載藥脂肪乳的質(zhì)量控制進展

文/董武軍 葉軍 通訊作者/吳朝陽

脂 肪 乳（lipid/fate mulsion）是以植物來源為主的液態(tài)甘油三酯為油相，磷脂為主要表面活性劑，在高壓均質(zhì)等外力作用下乳化制成的水包油乳狀液，通常平均粒徑為100～500 nm，其粒徑大小、結(jié)構(gòu)與體內(nèi)乳糜微粒類似。脂肪乳始于1961年在瑞典成功上市的腸外營養(yǎng)型脂肪乳注射液Intralipid?，作為一種安全的機體能量和必需脂肪酸補充劑，營養(yǎng)脂肪乳現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床[1]。隨著臨床的應(yīng)用需要和藥物遞送技術(shù)研究的深入，脂肪乳現(xiàn)已成為難溶性藥物遞送的一種優(yōu)良載體，其具有獨特的優(yōu)點：將藥物包載在油相中，可提高藥物的溶解度和穩(wěn)定性；同時由于包載效應(yīng)，可以明顯降低藥物刺激性和不良反應(yīng)；以精制植物油和卵磷脂為主要載體材料的營養(yǎng)脂肪乳注射液已有多年臨床應(yīng)用歷史，安全性風(fēng)險低；能夠耐高壓滅菌且易于工業(yè)化大生產(chǎn)等[2]。

然而，脂肪乳作為一種熱力學(xué)不穩(wěn)定的乳狀分散體系，其處方和制備工藝等因素均有可能影響其質(zhì)量，尤其是穩(wěn)定性，可能發(fā)生聚集或絮凝（flocculation）、分層（creaming）和合并（coalescence），最終導(dǎo)致破乳（demulsification，油水相分離），載藥后藥物往往會影響油水界面膜結(jié)構(gòu)和特性，導(dǎo)致穩(wěn)定性發(fā)生變化，同時脂肪乳還存在包封率不高等問題。這給載藥脂肪乳處方工藝研究增加了難度，也為質(zhì)量控制帶來了巨大挑戰(zhàn)。本文匯總國內(nèi)外載藥脂肪乳產(chǎn)品上市情況和質(zhì)量控制現(xiàn)狀，并針對其載體特性，介紹了載藥脂肪乳關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)評價技術(shù)和方法，為載藥脂肪乳質(zhì)量研究和控制提供一定的參考。

1.概述

1.1 載藥脂肪乳發(fā)展概況

脂肪乳作為藥物遞送載體，以其優(yōu)良的性能、良好的安全性和比較成熟的制備工藝受到廣泛關(guān)注。國內(nèi)外已有多種載藥脂肪乳制劑上市（表1），臨床上主要應(yīng)用于麻醉、心血管病治療、抗腫瘤等；其中非傳統(tǒng)載藥脂肪乳——環(huán)孢素眼用乳劑和二氟潑尼酯眼用乳劑以蓖麻油和聚山梨酯80為主要載體材料，其他治療型脂肪乳商品制劑多以經(jīng)典營養(yǎng)型脂肪乳注射液Intralipid?的處方和工藝為基礎(chǔ)。近年來，國內(nèi)外在提高脂肪乳載藥量和穩(wěn)定性，延長其體內(nèi)循環(huán)以及增強靶向性等研究不斷深入，同時不再主要局限于注射途徑給藥，在口服，眼、鼻腔及肺部給藥也有廣泛研究[2-4]。

1.2 載藥脂肪乳質(zhì)量控制要求

1.2.1 國內(nèi)外藥典質(zhì)量控制情況

《中國藥典》2015年版（ChP2015）制劑通則規(guī)定了口服乳劑的離心穩(wěn)定性（約1800 r/min離心15分鐘）和相分離再分散的特定要求；規(guī)定了乳狀型注射液不得有相分離現(xiàn)象和乳滴粒徑分布要求?！睹绹幍洹?2版（USP42）制劑通則中規(guī)定了用于靜脈給藥的脂肪乳一般性檢查項和粒度特定檢查項；脂肪乳注射液（lipid injectable emulsion）通則規(guī)定了脂肪酸組成、細菌內(nèi)毒素、pH、粒度、游離脂肪酸以及包裝和貯藏、標(biāo)簽等一般性要求；USP<729>Globule size distribution in lipid injectable emulsions規(guī)定了脂肪乳注射液平均粒徑和5μm以上大粒子的測定方法和限度要求。國內(nèi)外主要藥典收載的載藥脂肪乳品種較少，僅收載了丙泊酚脂肪乳注射液[ChP2015第一增補本、USP42、《英國藥典》2019年版（BP2019）]和前列地爾脂肪乳注射液[《日本藥典》17版（JP17）]，相關(guān)考察項目匯總見表2。

