鐵皮石斛氨基酸通透酶基因(DoAAP2)的克隆及表達(dá)分析

劉楚琪， 胡 睿， 王萬軍

(西南交通大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 成都 610031)

氮是植物生長發(fā)育所必需的一種礦物營養(yǎng)物質(zhì)，在植物的生命活動中起重要作用[1]。土壤氮分為無機氮和有機氮，表土中90%的氮以有機氮形式存在，其中氨基酸態(tài)氮所占比例達(dá)20%～40%[2]。氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成部分，在新陳代謝、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生長發(fā)育等方面起重要作用[3]。在植物中，氨基酸對提高其產(chǎn)量、改善產(chǎn)品品質(zhì)、增強植株抗逆性及保護(hù)生態(tài)環(huán)境等方面發(fā)揮著重要的作用[4]。研究表明，植物對氨基酸的吸收主要是協(xié)同運輸，需要載體、能量共同完成，受溫度、pH值、土壤類型的影響，吸收動力學(xué)符合米氏方程[5-6]。氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白是高等植物中介導(dǎo)氨基酸跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運的一種完整的膜蛋白，在植物生長發(fā)育的各個過程中起著不可或缺的作用，包括長距離的氨基酸轉(zhuǎn)運、對病原體的響應(yīng)和非生物脅迫等[7]，不同部位的氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白對植物的生命活動有不同的影響，如葉的發(fā)育、果莢和種子的數(shù)量等。氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白主要包括氨基酸多胺膽堿轉(zhuǎn)運蛋白超家族(Amino acid-polyamine-choline transporter superfamily, APC)和氨基酸/生長素滲透酶超家族(amino acid/auxin permease superfamily, AAAP)。APC超家族包括陽離子氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白(cationic amino acid transporters, CATs)，L-型氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白(L-type amino acid transporters, LATs)；AAAP家族包括氨基酸通透酶家族(amino acid permease, AAPs)，賴氨酸和組氨酸轉(zhuǎn)運蛋白(lysine histidine-like transporters, LHTs), 脯氨酸轉(zhuǎn)運蛋白(proline transporters, ProTs)，生長素轉(zhuǎn)運蛋白(auxin-resistant, AUXs)，氨基丁酸轉(zhuǎn)運體(γ-aminobutyric acid transporters, GATs)，芳香族和中性氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白(ANT1-like aromatic and neutral amino acid transporters, ANTs)6個亞家族[8-10]。其中，對氨基酸通透酶參與多種生命活動的研究最為廣泛[11]。AAPs的相對分子質(zhì)量相差不大，一般含有475～496個氨基酸，并且都含有一個典型的Aa trans(氨基酸轉(zhuǎn)運)結(jié)構(gòu)域[12]，具有特異性和親和力。目前，氨基酸通透酶在擬南芥、玉米、水稻等植物中都有所研究，但在蘭科植物鐵皮石斛研究較少。

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraetMigo)為蘭科石斛屬多年生附生草本植物，具有滋陰清熱、益胃生津等功效。由于其特殊的生長發(fā)育機制被廣泛研究[13-14]。鐵皮石斛中含有豐富的氨基酸，研究表明，不同產(chǎn)地、部位、生理年齡對其氨基酸含量都有所影響[15-17]。本文以鐵皮石斛為試驗材料，通過cDNA末端快速擴增(Rapid - amplification of cDNA ends, RACE)技術(shù)對DoAAP2進(jìn)行克隆，并對該基因在鐵皮石斛不同組織及生長發(fā)育不同階段進(jìn)行表達(dá)分析，結(jié)合生物信息學(xué)分析，推測該基因在鐵皮石斛生長發(fā)育過程的功能及表達(dá)模式，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

鐵皮石斛的種子來源于云南，接種于不含激素的1/2MS培養(yǎng)基上，在室溫25 ℃，光照16 h/d的條件下無菌培養(yǎng)，經(jīng)原球莖發(fā)育為完整植株。

選取單株長約6 cm，具有5～6片葉的鐵皮石斛新鮮幼苗，取其根、莖、葉各100 mg。另外選取鐵皮石斛成熟種子以及培養(yǎng)過程中處于種胚活化期(P1)、原球莖形成期(P2)、原分生組織形成期(P3)、頂端分生組織形成期(P4)、橢球形原球莖期(P5)、葉原基維管系統(tǒng)形成期(P6)、根端分生組織形成期(P7) 共 7 個時期的原球莖各100 mg。

