經(jīng)導管栓塞聯(lián)合射頻消融對兔VX2肝腫瘤的干預效果

琚書光，段旭華，韓新巍，任建莊，李 浩，李鳳堯，王滿周

(鄭州大學第一附屬醫(yī)院放射介入科，河南 鄭州 450052)

經(jīng)導管治療包括經(jīng)導管動脈栓塞術(transcatheter arterial embolization， TAE)和TACE，已廣泛用于治療無法切除的肝癌[1-2]。射頻消融(radiofrequency ablation， RFA)可以根治早期肝癌[3]。TACE或TAE聯(lián)合RFA能增加消融范圍，提高RFA效果[4-5]。本研究對比分析TACE或TAE聯(lián)合RFA對兔VX2肝腫瘤的干預效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及模型制備 日本大耳白兔63只，由河南省實驗動物中心提供，雌雄不限，體質(zhì)量3.0～3.5 kg，許可證編號：SYXK(豫)2016-0002。VX2腫瘤株移植制備：采用Virmani等[6]的方法，將VX2腫瘤塊(由華中科技大學同濟醫(yī)學院動物實驗中心惠贈)移植入兔肝左內(nèi)側(cè)葉，移植15天后MRI觀察VX2腫瘤是否形成及其大小[7]，測量各組瘤體最大層面的最大長徑(a)和短徑(b)。

1.2 動物分組及處理 將60只成功建立VX2肝腫瘤模型(圖1A)的實驗兔隨機分為4組，每組15只。對TACE+RFA組以0.4 mg阿霉素+0.4 ml碘油進行TACE治療15 min后行RFA；TAE+RFA組采用150～250 μm聚乙烯醇(polyvinyl alcohol, PVA)顆粒行TAE治療15 min后行RFA；RFA組僅給予RFA；TACE組僅給予TACE(圖1B、1C)。TACE、TAE均在Siemens Artis Q Zeego DSA機引導下進行，RFA操作過程參照文獻[7]。

1.3 相關指標觀察

1.3.1 肝功能 分別在術前1天及術后3、7天自兔耳緣靜脈采集血液標本，離心后取血清，采用標準酶法測定血清天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase， ALT)水平。

1.3.2 腫瘤生長率、腫瘤壞死率及Suzuki評分 于術后1、3、7天各組分別處死5只兔。TACE+RFA組、TAE+RFA組、RFA組均沿射頻消融針主針道切開消融肝組織，每隔3～5 mm分片，測量瘤體最大長徑(a)和短徑(b)；TACE組沿長軸切開腫瘤，于最大切面測量最大長徑(a)和短徑(b)。分別測量各組瘤體切面壞死區(qū)長徑(c)和短徑(d)。

參照文獻[8]方法計算術后7天腫瘤生長率、腫瘤壞死率：腫瘤生長率=腫瘤體積術后/腫瘤體積術前×100%，腫瘤體積=1/2ab2，腫瘤壞死率=cd/ab×100%。將腫瘤組織置于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋后4 μm厚切片，常規(guī)HE染色后行Suzuki評分[9]，評價壞死區(qū)或凝固區(qū)周圍肝組織損傷程度。

1.3.3 熱休克蛋白70(heat shock protein 70， HSP70)表達 參照文獻[10]方法對壞死區(qū)或凝固區(qū)肝組織行HSP70免疫組織化學染色。由2名高年資病理科醫(yī)師在200倍鏡下以盲法進行評價，TACE組在肝臟壞死區(qū)周圍組織取圖，RFA組、TAE+RFA組和TACE+RFA組在肝臟凝固壞死區(qū)周圍組織取圖。Image-Pro Plus Software(version 6.0)軟件分析圖像，自動計算HSP70累計光密度(integrated optical density， IOD)。

1.3.4 凋亡指數(shù) 采用TUNEL法檢測壞死區(qū)或凝固區(qū)周圍肝細胞凋亡指數(shù)，凋亡指數(shù)為每張切片中每100個細胞中陽性細胞數(shù)。在200倍鏡下計算每個視野陽性細胞數(shù)平均值，每個樣本評估5個視野，取平均數(shù)作為結(jié)果。

1.3.5 增殖指數(shù) 采用免疫組織化學染色檢測壞死區(qū)或凝固區(qū)周圍肝組織Ki-67表達，計數(shù)每張切片中6個200倍視野內(nèi)Ki-67陽性細胞數(shù)，計算增殖指數(shù)。增殖指數(shù)為每個視野中Ki-67陽性細胞數(shù)占肝細胞總數(shù)的百分比。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 21.0統(tǒng)計分析軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，采用Kruskal-WallisH檢驗或Mann-WhitneyU檢驗比較各組間、同組不同時間點間各指標差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

