水質(zhì)中大腸桿菌熒光定量PCR檢測方法的建立及應(yīng)用

樓秋雯 陳為為 黃志廣 安紫琿 朱振洪

摘 ?要：[目的]建立迅速、特異的水質(zhì)中大腸桿菌群熒光定量PCR檢測方法。[方法]根據(jù)Genbank中大腸桿菌保守的uida基因序列，設(shè)計特異性引物，擴增并構(gòu)建重組質(zhì)粒作為標(biāo)準品。同時設(shè)計熒光定量PCR引物，優(yōu)化熒光定量PCR定量反應(yīng)體系，建立水質(zhì)中大腸桿菌的絕對定量方法。[結(jié)果]成功地構(gòu)建了含uida基因的重組質(zhì)粒，利用標(biāo)準質(zhì)粒為參照，分別對不同來源的水質(zhì)進行檢測，成功檢出每微升水質(zhì)中大腸桿菌的基因拷貝數(shù)，且方法具有特異性好、重復(fù)性高的特點。[結(jié)論]初步建立水質(zhì)中大腸桿菌的熒光定量PCR檢測方法，可為飲用水中大腸桿菌迅速檢測，包括污染源頭診斷的標(biāo)準方法的確立提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：水質(zhì);大腸桿菌;熒光定量PCR;檢測方法

中圖分類號：TV697.3 ? ? ? 文獻標(biāo)志碼：A ? ? ? ? ? ? ?文章編號：2095-2945（2019）35-0118-04

Abstract： Objective： To establish a rapid and specific fluorescence quantitative PCR method for the detection of Escherichia coli in water quality. Methods： According to the conserved uida gene sequence of Escherichia coli in Genbank， specific primers were designed to amplify and construct the recombinant plasmid as the standard. At the same time， the fluorescence quantitative PCR primers were designed， the fluorescence quantitative PCR quantitative reaction system was optimized， and the absolute quantitative method of Escherichia coli in water quality was established. Results： The recombinant plasmid containing uida gene was successfully constructed. Using the standard plasmid as a reference， the water quality from different sources was detected， and the gene copy number of Escherichia coli in each microliter of water quality was successfully detected. And the method has the characteristics of good specificity and high repeatability. Conclusion： The preliminary establishment of a fluorescence quantitative PCR method for the detection of Escherichia coli in drinking water can provide a basis for the rapid detection of Escherichia coli in drinking water， including the establishment of a standard method for the diagnosis of pollution sources.

Keywords： water quality; Escherichia coli; fluorescence quantitative PCR; method

大腸埃希氏菌（Escherichia coli）通常稱大腸桿菌，在一定條件下可以引起人和多種動物發(fā)生胃腸道感染或尿道等多種局部組織器官感染，是人體內(nèi)較為常見的食源性致病菌。近年來，因大腸桿菌污染水或食物造成人類食物中毒的例子日益增多，該污染物給飲用水水質(zhì)帶來了極大的安全隱患[1]。中華人民共和國國家標(biāo)準《生活飲用水水質(zhì)衛(wèi)生規(guī)范》規(guī)定，總大腸菌群及糞大腸菌群每100mL水樣中不得檢出。因此，實現(xiàn)水質(zhì)大腸桿菌的快速檢測顯得尤為重要。

目前，檢測大腸桿菌的技術(shù)有很多，如多管發(fā)酵技術(shù)、膜過濾技術(shù)、酶聯(lián)免疫分析法[2]、基因芯片技術(shù)、高效液相色譜法等，其中基因芯片技術(shù)和色譜測定能夠靈敏、迅速、準確的檢測，然而局限性太大且費用昂貴。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，熒光定量PCR檢測方法以其快速和可批量檢測等優(yōu)點[3]，成為了基因檢測的常用方法?；谀壳皬V泛研究的基礎(chǔ)，熒光定量PCR在大腸桿菌的快速大規(guī)模篩查中具有明顯的應(yīng)用優(yōu)勢。本研究以大腸桿菌菌群相對保守的uida基因[4]為檢測靶基因，設(shè)計熒光定量PCR引物，建立實時熒光定量PCR反應(yīng)體系，來檢測不同水域中單位體積大腸桿菌中uida基因拷貝數(shù)，并評價熒光定量PCR方法較在水質(zhì)檢測中的靈敏度、特異性、重復(fù)性，為后續(xù)水質(zhì)大腸桿菌的高效、便捷的檢測應(yīng)用打下良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

大腸桿菌E. coli BL21、E. coli TG1均由本實驗室保存并提供。

1.1.2 試劑

pTA2載體購自上海捷瑞生物公司，基因組提取試劑盒、割膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒等均為上海莊盟生物科技有限公司的產(chǎn)品。NaCl為無錫市東昌化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，瓊脂粉、瓊脂糖、蛋白胨、酵母提取物等化學(xué)試劑均購于上海澤衡生物技術(shù)有限公司。10×PCR buffer，MgSO4（50mmol/L），dNTPS（2.0mmol/L），Taq酶，50% DMSO，2×SYBR premix Ex-Taq等均購于TOYOBO公司。uida基因片段相關(guān)引物均由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.1.3 儀器

