等歷史原因,尚未形成系統(tǒng)的獨(dú)立專科。近年來男性不育治療的研究集中于顯微外科及輔助生殖技術(shù)方面,在藥物治療上方興未艾。中藥治療不育有確切療效,但當(dāng)前傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)在此領(lǐng)域的理論基礎(chǔ)尚不完善[12-13]。調(diào)治天癸方是由國家級(jí)名老中醫(yī)賀菊喬教授根據(jù)中醫(yī)腎-天癸-腎子軸的理論,結(jié)合多年臨床實(shí)踐總結(jié)得出來的治療男性不育癥的方劑。全方由黃芪、黃精、菟絲子、枸杞子、車前子、熟地黃、山茱萸、紫河車8 味中藥組成。方中黃芪甘、溫,用于補(bǔ)中生氣;黃精味甘、平,健脾益氣,填精生髓;菟絲子辛甘、微溫,滋補(bǔ)肝腎,肝腎為生殖之本;枸杞子味甘平,補(bǔ)腎陰而生腎精;山茱萸理肝腎;紫河車大補(bǔ)元?dú)?。諸藥調(diào)和,填精益腎,共同作用治療男性不育癥。但具體作用效果及機(jī)制尚不明確。其改善精子質(zhì)量的作用機(jī)制尚不明晰,特別是對(duì)睪丸精子發(fā)生微環(huán)境等方面的研究尚不夠深入。

    本實(shí)驗(yàn)通過腺嘌呤法成功復(fù)制大鼠不育癥模型。并隨著腺嘌呤給藥時(shí)間延長,模型對(duì)照組大鼠與正常對(duì)照組相比明顯出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、抱團(tuán)取暖、小便增多,類似中醫(yī)腎陽虛的癥狀和體征。調(diào)治天癸方各組在用藥48天后,大鼠活動(dòng)度、反應(yīng)靈敏度均有提高,且以中劑量組改善效果最為顯著,提示調(diào)治天癸方能改善不育癥模型大鼠的一般情況。調(diào)治天癸方各劑量治療組睪丸質(zhì)量均顯著增加,與模型對(duì)照組相比,存在差異顯著性(P<0.01)。本實(shí)驗(yàn)睪丸組織病理學(xué)形態(tài)觀察結(jié)果顯示:調(diào)治天癸方各組病理改變均輕于模型對(duì)照組,生精小管基膜輪廓變得完整清晰,基膜基本完整,管壁厚而圓,管腔內(nèi)生精細(xì)胞的層次增多,排列也趨于條狀,生精小管管腔中由精子細(xì)胞變態(tài)發(fā)育為精子的數(shù)量相對(duì)模型組大鼠顯著增多。提示調(diào)治天癸方可增加睪丸質(zhì)量、促進(jìn)睪丸生精上皮的恢復(fù)、促進(jìn)生殖細(xì)胞分化為成熟的精子[14]、減輕生精小管間質(zhì)水腫,最終改善性腺器官的形態(tài)結(jié)構(gòu),從而改善睪丸生精功能,提高生殖能力。生精細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞及和支持細(xì)胞三種細(xì)胞主要維持睪丸的生理功能[15-16]。睪丸的生殖功能主要依賴于間質(zhì)細(xì)胞和支持細(xì)胞輔助生精細(xì)胞生成精子。

    綜上所述,調(diào)治天癸方可明顯改善不育癥大鼠的生精環(huán)境,提高其生殖功能。其機(jī)制可能為促進(jìn)睪丸生精上皮的恢復(fù)[17]、促進(jìn)生殖細(xì)胞分化、減輕生精小管間質(zhì)水腫,并最終改善性腺器官的形態(tài)結(jié)構(gòu),為精子的成熟提供良好的環(huán)境。

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