成功建立60只兔VX2肝腫瘤模型，腫瘤最大徑11.52～16.91 mm，平均(12.78±3.53)mm。

2.1 血清ALT、AST 4組兔術前1天血清ALT和AST水平差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。術后3、7天TACE+RFA組ALT、AST水平均高于其他3組，術后3天TACE+RFA組、TAE+RFA組、TACE組均高于術前1天及術后7天，術后3、7天TACE組均高于TAE+RFA組、RFA組，術后3天TAE+RFA組均高于RFA組(P均<0.05)。見表1。

2.2 腫瘤生長率、腫瘤壞死率及Suzuki評分 術后7天TACE+RFA組Suzuki評分高于其他3組，TACE+RFA組、TAE+RFA組腫瘤生長率均低于RFA組和TACE組(P均<0.05)，腫瘤壞死率均高于RFA組和TACE組(P均<0.05)。見表2。

2.3 HSP70表達 術后1、3、7天4組壞死區(qū)或凝固區(qū)周圍肝組織HSP70表達均逐漸升高(P均<0.01)。術后1、3、7天TACE+RFA組HSP70表達均高于其他3組(P均<0.01)；術后1、3天TAE+RFA組HSP70表達均高于TACE組和RFA組(P均<0.05)。見表3。

2.4 凋亡指數(shù) 術后1、3、7天4組壞死區(qū)或凝固區(qū)周圍肝細胞凋亡指數(shù)均逐漸降低(P均<0.01)。術后1、3、7天TACE+RFA組凋亡指數(shù)均高于其他3組(P均<0.01)，術后1、3天TACE組均高于TAE+RFA組、RFA組(P均<0.05)。見表4、圖2。

2.5 增殖指數(shù) 術后3天4組肝細胞增殖指數(shù)均高于術后1、7天(P均<0.05)。術后1、3、7天TAE+RFA組增殖指數(shù)均高于其他3組(P均<0.05)，術后1、3天RFA組均高于TACE+RFA組和TACE組(P均<0.05)。見表5、圖3。

圖1 TACE組影像學表現(xiàn) A.植入腫瘤15天后，MR T1WI示兔肝左葉見直徑約16 mm低信號區(qū)； B.TACE術中肝動脈造影示肝左葉富血供占位性病變； C.以碘油乳化液栓塞病變

表1 各組兔不同時間點血清ALT、AST水平比較(U/L，±s)

表1 各組兔不同時間點血清ALT、AST水平比較(U/L，±s)

組別ALT術前1天術后3天術后7天F值P值TACE+RFA組35.31±8.60178.67±31.43123.09±10.6366.853<0.001TAE+RFA組33.19±9.3984.21±28.1057.30±22.217.1220.009TACE組33.08±9.41136.11±25.4286.71±23.1431.414<0.001RFA組36.20±10.6149.30±12.5456.70±18.812.5990.115F值0.13225.18113.205——P值0.940<0.001<0.001——組別AST術前1天術后3天術后7天F值P值TACE+RFA組48.11±12.21263.78±14.41160.30±15.22297.272<0.001TAE+RFA組46.81±13.89125.11±27.5381.21±25.4914.2220.001TACE組46.78±13.90159.29±32.08116.21±19.3030.277<0.001RFA組49.29±10.5060.21±18.8166.44±22.211.1750.342F值0.04561.63619.984——P值0.987<0.001<0.001——

表2 各組兔術后7天腫瘤生長率、壞死率及Suzuki評分比較(±s)

表2 各組兔術后7天腫瘤生長率、壞死率及Suzuki評分比較(±s)

組別腫瘤生長率(%)腫瘤壞死率(%)Suzuki評分TACE+RFA組116.48±36.4191.49±14.284.26±2.29TAE+RFA組122.89±52.3487.50±20.811.89±1.24TACE組334.38±53.1058.47±13.722.16±1.31RFA組242.11±48.3266.45±14.901.13±1.01F值21.3813.9953.478P值<0.0010.0470.041

表3 各組兔術后不同時間點壞死區(qū)或凝固區(qū)周圍肝組織HSP70表達的IOD值比較(±s)

表3 各組兔術后不同時間點壞死區(qū)或凝固區(qū)周圍肝組織HSP70表達的IOD值比較(±s)

組別術后1天術后3天術后7天F值P值TACE+RFA組2 618.12±153.4915 981.20±3 108.2229 750.20±4 121.53103.510<0.001TAE+RFA組2 142.32±330.6112 210.20±3 462.9021 158.29±4 412.2543.004<0.001TACE組1 247.54±191.488 158.15±1 996.7114 526.20±4 468.1527.580<0.001RFA組976.32±341.167 283.90±2 875.2012 304.50±5 673.3211.9130.001F值41.0039.46413.868——P值<0.0010.001<0.001——

