姜黃素抑制牙本質(zhì)膠原降解的初步研究

張 穎 王洪濤 張云燕

廣州市婦女兒童醫(yī)療中心口腔科(廣州 510623)

齲病是人類的常見病、多發(fā)病。通常當(dāng)患者因牙齒齲壞造成不適就診時，病損程度多已達牙本質(zhì)，形成牙本質(zhì)齲，患者可能會出現(xiàn)牙本質(zhì)敏感、咬合關(guān)系紊亂、牙髓暴露甚至更嚴(yán)重的牙齒折斷等，明顯降低患者的生活質(zhì)量。牙本質(zhì)是牙齒的主體，主要由有機質(zhì)和無機質(zhì)組成。在牙本質(zhì)的有機成分中，約90%為膠原。牙本質(zhì)齲的進展主要包括硬組織脫礦和有機質(zhì)的溶解，有機質(zhì)的溶解促進牙本質(zhì)的脫礦。有機質(zhì)的溶解與牙本質(zhì)中含有膠原蛋白酶相關(guān)。正常牙本質(zhì)基質(zhì)中存在潛在形式的前膠原蛋白酶，在齲損牙本質(zhì)中，細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物等刺激膠原蛋白酶顯示較高的活性，直接破壞牙本質(zhì)膠原，并加速牙本質(zhì)脫礦，進而加快牙本質(zhì)齲病的進程[1]。

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是牙本質(zhì)有機質(zhì)中含量最多的膠原蛋白酶之一，是降解牙本質(zhì)有機質(zhì)的主要蛋白水解酶。迄今為止在人類機體內(nèi)發(fā)現(xiàn)二十多種，而其中MMP2最早被證明存在于礦化的牙本質(zhì)中，是牙本質(zhì)中含量最多的MMPs，其次為MMP9[2]。因此提示降低MMPs活性是抑制牙本質(zhì)齲進展的方法之一。多項研究顯示姜黃素可以抑制腫瘤組織中MMP2、9的活性[3- 4]，但姜黃素對牙本質(zhì)中I型膠原的作用尚未見相關(guān)研究。本課題初步探討姜黃素對牙本質(zhì)齲進展過程中膠原降解程度的影響，為阻止牙本質(zhì)進一步齲壞提供新的思路和理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 牙本質(zhì)齲模型的建立

1.2 標(biāo)本的處理

取出脫礦的牙本質(zhì)塊，4℃下去離子水?dāng)嚢铔_洗72 h，徹底去除牙塊表面的脫礦液。然后將樣本隨機為五組：① 10 mmol/LDMSO組；② 2 mmol/L APMA(MPPs激活劑，膠原酶潛酶活化劑)組；③ 2 mmol/L EDTA(MPPs抑制劑)組；④ 姜黃素溶液(姜黃素取3 μmol/L、9 μmol/L、12 μmol/L三種濃度)組。將牙本質(zhì)齲標(biāo)本置于上述各組溶液中24 h，3 d，7 d，14 d，離心后吸取 100 μL的上清液使用Ⅰ型膠原吡啶交聯(lián)終肽(Cross-linked carboxyterminal telopeptide of type I collagen，ICTP)ELISA試劑盒(武漢純度生物, 中國)檢測ICPT的表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

將不同組間ICPT的濃度使用SPSS 13．0軟件進行方差分析，組間比較用q檢驗，顯著性標(biāo)準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 成功構(gòu)建牙本質(zhì)模型

經(jīng)過脫礦液處理后牙本質(zhì)呈瓷白色，表面粗糙，電鏡下見牙本質(zhì)小口完全開放，牙本質(zhì)小管口完全暴露，管口直徑約3 μm，牙本質(zhì)小管排列整齊；未經(jīng)脫礦液處理的牙本質(zhì)呈淡黃色，表面光滑，電鏡下觀察，見牙本質(zhì)小管內(nèi)大量的組織殘渣，甚至堵塞牙本質(zhì)小管，見圖1。

A.經(jīng)脫礦液處理后牙本質(zhì)表面形態(tài)B.未經(jīng)脫礦液處理的牙本質(zhì)表面形態(tài)圖1 牙本質(zhì)經(jīng)脫礦后表面形態(tài)(×2000)A.經(jīng)脫礦液處理后見牙本質(zhì)小管排列整齊,管內(nèi)清潔,無殘渣; B.未經(jīng)脫礦液處理的牙本質(zhì)小管內(nèi)大量的組織殘渣,甚至堵塞牙本質(zhì)小管

2.2 ICPT的檢測結(jié)果

浸泡溶液的成分和浸泡時間對ICTP的含量均有影響，見圖2。與APMA相比，牙本質(zhì)齲模型經(jīng)12 μmol/L的姜黃素處理24 h后，ICTP的濃度降至(0.49±0.04)ng/mL，(F=8.459，P<0.05)，而且隨著處理時間的延長，ICTP的濃度未見明顯升高。牙本質(zhì)齲模型經(jīng)APMA處理后ICTP濃度升高，且隨著浸泡時間的延長，ICTP濃度逐漸增加。與APMA相比，EDTA組ICTP的濃度在24 h后降低，仍高于姜黃素組(F=157.151，P<0.05)。說明姜黃素組能快速、有效地降低ICTP的表達水平。

圖2 ICPT的檢測結(jié)果

3 討 論

牙本質(zhì)是牙齒的主體，其化學(xué)組成主要是礦物質(zhì)，占其重量的70%，有機物和水占30%。在牙本質(zhì)有機成分中，約90%為膠原，以I型膠原含量最多，約占80%。