臺式高速冷凍離心機（德國西格瑪有限公司，Sigma 3K-15）;水平電泳系統(tǒng)（北京市六一儀器廠，DYCP-31D）;恒溫培養(yǎng)箱（太倉精宏儀器設(shè)備有限公司，JINGHONG）;恒溫搖床（上海博迅實業(yè)有限公司，DSHZ-300A）;電泳成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司，Tanon-2500）;超凈臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司，SW-CJ-IF）;水浴鍋（太倉精宏儀器有限公司，JINGHONG）;熒光定量PCR儀（德國耶拿分析儀器股份公司，MiniOpticon）;紫外-可見分光光度計（上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司，TU-1900）;圖像分析系統(tǒng)（Tanon，Image master VDS）。

1.2 方法

1.2.1 大腸桿菌E.coli BL21菌基因組提取

BL21菌液培養(yǎng)至測到菌液吸光值為OD=0.2-0.6時，根據(jù)上海莊盟生物科技有限公司基因組提取試劑盒說明書對BL21菌進行總DNA的提取。質(zhì)粒DNA提取方法參考小量質(zhì)粒抽提試劑盒內(nèi)說明書。提取后的質(zhì)粒DNA用紫外分光光度計測定其OD260/OD280的數(shù)值。

1.2.2 PCR擴增大腸桿菌uida保守基因片段

通過GenBank查找uida基因序列，通過BLAST比對篩選出更為保守的基因片段約為800bp，設(shè)計兩對PCR引物（如表1所示），采用表1中的uida-F/uida-R引物，以大腸桿菌基因組為模板，對大腸桿菌uida保守基因片段進行常規(guī)PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系共計50L，ddH2O 37.5L，基因組模板1L，10×PCR buffer 5L，2mM dNTP 4L，Taq酶（5U/L） 0.5L，上下游引物各1L。擴增反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性3min，94℃ 1min，56℃ 30s，72℃ 1min，30個循環(huán)進行延伸;4℃保溫10min。反應(yīng)結(jié)束后，取5LPCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，再由割膠回收試劑盒割膠回收，-20℃保存。

1.2.3 標(biāo)準品重組質(zhì)粒構(gòu)建

將上述克隆的uida基因片段通過TA克隆方法與pTA2載體連接[5]，反應(yīng)體系如下：目的基因7L，pTA2載體1L，T4連接酶1L，T4連接酶buffer 1L。16℃水浴連接16h后，將uida重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至TG1菌感受態(tài)細胞[6]中，均勻涂布到含氨芐的LB平板中，37℃培養(yǎng)12-16h。挑取單菌落培養(yǎng)過液后進行測序。抽提質(zhì)粒進行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，所獲得的重組質(zhì)粒命名為pTA2-uida。

1.2.4 熒光定量PCR條件優(yōu)化

熒光定量PCR引物采用表1中的quida-F1/quida-R1的引物，通過優(yōu)化熒光定量PCR反應(yīng)體中退火溫度，退火溫度選擇在55～65℃范圍內(nèi)，以1℃作為梯度進行優(yōu)化。最佳條件根據(jù)擴增曲線的Ct值和熔解曲線來判斷。

1.2.5 標(biāo)準曲線的建立

紫外分光光度計檢測得質(zhì)粒濃度為123ng/L，根據(jù)公式DNA（copies/L）=6.02×1023×DNA總量/（660×DNA長度）[7]得本次標(biāo)準質(zhì)粒的濃度為3×1010copies/L。用超純水稀釋30倍后再以10倍等濃度稀釋，選取稀釋度為10-3、10-4、10-5、10-6、10-7copies/L標(biāo)準品質(zhì)粒，利用優(yōu)化的熒光定量PCR反應(yīng)條件，同時設(shè)置陰性對照孔（以無菌水為模板）進行檢測，繪制擴增曲線與熔解曲線。最后，以X軸為Ct值，Y軸為拷貝數(shù)的對數(shù)建立標(biāo)準曲線。

1.2.6 靈敏度試驗

以uida基因克隆轉(zhuǎn)化得到的質(zhì)粒DNA為模板，進行系列梯度稀釋，選取5個梯度，各取3L稀釋度模板來進行熒光定量PCR，確定檢出下限。

1.2.7 重復(fù)性試驗

3次重復(fù)性測定107copies/L、105copies/L、103copies/L高中低三個梯度質(zhì)粒模板Ct值，分析梯度內(nèi)的Ct值和變異系數(shù)，以此評價方法的精確度[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 常規(guī)PCR擴增uida保守基因電泳圖鑒定