以上樣品經(jīng)液氮速凍后放入-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗方法

1.2.1 鐵皮石斛總RNA提取及cDNA的合成

取上述凍存樣品，使用植物RNA提取試劑盒Plant RNA Kit對各試驗材料進(jìn)行總RNA提取，試劑盒購于Omega BIO-TEK公司，用RNase-freeDNaseI (TaKaRa公司) 去除總RNA中的基因組污染。所提取的RNA經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳及OD260/OD280值檢測，要求具有清晰的28S rRNA和18S rRNA條帶、無彌散條帶且OD260/OD280為1.8～2.1。選取符合要求的RNA為逆轉(zhuǎn)錄材料，采用TaKaRa公司的Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-) 試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用于后續(xù)的基因克隆及熒光定量PCR。

1.2.2DoAAP2基因克隆及測序

根據(jù)實驗室已獲得的鐵皮石斛轉(zhuǎn)錄組序列采用primer premier5.0設(shè)計DoAAP2的3′巢式PCR引物(表1)并交由上海生工公司合成。以cDNA為模板進(jìn)行目的基因的擴增。

PCR反應(yīng)體系：EasyTaqDNA Polymerase 0.15 μL、正向引物1 μL、反向引物1 μL、cDNA模板1 μL、ddH2O 19.35 μL、dNTPmix 1 μL、EasyTaqbuffer 2.5 μL，總體系為25 μL。

PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。

PCR產(chǎn)物用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的片段用膠回收試劑盒(公司)回收，連接至pGEM-T easy載體，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a，經(jīng)藍(lán)白斑篩選及菌液PCR后送至上海生物工程公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果經(jīng)NCBI比對。根據(jù)測序所得的序列設(shè)計qRT-PCR引物用于實時熒光定量 PCR 實驗(表1)。

表1 DoAAP2克隆引物及qRT-PCR所用引物

1.2.3 生物信息學(xué)分析

將所得核酸序列用BioXM2.6進(jìn)行開放閱讀框的查找并將其翻譯為蛋白序列。

運用NCBI上的BLAST (http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/) 檢索近緣物種的基因序列信息，通過DNAMAN進(jìn)行比對分析；利用PSORT Prediction (http://pso-rt.hgc.jp/form.html)對DoAAP進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測；利用SOPMA (https://npsaprabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html) 分析蛋白質(zhì)序列二級結(jié)構(gòu)；利用TMHMM Server v.2.0 (http://www.cbs.dt-u.dk/services/TMHMM-2.0/) 預(yù)測DoAAP2的跨膜區(qū)；利用Signal 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 分析蛋白質(zhì)信號肽；利用ProtParam分析DoAAP2的基本理化性質(zhì)；利用GSDS2.0 (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/) 分析DoAAP2完整CDS序列和全基因組序列。

1.2.4 構(gòu)建DoAAP2基因編碼氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

以DoAAP2基因編碼的氨基酸序列在NCBI上進(jìn)行blastp搜索，選取相似性≥71%的不同物種序列，共38條。采用ClustalX軟件進(jìn)行序列比對，采用MEGA6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5 熒光定量PCR分析

根據(jù)熒光定量PCR引物設(shè)計原則，使用Primer Primer 5. 0對DoAAP2設(shè)計定量引物，另選用鐵皮石斛的管家基因DoActinl(β-actin,β-肌動蛋白) 和DoGAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, 甘油醛-3-磷酸脫氫酶)為內(nèi)參基因，引物序列見表1所示，送至上海生工公司合成。

熒光定量PCR反應(yīng)體系：2×T5 Fast qPCR Mix (Probe) 12.5 μL、Rorword primer 1 μL，Reverse primer 1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL，總體系為25 μL，試劑購于北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司。

熒光定量PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火5 s，72 ℃延伸15 s，40個循環(huán)；溶解；冷卻。

每一樣本設(shè)立3組技術(shù)重復(fù)，3組生物學(xué)重復(fù)。誤差分析采用LightCycler? 96 SW 1.1 軟件；相對表達(dá)量分析采用2-ΔΔCt分析方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 DoAAP2基因的克隆及序列分析

圖1 DoAAP2 PCR 擴增結(jié)果

利用氨基酸通透酶基因特異引物，通過3′-RACE克隆獲得了一條長925 bp的3′-端序列(圖1)，與鐵皮石斛基因組CDS數(shù)據(jù)庫中的DoAAP序列比對并拼接后得到一條長度為1722 bp的DoAAP基因序列，且在其3′-端具有一個含17個A的poly (A) 尾，根據(jù)NCBI Blastn比對情況將之命名為DoAAP2，拼接后序列的3′-端和5′-端各有一個非編碼區(qū)，分別由87個和143個核苷酸組成。利用BioXM軟件分析，該基因開放閱讀框(ORF)長度為1490 bp，編碼496個氨基酸殘基(圖2)。通過Smart (http://smart.embl-heidelberg.de/) 分析該基因所編碼的蛋白序列，確定該蛋白具有完整的Aa trans(氨基酸轉(zhuǎn)運)結(jié)構(gòu)域，共437個氨基酸，位于47～484位氨基酸殘基。通過NCBI blastp分析，選取與DoAAP2相似性最高的13種不同物種的AAP序列進(jìn)行多序列比對(圖3)，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)該蛋白在結(jié)構(gòu)域內(nèi)保守性高，結(jié)構(gòu)域如圖3紅色線框所示，證明該蛋白確為氨基酸通透酶(AAPs)。