表1 部分國內(nèi)外上市載藥脂肪乳品種

1.2.2 國內(nèi)外載藥脂肪乳相關(guān)指導(dǎo)原則

國內(nèi)還沒有載藥脂肪乳的特定指導(dǎo)原則，僅在ChP2015《9014微粒制劑指導(dǎo)原則》提出了殘留溶劑、形態(tài)、粒徑及其分布、載藥量、包封率、突釋效應(yīng)或滲漏率、氧化程度等微粒制劑應(yīng)檢查項目的原則性要求。美國食品藥品管理局（FDA）分別于2016年6月、10月和2017年2月發(fā)布了丙泊酚脂肪乳注射液、環(huán)孢素眼用乳劑和二氟潑尼酯眼用乳劑的研究指導(dǎo)原則草案，闡明了推薦的體外研究和體內(nèi)研究兩種證明生物等效的研究方法。體外研究首先要求仿制制劑處方組成（Q1）和輔料用量（Q2，差異在5%以內(nèi)）與參比制劑相同，需要對粒徑及其分布、動力黏度特征、pH值、Zeta電位、滲透壓、游離酸、藥物相分布等理化特性進行研究和相似性比較，并采用基于乳滴粒徑及其分布（中位徑D50和徑距（SPAN）或強度權(quán)重平均粒徑和多分散系數(shù)）的體外群體生物等效 性（population bioequivalence，PBE）方法或采用針對粒度呈現(xiàn)復(fù)雜多峰分布的earth mover' s distance（EMD）等統(tǒng)計學(xué)方法比較粒度的相似性。還要求采用對生產(chǎn)工藝變化有區(qū)分力的釋放方法進行體外釋放的比較研究。另外，丙泊酚脂肪乳注射液還要求考察仿制制劑與5%葡萄糖注射液配伍的穩(wěn)定性，以及與參比制劑比較在乳酸林格注射液、5%葡萄糖0.45%氯化鈉注射液中的相容性。如果與參比制劑輔料不同或者體外特性不具有可比性，仿制制劑應(yīng)進行體內(nèi)生物等效性研究。

表2 藥典收載的載藥脂肪乳質(zhì)量控制相關(guān)項目匯總

隨著丙泊酚脂肪乳注射液（丙泊酚乳狀注射液）新增訂入ChP2015第一增補本，國內(nèi)在營養(yǎng)型脂肪乳質(zhì)量控制基礎(chǔ)上對載藥脂肪乳尤其脂肪乳注射液的質(zhì)量要求逐漸明確和完善，特別是對過氧化值、甲氧基苯胺值、溶血磷脂、大于5μm乳粒等通用安全性指標(biāo)的控制日益加強，但針對體現(xiàn)脂肪乳載體特性的質(zhì)量指標(biāo)的理解和關(guān)注還不夠。

2.載藥脂肪乳載體特性關(guān)鍵質(zhì)量控制指標(biāo)

2.1 粒度

2.1.1 平均粒徑及粒徑分布

脂肪乳屬亞微乳分散系統(tǒng)，粒徑及其分布與其有效性、安全性密切相關(guān)，也是影響乳劑穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素。乳滴粒徑越小、分布越窄，越有利于乳劑的穩(wěn)定。ChP2015規(guī)定丙泊酚脂肪乳注射液的乳粒體積平均粒徑或光強平均粒徑應(yīng)小于0.5μm，注射劑通則還規(guī)定靜脈用乳狀型注射液中90%的乳滴粒徑應(yīng)在1μm以下；USP<729>同樣規(guī)定靜脈注射用脂肪乳平均粒徑應(yīng)小于500 nm。通常采用經(jīng)典光散射法或動態(tài)光散 射 法（dynamic light scattering，DLS；也稱光子相關(guān)光譜法photon correlation spectroscopy）測定脂肪乳平均粒徑及粒徑分布，還有電子顯微鏡法、納米顆粒跟蹤分析技術(shù)（nanoparticle tracking analysis）、二維擴散排序核磁共振法（2D DOSY-NMR）等用于脂肪乳粒度的測定[5]。經(jīng)典散射光法建立在散射光的能量分布與顆粒大小密切相關(guān)的基礎(chǔ)上，依據(jù)米氏散射理論和弗朗霍夫近似理論通過迭代反演運算計算出顆粒的粒度，粒徑測定范圍可達0.01～3500μm，通常采用體積平均粒徑D[4，3]或中位徑D50，用D10、D90結(jié)合 D50或者徑距（SPAN）表示粒徑分布特征；而動態(tài)光散射法是基于布朗運動，通過精確測量粒子散射光強度隨時間起伏的變化獲得有效擴散系數(shù)再由Stokes-Einstein方程得到樣品顆粒大小，由于其測量依賴于粒子布朗運動，僅適用于10μm以下顆粒粒徑的測量，通常采用光強平均粒徑或Z均粒徑，用多分散系數(shù)（PI）、方差等表示粒徑分布特征[6]。