大腸桿菌uida保守基因擴增產(chǎn)物大小為759bp，電泳圖顯示目的條帶與預(yù)期的大小一致（如圖1所示）。

2.2 熒光定量PCR優(yōu)化體系構(gòu)建

系列梯度優(yōu)化后的熒光定量PCR的反應(yīng)體系（20L）如下，ddH2O7L，引物10.5L，引物20.5L，2×SYBR mix 10L，水樣模板1L。熒光定量PCR反應(yīng)程序：95℃ 2min，然后95℃ 11s，61℃ 30s，72℃ 20s，共40個循環(huán)。

2.3 標(biāo)準曲線的建立

2.3.1 擴增曲線與標(biāo)準曲線

選取5個梯度（103～107copies/L）的標(biāo)準重組質(zhì)粒，進行熒光定量PCR檢測，如圖2所示，曲線呈現(xiàn)S型，表明Ct值與濃度存在良好的線性關(guān)系。由此，以模板濃度對數(shù)值為縱坐標(biāo)，Ct值為橫坐標(biāo)建立熒光定量PCR檢測E.coli的標(biāo)準曲線（如圖3所示）。曲線回歸的標(biāo)準方程為：Y=-0.3823X+12.172（直線斜率A=-0.3823，截距B=12.172，X=模板濃度，單位為copies/L），且曲線的相關(guān)系數(shù)R2>0.98，說明可信度較高。

2.3.2 熔解曲線

選取5個濃度的標(biāo)準重組質(zhì)粒熒光定量PCR檢測后進一步進行熔解度曲線分析，不同濃度標(biāo)準品的熔解溫度均為83℃，呈單一峰，說明擴增條帶特異性較高。

2.4 靈敏度試驗

分析擴增曲線（如圖3）可知，模板濃度低至103copies/L時，仍可觀察到擴增曲線。熒光定量PCR最低可檢出每微升中，103copies/L的大腸桿菌DNA。此方法的靈敏度滿足對不同水樣的檢測要求。

2.5 重復(fù)性試驗

重復(fù)性測定107copies/L、105copies/L、103copies/L高中低三個梯度質(zhì)粒模板Ct值，計算平均值和變異系數(shù)（如表2所示）?？芍S濃度降低，擴增曲線的標(biāo)準差逐漸增大，變異系數(shù)則始終小于1%，則說明在合理的誤差范圍內(nèi)，建立的水質(zhì)熒光定量PCR方法重復(fù)性好。

2.6 水質(zhì)檢測結(jié)果

以建立的熒光定量PCR方法檢測水質(zhì)中大腸桿菌群，將測得的Ct值帶代入標(biāo)準曲線，計算不同來源水質(zhì)的拷貝數(shù)。結(jié)果表明，渾濁陰溝的大腸桿菌含量最高，自來水中大腸桿菌含量相對較少。

3 討論

大腸桿菌作為糞源性污染衛(wèi)生細菌學(xué)指標(biāo)，在環(huán)境水質(zhì)監(jiān)測中起著非常重要的指示作用。若水體中檢測出大腸桿菌則意味著水質(zhì)已被污染[9]。分布在自然界的大腸桿菌大多數(shù)是不致病的，主要附生在人或動物的腸道里，為正常菌群，但少數(shù)的大腸桿菌具有毒性，侵入人體時，可引起感染，如腹膜炎、膽囊炎、膀胱炎及腹瀉等[10]。對老人及小孩的感染可能是致命性的。因此，我國在飲用水方面的衛(wèi)生標(biāo)準限定100ml水樣中不得檢測出大腸桿菌，該標(biāo)準要求必須達到檢出單個細菌的水平。

目前，大腸桿菌群的固有檢測方法有多管發(fā)酵技術(shù)、膜過濾技術(shù)、酶聯(lián)免疫分析法等。傳統(tǒng)的多管發(fā)酵法費時費力;膜過濾技術(shù)檢測出來的誤差較大;酶聯(lián)免疫分析法則不具備廣泛性。因此，尋求建立快速、敏感的水質(zhì)大腸菌群檢測方法迫在眉睫。

本研究以uida為靶基因，設(shè)計特異性引物，優(yōu)化熒光定量PCR定量反應(yīng)條件，建立了大腸桿菌群的熒光定量檢測體系，此方法具有敏銳、迅速、特異、重復(fù)性好等優(yōu)點，對不同水樣的測試結(jié)果也表明此法具有較高的檢測能力和效率，大大減少了時間和人工成本，檢測靈敏高且精準，在飲用水工業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用前景。下一步將對熒光定量PCR定量檢測和傳統(tǒng)檢測方法進行比較研究，對兩者相關(guān)性進行探索，為水質(zhì)的快速檢測提供依據(jù)。

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