鈴蘭組織培養(yǎng)中褐變的防治研究

焦曉霖，繆天琳，張秀梅*，王長寶*

(1.佳木斯大學(xué) 理學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

鈴蘭(ConvallariamajalisL.)又稱香水草、山谷百合，是百合科的多年生草本植物，通常生于西北、東北和華北地區(qū)的林緣灌叢中或針闊混交林林下[1-2]。鈴蘭可以帶花全草入藥，它的莖和葉中含有的鈴蘭毒甙具有強(qiáng)心利尿的功能。從鈴蘭中還可提取在國際上被列為上等名貴香料的鈴蘭浸膏，它可以用來調(diào)配多種花香型香精，常用在香皂、化妝品等的生產(chǎn)制作之中[3]。因?yàn)殁徧m種子的收集非常困難，且鈴蘭的繁殖系數(shù)很低，難以滿足日益增長的市場需求[4]，所以當(dāng)前廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)的繁育方式主要是通過組織培養(yǎng)獲得組織培養(yǎng)苗，然而在組織培養(yǎng)過程中鈴蘭外植體的褐變普遍發(fā)生，這已成為影響鈴蘭大規(guī)模繁殖的主要因素，因此鈴蘭組織培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵是抑制褐變的產(chǎn)生。本研究基于前人有關(guān)褐變的報(bào)道上通過暗培養(yǎng)處理以及在培養(yǎng)基中添加吸附劑聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和活性炭(AC)、抗氧化劑硫代硫酸鈉(Na2S2O3)和抗壞血酸(VC)等4種抑褐劑的方法，獲得抑制鈴蘭褐變的最佳方法。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 外植體的選取。選擇健壯生長的鈴蘭植株，將其根莖作為外植體材料。

1.1.2 培養(yǎng)基?；九囵B(yǎng)基為MS+ 6-BA 0.3 mg/L + NAA 0.1 mg/L[5]，MS培養(yǎng)基中附加9.0 g /L的瓊脂粉和30.0 g/L的蔗糖，pH為6.0。

1.2 處理方式

將鈴蘭的根莖段先用表面活性劑清洗，除去表面的塵土和雜質(zhì)等，再用水流沖洗30 min，將其置于超凈工作臺(tái)上用75%的乙醇消毒30 s，用無菌水沖洗3～4次，即刻浸入濃度為0.1%的HgCl2溶液中消毒8 min，用無菌水沖洗3～4次，用已滅菌的濾紙將其吸干，最后將鈴蘭根莖切成長約0.3 cm 的長度、并具有1個(gè)節(jié)間的根莖段[6]，將其分別接種于對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基上。培養(yǎng)溫度為25 ℃，光照時(shí)間為12 h/d，光照強(qiáng)度為2000～2500 lx。每種處理方式接種5瓶，每瓶接種4個(gè)外植體，進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，30 d后統(tǒng)計(jì)褐變率。

1.2.1 抗褐變劑對(duì)鈴蘭根莖組培的褐變影響實(shí)驗(yàn)。將外植體分別接種在添加以下濃度抗褐變劑的培養(yǎng)基中，將不含抗褐變劑的一組作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)(CK)，最后計(jì)算褐變率并比較。

表1 不同類型和濃度的抗褐變劑

1.2.2 暗培養(yǎng)對(duì)鈴蘭根莖組培的褐變影響實(shí)驗(yàn)。將外植體接種于基本培養(yǎng)基上，在以下4個(gè)條件下培養(yǎng)：(1) 接種后，在25 ℃的條件下進(jìn)行黑暗處理5 d，然后轉(zhuǎn)移至光培養(yǎng)，光照時(shí)間為12 h/d;(2)接種后,在25℃下進(jìn)行黑暗處理10 d,后轉(zhuǎn)移至光培養(yǎng),光照時(shí)間為12 h/d;(3) 接種后,在25 ℃下進(jìn)行黑暗處理15 d,后轉(zhuǎn)移至光培養(yǎng),光照時(shí)間為12 h/d;(4)接種后,在25 ℃下直接進(jìn)行光培養(yǎng),光照時(shí)間為12 h/d,并以此組作為對(duì)照組(CK)。最后，計(jì)算褐變率以及記錄誘導(dǎo)出的芽的生長情況并進(jìn)行比較。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

用Excel和 SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗褐變劑對(duì)鈴蘭根莖組培褐變的影響

在培養(yǎng)基中加入不同濃度的抗吸附劑和抗氧化劑可以明顯降低鈴蘭外植體的褐變程度，褐變率均低于CK，且PVP的最佳濃度為2.0 g/L，褐變率為33.33%；VC的最佳濃度為2.0 g/L，褐變率為25.33%；Na2S2O3的最佳濃度為0.5 g/L，褐變率為50.00%；AC的最佳濃度為0.5 g/L，褐變率為30.00%。其中，2.0 g/L的VC抗褐變劑效果最好，比CK低41.34%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同種類抑褐劑濃度對(duì)褐變的影響