圖2 DoAAP2的核酸序列與氨基酸序列

圖3 多物種氨基酸序列比對

通過Gene Structure Display Server 2.0 (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/) 分析DoAAP2基因的完整CDS序列和全基因組序列，結(jié)果顯示DoAAP2基因共含有6個外顯子和5個內(nèi)含子(圖4-A)。

2.2 DoAAP2的生物信息學(xué)分析

通過ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/) 預(yù)測所得，DoAAP2所編碼的蛋白共有493個氨基酸，分子式為C2519H3860N606O677S24，相對分子質(zhì)量為54 235.45 u，理論等電點(pI)為8.57；所帶的負(fù)電荷(Asp+Glu)總數(shù)為30，正電荷(Arg+Lys)總數(shù)為35，則該蛋白帶正電荷；不穩(wěn)定系數(shù)為36.71，表明該蛋白為穩(wěn)定蛋白。

A：DoAAP2基因結(jié)構(gòu)，B：DoAAP2跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測；C：DoAAP2信號肽預(yù)測；D：DoAAP2 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

通過TMHMM Server v. 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/) 預(yù)測DoAAP2共有9個跨膜區(qū)(圖4-B)，證明該蛋白與跨膜轉(zhuǎn)運相關(guān)。

通過SignalP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測該蛋白不含信號肽(圖4-C)。

通過SOPMA (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl page=npsa_so- pma.html) 預(yù)測DoAAP2蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示該蛋白α-螺旋的比例為45.03%，β-折疊的比例為3.04%，延伸鏈的比例為17.24%，無規(guī)卷曲的比例為34.9%(圖4-D)。

通過PSORT Prediction (http://psort1.hgc.jp/form.html) 對蛋白DoAAP2進(jìn)行亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示該蛋白主要存在于細(xì)胞質(zhì)膜、葉綠體類囊體膜、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，可能性分別為：60%、42.4%、40%和30%。推斷該蛋白可能與氨基酸的吸收和轉(zhuǎn)運及植物的光合作用有關(guān)。

2.3 DoAAP2蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

將DoAAP2的氨基酸序列與已選取的38條不同物種相似性高的序列通過ClustalX比對后，利用Mega6.0構(gòu)建進(jìn)化樹。結(jié)果如圖5所示，不同植物的AAPs共可分為3部分，記為A、B、C 3組。其中DoAAP2所在的A組全為單子葉植物，B、C兩組親緣關(guān)系較近，且全為雙子葉植物。DoAAP2與PeAAP3親緣關(guān)系最近，這符合鐵皮石斛與小蘭與蝴蝶蘭同屬蘭科單子葉植物的特征。

圖5 不同物種AAP蛋白系統(tǒng)發(fā)育分析

2.4 DoAAP2在不同組織及原球莖發(fā)育不同時期的基因表達(dá)分析

利用qRT-PCR技術(shù)對DoAAP2進(jìn)行分析，以采用2-△△Ct方法對原始Ct值進(jìn)行計算后得出DoAAP2基因的相對表達(dá)量。DoAAP2在鐵皮石斛不同組織中表達(dá)有所差異(圖6)，在根、莖、葉中表達(dá)量相對較高，其中，DoAAP2在葉的表達(dá)量最高，約是根的2.37倍；而在愈傷組織中的表達(dá)量極低，僅為根的表達(dá)量的1%。

R、St、L、C分別代表鐵皮石斛根、莖、葉、愈傷組織

DoAAP2在鐵皮石斛原球莖發(fā)育的不同時期表達(dá)量也有所不同，以原球莖形成時期(P2)為基準(zhǔn)，分別測定了種胚活化期(P1)，原分生組織形成(P3)，頂端分生組織(P4)，橢球形原球莖時期(P5)、葉原基維管系統(tǒng)形成(P6)和根端分生組織形成(P7)共7個時期以及類原球莖的相對表達(dá)量。結(jié)果如圖7所示，DoAAP2在鐵皮石斛原球莖發(fā)育前6個時期的表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢，在原分生組織形成時期達(dá)到頂峰，約為原球莖形成時期的2.26倍，在橢球形原球莖時期和葉原基維管系統(tǒng)形成時期表達(dá)量較低，相比原球莖形成時期分別下降了68.2%和81.9%；另外，DoAAP2在根端分生組織形成時期表達(dá)量驟升，約為原球莖形成時期表達(dá)量的1.64倍，而在類原球莖時期表達(dá)量又有所下降，相比原球莖形成時期下降了68.5%。