粒度結(jié)果與測定原理和計算軟件相關(guān)，還與儀器參數(shù)和樣品處理等密切有關(guān)，因此需要采用標(biāo)準(zhǔn)粒子對儀器進行評價，優(yōu)化光學(xué)參數(shù)、樣品稀釋倍數(shù)等，并對系統(tǒng)適用性、精密度和耐用性等進行驗證。通常采用由實際測量結(jié)果與理論值的擬合殘差或誤差、重復(fù)性等作為優(yōu)化指標(biāo)。陳華等[7]對丙泊酚脂肪乳粒徑測定方法及儀器參數(shù)的設(shè)置進行了初步研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)典散射光法的遮光度、吸收率和折射率等光學(xué)參數(shù)均對粒徑有明顯影響，因此在脂肪乳粒徑研究和評價時要注意粒度分析儀器的參數(shù)，不同粒度數(shù)據(jù)的可比性；同時發(fā)現(xiàn)不同原理的設(shè)備測定結(jié)果存在差異，可能要設(shè)置不同的粒度限度，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定的時候要明確乳滴粒徑的測定方法。另有研究發(fā)現(xiàn)Nicomp曲線分布分析模型比Gaussian曲線分布能有效表征復(fù)雜的粒徑多峰分布，更適合脂肪乳處方、工藝的優(yōu)化和評估[8]。

2.1.2 大于5μm的大粒子

脂肪乳乳滴的粒徑大多數(shù)在500 nm以下，但由于受處方組成、制備工藝或貯存條件的影響，極易產(chǎn)生大乳滴。研究表明，5μm以上的乳滴與脂肪乳的穩(wěn)定性、安全性密切相關(guān)，同時也反映了脂肪乳研發(fā)和制備水平[9，10]。為此，國內(nèi)外藥典除對脂肪乳注射液的平均粒徑進行規(guī)定外，還對其5μm以上的尾部大粒子進行了嚴(yán)格控制。2004年USP<729>就推薦采用基于單粒子光學(xué)傳感技術(shù)的光阻法或消光法（LE/SPOS法）控制大粒子，規(guī)定PFAT5（the volume-weighted percentage of fat greater than 5μm）不超過0.05%。ChP2010采用顯微鏡法檢測，規(guī)定大于5μm的乳滴不得檢出；ChP2015丙泊酚脂肪乳注射液和脂肪乳注射 液（C14～24）參 照 USP采 用LE/SPOS法，測定5μm以上的大粒子，并規(guī)定大于5μm的乳粒加權(quán)總體積不得過油相體積的0.05%。

顯微鏡法直觀，不受樣品中氣泡等影響，但因視野有限和人工觀察，難以有效捕捉大乳滴，且易受人為因素影響，不能準(zhǔn)確客觀反映脂肪乳中大粒子水平。經(jīng)典光散射法和動態(tài)光散射法對于脂肪乳中比例極少的5μm以上的乳滴，響應(yīng)靈敏度低，不能用于大粒子控制。庫爾特計數(shù)法、普通光阻法等方法，由于測定時加入電解質(zhì)，可能會導(dǎo)致乳滴聚集或破裂和（或）不能逐個檢測粒子而造成假象，同樣也不適合用于脂肪乳的大粒子控制。LE/SPOS法的檢測信號來自對單個粒子的快速檢測，能有效避免粒子重疊產(chǎn)生的誤差和假象，同時對脂肪乳中絕大部分（體積比＞99.9%）粒徑小于1.0μm的乳滴不響應(yīng)，對大乳滴檢測靈敏高、分辨率好、專屬性強[11]。