2.2 暗培養(yǎng)對(duì)鈴蘭根莖組培的褐變影響

在許多的植物組織培養(yǎng)中適當(dāng)?shù)陌堤幚砜赏七t或減輕褐變的發(fā)生，經(jīng)暗處理后外植體的褐變率均低于CK，隨著暗處理的時(shí)間的增加，褐變率逐漸降低，但暗處理10 d的效果最好，褐變率比CK降低41.67%,且誘導(dǎo)出來的芽色澤鮮嫩長勢良好。盡管經(jīng)15 d的暗處理褐變率最低，但因?yàn)榘堤幚頃r(shí)間過長導(dǎo)致誘導(dǎo)長出的芽生長和發(fā)育情況并不理想。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 暗培養(yǎng)對(duì)褐變的影響

3 結(jié)果與討論

近些年來，前人針對(duì)植物組織培養(yǎng)中普遍發(fā)生的褐變問題做了大量的研究[7-9]，認(rèn)為褐變是指接種外植體后，在組培過程中，因切割造成細(xì)胞的損傷，使傷口處分泌出酚類化合物，在有氧的條件下，酚類化合物在多酚氧化酶(PPO)的催化作用下氧化為醌，醌再通過非酶促反應(yīng)產(chǎn)生有色物質(zhì)使組織發(fā)生褐變，呈棕褐色或深褐色，并逐步擴(kuò)散到培養(yǎng)基中，抑制細(xì)胞內(nèi)其它酶的活性，從而影響細(xì)胞的正常代謝，毒害整個(gè)組織，甚至導(dǎo)致愈傷組織的凋亡。外植體的褐變程度與培養(yǎng)條件、吸附劑的添加物等因素具有很大的相關(guān)性。適宜的培養(yǎng)條件、添加適合的吸附劑等因素可以有效地削減褐變對(duì)植物組織培養(yǎng)的影響。

抗褐變劑抑制外植體的褐變主要是通過降低底物(如酚類物質(zhì))、相關(guān)酶活性以及改變相關(guān)基因的表達(dá)方式來實(shí)現(xiàn)。不同的抗褐變劑的對(duì)外植體的抗褐變效果是不同的，本實(shí)驗(yàn)對(duì)抗褐變劑的研究表明，PVP、VC、AC和Na2S2O3這4種抗褐變劑均具有減少褐變的作用，這是因?yàn)槲絼㏄VP和AC具有較強(qiáng)的吸附能力，可以吸附外植體傷口處分泌的酚類物質(zhì)及其被氧化而生成的醌，從而防止外植體褐變的產(chǎn)生；抗氧化劑VC可改變外植體周圍的氧化還原電位，將酚氧化酶的Cu2+還原成Cu+，從而抑制酚類的氧化，減少褐變；抗氧化劑Na2S2O3則可影響酚類化合物與酶的結(jié)合，致使褐變減少[10-12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與陳瑤瑤等[13]、段文武等[14]的研究報(bào)告中這幾種抗褐變劑對(duì)外植體有抑褐作用的結(jié)果一致，在培養(yǎng)基中添加防止酚類氧化的抗氧化劑和吸收醌類物質(zhì)的吸附劑可減少褐變的產(chǎn)生。

對(duì)外植體進(jìn)行暗培養(yǎng)的研究結(jié)果表明，適當(dāng)?shù)陌蹬囵B(yǎng)可降低鈴蘭外植體的褐變率。如果時(shí)間過短，抑制褐變的效果不明顯，原因可能是前期采用暗培養(yǎng)可以抑制酚類化合物的合成，降低多酚氧化酶的活性，減少酚類的氧化，從而減輕褐變，然而如果暗培養(yǎng)處理的時(shí)間過長，誘導(dǎo)產(chǎn)生的根莖芽的存活率會(huì)降低。在王倩穎等[15]的研究中顯示，培養(yǎng)初期的黑暗環(huán)境培養(yǎng)可以降低外植體的褐變程度，隨著暗培養(yǎng)時(shí)間的延長，其葉片和莖段的褐變程度逐漸增加，但根部褐變程度卻逐漸降低，這是因?yàn)橹参锏母繉?duì)光不敏感，因此隨著暗培養(yǎng)的時(shí)間的增長，根莖段的褐變率降低，這與本實(shí)驗(yàn)中采用鈴蘭根莖為外植體的結(jié)果一致。但夏小環(huán)等[16]的試驗(yàn)結(jié)果顯示，在暗培養(yǎng)的條件下，外植體會(huì)發(fā)生嚴(yán)重褐變，這可能與實(shí)驗(yàn)采用的外植體的材料以及材料的部位有關(guān)。

綜上所述，在單因素影響下，對(duì)外植體進(jìn)行適當(dāng)暗培養(yǎng)處理，在培養(yǎng)基中添加抗褐變劑均可降低褐變率，且暗培養(yǎng)10 d的效果最佳，抗褐變劑對(duì)外植體褐變的影響為VC(2.0 g/L)>AC(0.5 g/L )>PVP(2.0 g/L)> Na2S2O3(0.5 g/L)。