P1-P7分別代表鐵皮石斛種胚活化期，原球莖形成，原分生組織形成，頂端分生組織形成，橢球形原球莖時期、葉原基維管系統(tǒng)形成和根端分生組織形成時期；PLBs代表類原球莖時期

3 討論

氨基酸通透酶(AAP)是植物中重要的氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白，在氨基酸吸收、轉(zhuǎn)運等方面具有重要作用。本研究針對鐵皮石斛DoAAP2的結(jié)構(gòu)、功能及表達(dá)進(jìn)行分析。

生物信息學(xué)分析表明，DoAAP2開放閱讀框(ORF)長度為1482 bp，編碼493個氨基酸，含有完整的Aa trans結(jié)構(gòu)域，具有6個外顯子和5個內(nèi)含子。DoAAP2所編碼的蛋白含有9個跨膜區(qū)，與其為跨膜轉(zhuǎn)運蛋白相關(guān)；生物信息學(xué)預(yù)測其亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)膜、葉綠體類囊體膜、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，推斷該蛋白可能與氨基酸的吸收和轉(zhuǎn)運及植物的光合作用有關(guān)。

多序列比對顯示，DoAAP2在結(jié)構(gòu)域內(nèi)保守性高。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示該蛋白與同為蘭科的小蘭嶼蝴蝶蘭、深圳擬蘭同源性最高，另與鳳梨、油棕、海藻、高粱、短柄草等11種植物同屬一個分支，構(gòu)成A群，這些植物的共同特征為同為單子葉植物。

氨基酸在植物中作為前體化合物存在于蛋白質(zhì)合成及多個代謝途徑中，如激素、木質(zhì)素合成[18]。氨基酸通透酶作為氨基酸的轉(zhuǎn)運載體在植物各個組織及生長各個時期都起著重要的作用。目前AAPs在擬南芥中的研究最為廣泛，AtAAP1在根部表達(dá)，轉(zhuǎn)運土壤中的谷氨酸、組氨酸和中性氨基酸[19]，另外，AtAAP1還在種子中表達(dá)量高，具有調(diào)控胚乳吸收氨基酸的功能[20]。AtAAP8同樣在種子中表達(dá)[21]，該基因突變體的結(jié)實率降低了約50%[22]；AtAAP3主要在根的維管束組織中表達(dá)，可能具有從韌皮部吸收氨基酸或從土壤中轉(zhuǎn)運氨基酸的功能[23]；AtAAP2、AtAAP6分別在韌皮部、木質(zhì)部中表達(dá)[24-25]，AtAAP5在擬南芥的各個組織中都有所表達(dá)[26]，在根系吸收氨基酸方面起重要作用[27]。Taylor等[28]從水稻中鑒定出19個氨基酸通透酶(AAP)基因，其中，OsAAP1在種子中表達(dá)量最高，轉(zhuǎn)運中性及帶正電荷的氨基酸；OsAAP3在水稻的所有器官中都有所表達(dá)，其中根的表達(dá)量最高，并且具有明顯的底物特異性，能轉(zhuǎn)運賴氨酸和精氨酸，但對芳香族氨基酸具有選擇性；OsAAP7以及OsAAP16作為普通氨基酸通透酶，與擬南芥AAPs的功能類似。AAPs在豌豆、蠶豆、玉米、楊樹等植物中也有所研究，都表明AAPs在植物生長發(fā)育中發(fā)揮的重要作用[29-31]。

DoAAP2在鐵皮石斛不同組織及原球莖發(fā)育各個階段均有表達(dá)。在各組織中，DoAAP2在莖和葉中表達(dá)量較高，結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測其亞細(xì)胞定位于葉綠體類囊體膜，推測該蛋白可能與植物的光合作用，特別是光反應(yīng)有關(guān)，具有為植物體提供能量、有機物等重要物質(zhì)的作用。DoAAP2在原球莖發(fā)育時期均有表達(dá)，表明該基因?qū)υ蚯o的形態(tài)發(fā)生有著非常重要的作用；在原球莖形成初期活化種胚，在原球莖發(fā)育成苗的過程中，如原分生組織形成(P3)、頂端分生組織形成(P4)、根端分生組織形成(P7)時期表達(dá)量較高，表明該基因?qū)﹁F皮石斛根、莖的發(fā)育起重要作用。另外，DoAAP2在體胚誘導(dǎo)的類原球莖中表達(dá)較低，表明類原球莖形態(tài)雖與原球莖相似，但基因表達(dá)有所差異，發(fā)育過程也不盡相同。