2.2 包封率和相分布

2.2.1 包封率

脂肪乳中包封的藥物與游離藥物存在不同的體內(nèi)外特征，因此包封率是評價脂肪乳處方、工藝和質(zhì)量的重要指標(biāo)，也是其能否發(fā)揮高效、低毒等遞送特性的關(guān)鍵。脂肪乳與其他微粒制劑一樣通常先采用適當(dāng)?shù)姆椒▽⒂坞x的藥物與含藥乳滴分離，再測定藥物量計算得到包封率。常用的分離方法包括透析法、離心超濾法、超速離心法、葡聚糖凝膠柱法、微柱離心法等[12]，見表3；另外，還有微滲析法、離子交換樹脂法等用于脂肪乳包封率測定的研究報道[13]。

將游離的藥物與包封的藥物完全分離并準(zhǔn)確定量是包封率測定的關(guān)鍵，因此在建立和驗證包封率方法時應(yīng)重點關(guān)注分離情況及其回收率，可選擇大豆油、磷脂等載體輔料作為輔助監(jiān)測指標(biāo)或采用不同包封狀態(tài)的脂肪乳等對洗脫或分離程度進行驗證。宮曉菲等[14]通過考察洗脫過程中紫杉醇結(jié)合脂肪乳中大豆油的含量，并繪制藥物不完全包封的載藥脂肪乳洗脫曲線，發(fā)現(xiàn)微柱離心法可有效分離脂肪乳中游離的藥物與包封的藥物且柱回收率良好，可準(zhǔn)確用于紫杉醇脂肪乳包封率的測定。另外，由于脂肪乳中包封的藥物通常脂溶性較好而水溶性較差，在脂肪乳制備或者包封率測定的分離過程中可能出現(xiàn)藥物沉淀析出或漂浮在表面，應(yīng)注意取樣的合理性和分離方法的選擇，并關(guān)注包封率方法的區(qū)分力。

表3 常用載藥脂肪乳包封率測定分離方法

2.2.2 相分布

脂肪乳分散體系中存在水相、油相和油水磷脂界面層，甚至過量的磷脂等乳化劑在水相中還能形成膠束或類脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)。因此相分布較包封率更能可靠、客觀地評價脂肪乳的載藥性能，也更能準(zhǔn)確地預(yù)測和分析脂肪乳的體內(nèi)外行為。藥物理化性質(zhì)、制備方法、油相及乳化劑等都會對相分布產(chǎn)生影響。藥物的表觀油水分配系數(shù)越大，脂溶性越高，越有利于藥物在油相分布，水溶性和親脂性均不好或者經(jīng)磷脂復(fù)合超分子等技術(shù)增溶的藥物大多分布在油水界面磷脂層[15，16]。

常采用低溫高速離心法測定載藥脂肪乳中藥物相分布，目前還有微滲析法、熒光標(biāo)記-共聚焦顯微鏡法等報道[17]。林翠翠[18]利用低溫超速離心法結(jié)合超濾離心法對尼莫地平脂肪乳中藥物的相分布進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅約0.47%的藥物游離在水相中，約14.91%的藥物分布于膠束/類脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)中，約34.03%的藥物分布于油相中，約50.59%的藥物分布于脂肪乳的油水界面層中。進一步采用核磁共振技術(shù)，發(fā)現(xiàn)二氫吡啶類藥物載入后脂肪乳油水界面層卵磷脂分子排列發(fā)生了改變，影響脂肪乳的穩(wěn)定性，且藥物對微觀結(jié)構(gòu)的影響程度與其結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)有關(guān)。

2.3 體外釋放

體外釋放是載藥脂肪乳生產(chǎn)和質(zhì)量控制的重要指標(biāo)和手段，也是制劑處方中輔料種類規(guī)格或用量、生產(chǎn)工藝等變更前后以及仿制制劑產(chǎn)品質(zhì)量的一致性評估的需要，F(xiàn)DA個藥指南草案要求丙泊酚脂肪乳注射液、環(huán)孢素眼用乳劑和二氟潑尼酯眼用乳劑進行體外釋放的對比研究。