I型膠原聚集形成直徑約70～90 nm的主纖維，并與直徑約20～40 nm的非膠原蛋白組成的次級分支纖維相連接，構(gòu)成膠原纖維網(wǎng)，其結(jié)構(gòu)的完整性表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)中存在典型67 nm條帶[5]。

正常牙本質(zhì)基質(zhì)中存在潛在形式的前膠原酶，MMPs是牙本質(zhì)有機質(zhì)中含量最多的膠原蛋白酶之一。MMPs為內(nèi)肽酶，均以潛酶形式分泌，激活后能從肽鏈中間裂解底物，MMPs活性能為相應(yīng)的特異性抑制因子所抑制。MMPs是一組鋅依賴性蛋白酶，在中性條件下可以發(fā)揮降解細(xì)胞外基質(zhì)的作用，有鈣參與時活性最大，MMPs以無活性的前提形式存在，只用在活化后才能降解細(xì)胞外基質(zhì)[6]。

在齲損牙本質(zhì)中，MMPs顯示較高的活性，可破壞牙本質(zhì)膠原，并加速牙本質(zhì)脫礦[7]。研究顯示牙本質(zhì)中的MMPS以MMP2、MMP9為主，在牙冠部及根部均有分布。在齲壞牙本質(zhì)中MMP2，MMP9的活性增加。此外，牙本質(zhì)細(xì)胞分泌的MMP2，MMP9明顯增加，加速牙本質(zhì)齲病的進程。在治療齲病過程中，由于高速手機的刺激及口內(nèi)環(huán)境中水、酶等各種因素的影響，暴露的膠原纖維在牙本質(zhì)內(nèi)固有的MMPs等的作用下發(fā)生降解，使混合層的有機成分損耗，導(dǎo)致粘結(jié)破壞[8]；牙本質(zhì)中樹脂粘結(jié)單體擴散梯度降低，出現(xiàn)了沿著混合層底部的不完全滲透區(qū)域，部分膠原纖維暴露，MMPs被激活，而未被粘結(jié)樹脂包裹的膠原纖維會緩慢降解，同樣會影響樹脂粘結(jié)界面的退行性變，導(dǎo)致充填物脫落，治療失敗[9]。因此抑制牙本質(zhì)中MMPs的活性，減少I型膠原的降解是齲病治療的關(guān)鍵點之一。

目前臨床上主要有兩類MMPs活性抑制劑，分別為局部用藥和全身用藥。局部用藥將藥物直接涂布于患牙處，局部藥物濃度高，抑制MMPs活性的作用顯著，局部常用的抑制MMPs活性制劑主要有EDTA和0.2%醋酸氯己定等。EDTA盡管具有抑制MMPs活性的作用，但其化學(xué)成分促進牙本質(zhì)脫礦，副作用較大。0.2%醋酸氯己定體外用于抑制牙本質(zhì)MMPs的濃度大于常用的黏膜消毒濃度(0.05%)，外用刺激性大[10]。常用的全身用藥抑制MMPs活性的藥物如巴馬司他、馬立馬司他、MMI- 270等，常用于腫瘤患者，因毒性大、副作用多、外用性質(zhì)不穩(wěn)定、價格較貴等缺點[11]，限制其在牙本質(zhì)齲中的應(yīng)用。因此尋找一種安全、經(jīng)濟、有效的抑制MMPs活性的藥物，對齲病的防治顯得尤為重要。

姜黃素是從亞熱帶地區(qū)多年生草本植物姜黃根莖中提取的一種植物多酚，是姜黃中最重要的活性成分，姜黃素的化學(xué)結(jié)構(gòu)對稱，含有2個酚羥基、2個甲氧基、2個不飽和羰基和1個活潑的亞甲基，這些基團都是與生物大分子結(jié)合的潛在位點。同時，姜黃素毒性低，口服吸收少，生物利用度低，可溶于多種溶劑，在低pH值環(huán)境中性質(zhì)仍然穩(wěn)定[12]。這提示姜黃素是一種理想的外用劑型。多項研究顯示姜黃素具有抗腫瘤、抗炎和抗氧化等多方面藥理作用[13]。在腫瘤組織中姜黃素具有抑制MMP2、MMP9的活性，從而抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移等多種作用[14]。在牙本質(zhì)齲中，本實驗證實姜黃素降低I型膠原降解，在預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)姜黃素的濃度大于12 μmol/L時對細(xì)胞具有明顯的毒性。因此本研究中姜黃素的最高濃度選擇 12 μmol/L，當(dāng)姜黃素的濃度小于12 μmol/L時，隨著姜黃素濃度的增加牙本質(zhì)膠原降解的量明顯減少。鑒于姜黃素抑制膠原降解，并可以抑制變形鏈球菌生物膜形成的作用[15]，姜黃素具有開發(fā)成為阻止牙本質(zhì)齲進一步進展的天然藥物的潛能。

將來，我們將進一步挖掘姜黃素的藥理作用，開發(fā)姜黃素制劑用于治療和預(yù)防牙本質(zhì)齲。同時，進一步研究姜黃素抑制牙本質(zhì)膠原分解的機制。已有研究表明在不同的腫瘤中姜黃素作用于MMPs的分子機制不同。在口腔鱗狀細(xì)胞癌中姜黃素通過p53-E-Cadherin表達，抑制MMP2、MMP9活性，抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[16]。在乳腺癌的模型中，姜黃素通過抑制IκBα激酶活性，抑制IκBα磷酸化和降解，從而通過抑制NF-κB通路，降低MMP2、MMP9的表達和活性[17]。姜黃素加入肝癌細(xì)胞培養(yǎng)液中，抑制AKT 和STAT3磷酸化，抑制MMP9活性，從而抑制血管生成[18]。在牙體硬組織中姜黃素作用的具體分子機制不明，我們將進一步深入研究，豐富姜黃素的作用機理。