載藥脂肪乳具有粒徑分布范圍較寬、藥物相分布復(fù)雜性、乳滴可變形性等特殊性質(zhì)，存在游離藥物分離不準(zhǔn)確、載體結(jié)構(gòu)易被破環(huán)以及體內(nèi)行為復(fù)雜性等問題，這給其體外釋放特征評價帶來了一定的難度。目前，載藥脂肪乳體外釋放特征研究的方法有透析法、反透析法、擴散池法、流通池法等[16，19，20]。載藥脂肪乳體外釋放方法首要應(yīng)考慮對制劑質(zhì)量變化具有合適的區(qū)分能力，可通過采用改變處方、工藝的關(guān)鍵因素設(shè)計制備得到粒徑、包封率等制劑特性不同的一系列制劑，再對其體外釋放行為是否存在差異進行驗證。理想的體外釋放方法還應(yīng)能較好預(yù)測藥物在體內(nèi)的行為，開發(fā)有體內(nèi)預(yù)測力的釋放方法，需要科學(xué)合理地模擬體內(nèi)環(huán)境，可通過在釋放介質(zhì)中加入與親脂性藥物有較強親和性的白蛋白等體內(nèi)蛋白增溶、加入脂解酶或利用體外脂解模型、采用能較好模擬乳劑在體內(nèi)分散狀態(tài)的反透析法和流通池法等，并結(jié)合藥物性質(zhì)、釋放機制和體內(nèi)行為等研究，分析和建立體內(nèi)外相關(guān)性[21，22]。

2.4 物理穩(wěn)定性

脂肪乳是熱力學(xué)不穩(wěn)定體系，加上液態(tài)油相與水相之間存在密度差，易發(fā)生絮凝、分層、合并和破乳等物理不穩(wěn)定現(xiàn)象，同時處方、工藝、包裝材料、貯藏和臨床配伍等也均會影響到脂肪乳物理穩(wěn)定性，因此物理穩(wěn)定性是脂肪乳研究的關(guān)鍵難題，也是質(zhì)量研究和控制的重要關(guān)注點[23]。ChP2015規(guī)定了口服乳劑離心穩(wěn)定性以及穩(wěn)定性期間應(yīng)對分層現(xiàn)象進行考察，要求乳狀型注射液不得有相分離現(xiàn)象，但未明確規(guī)定乳劑的物理穩(wěn)定性快速、準(zhǔn)確或量化的評價方法。

脂肪乳物理穩(wěn)定性評價的常用方法有目測法、粒度法、離心穩(wěn)定性常數(shù)法、計算預(yù)測法和加速法等，但這些傳統(tǒng)方法存在易受人為主觀因素影響、重復(fù)性差以及缺乏相關(guān)性等問題，也不能真實反映并對穩(wěn)定性做出準(zhǔn)確判斷。近年來，多重光散射技術(shù)（multiple light scattering，包括靜態(tài)多重光散射技術(shù)和擴散波譜技術(shù)）、核磁共振技術(shù)、近紅外光譜技術(shù)、超聲頻譜分析技術(shù)（ultrasonic spectroscopy）等逐步應(yīng)用于乳劑穩(wěn)定性的理論研究和評價，這些新技術(shù)能快速、較可靠地測定穩(wěn)定性，并能探究乳狀液的穩(wěn)定或不穩(wěn)定機制；其中，基于靜態(tài)多重光散射技術(shù)的Turbiscan穩(wěn)定分析儀可直接快速分析并實時動態(tài)監(jiān)測乳劑等多相體系的穩(wěn)定性，同時通過對乳滴遷移速度、粒徑變化和分層厚度等進行觀察，能準(zhǔn)確定量比較樣品的穩(wěn)定性，并分析不穩(wěn)定的機制[24-26]。

3.結(jié)語

脂肪乳作為一種藥物遞送載體，不僅能解決難溶性藥物給藥問題，還能降低藥物不良反應(yīng)，提高臨床療效；與脂質(zhì)體等納米制劑相比，具有更好的安全性和更成熟的生產(chǎn)工藝。在過去的十幾年，載藥脂肪乳尤其注射途徑用脂肪乳高速發(fā)展，國內(nèi)載藥脂肪乳質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)也不斷提高，關(guān)鍵輔料甘油三脂和磷脂的質(zhì)量控制等相關(guān)研究也日漸深入[27-30]，但質(zhì)量研究和控制還有待完善，很多脂肪乳的載體特性關(guān)鍵指標(biāo)并沒有體現(xiàn)在產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，對關(guān)鍵質(zhì)量屬性理解和認(rèn)識還不夠。因此，需要更透徹地對脂肪乳結(jié)構(gòu)、藥物相分布等微觀和分子水平的研究及理論進行分析，開展理化性質(zhì)、關(guān)鍵性輔料質(zhì)量特性與體內(nèi)生物學(xué)特征的相關(guān)性研究，促進對關(guān)鍵質(zhì)量屬性的全面和深入的認(rèn)知，建立合理規(guī)范的關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)的限度要求，進而構(gòu)建全面多維度的科學(xué)的質(zhì)量控制體系。