表4 各組兔不同時間點壞死區(qū)或凝固區(qū)周圍肝細胞凋亡指數(shù)比較(個，±s)

表4 各組兔不同時間點壞死區(qū)或凝固區(qū)周圍肝細胞凋亡指數(shù)比較(個，±s)

組別術后1天術后3天術后7天F值P值TACE+RFA組25.67±2.1116.45±3.4211.29±3.8825.512<0.001TAE+RFA組10.32±3.899.80±2.403.32±1.909.3120.004TACE組17.20±1.3112.10±1.565.81±2.2154.049<0.001RFA組7.53±3.196.92±2.511.51±0.589.7960.003F值41.74312.57515.145——P值<0.001<0.001<0.001——

3 討論

Li等[11]發(fā)現(xiàn)TACE治療過程中適當減少化學治療藥物劑量和次數(shù)對近期療效無影響，且可保護肝功能，有益于長期預后。尹建等[12]認為TACE+RFA治療肝癌近中期療效優(yōu)于單純RFA治療，遠期療效無明顯差異。Bonomo等[13]采用TAE+RFA治療不能切除的直徑16～59 mm肝癌，獲得與TACE+RFA相近療效。

表5 各組兔不同時間點壞死區(qū)或凝固區(qū)周圍肝細胞增殖指數(shù)比較(%，±s)

表5 各組兔不同時間點壞死區(qū)或凝固區(qū)周圍肝細胞增殖指數(shù)比較(%，±s)

組別術后1天術后3天術后7天F值P值TACE+RFA組6.67±2.1011.53±3.408.33±3.523.8730.044TAE+RFA組15.30±3.9124.81±2.4212.31±1.8925.856<0.001TACE組5.21±1.328.11±1.586.78±2.214.1580.037RFA組9.53±3.1914.89±2.518.50±2.617.5810.007F值12.58339.7473.998——P值<0.001<0.0010.027——

圖2 術后1天肝臟壞死區(qū)或凝固區(qū)周圍見典型TUNEL染色(箭示陽性細胞，×200) A～D.分別為TACE組、RFA組、TACE+RFA組及TAE+RFA組

圖3 術后3天肝臟壞死或凝固區(qū)周圍見Ki-67陽性細胞(箭，×200) A～D.分別為TACE組、RFA組、TACE+RFA組及TAE+RFA組

經(jīng)導管治療聯(lián)合RFA治療不可切除肝癌臨床療效確切，但肝功能損傷情況罕見報道。本研究對肝腫瘤兔模型分別給予TACE+RFA、TAE+RFA、TACE、RFA治療，通過腫瘤生長率和壞死率觀察腫瘤控制情況，以ALT、AST分析肝功能變化，檢測消融壞死區(qū)或凝固區(qū)周圍肝細胞HSP70表達和細胞增殖觀察肝細胞恢復能力，以肝細胞凋亡判斷肝組織損傷程度，發(fā)現(xiàn)TACE+RFA較TAE+RFA、RFA或TACE更能有效地破壞腫瘤，而控制腫瘤效果與TAE+RFA無顯著差異，與前期研究[7]結(jié)果相符；但TACE+RFA治療所致肝功能損傷最為嚴重，而TAE+RFA治療肝功能損傷相對較輕，可能與后者不存在化學藥物所致細胞毒性作用有關[7,14]。

高溫、化學藥物和缺氧等均可誘導細胞高表達HSP70[15]。RFA動物肝臟后，HSP70是肝組織消融區(qū)周圍肝細胞內(nèi)最主要的熱休克蛋白[16]，具有保護細胞結(jié)構(gòu)、促進細胞存活、促進受損細胞恢復、抑制消融區(qū)外周細胞凋亡和壞死等作用[15]。本研究中，術后1、3、7天TACE+RFA組肝組織HSP70表達和肝細胞凋亡均最多，提示TACE聯(lián)合RFA治療中消融區(qū)周圍肝細胞受到的熱損傷、缺氧及細胞毒性損傷最大，更多肝細胞需要從可逆細胞損傷狀態(tài)中恢復；術后7天TAE+RFA組、TACE組和RFA組HSP70表達差異無統(tǒng)計學意義，提示上述3種治療方式下肝細胞更易修復。4組實驗兔術后3天壞死區(qū)或凝固區(qū)周圍肝細胞增殖指數(shù)均高于術后1天，術后7天始逐漸回落，提示術后7天內(nèi)肝臟功能趨于恢復正常。TAE+RFA組術后1、3、7天增殖指數(shù)均高于TACE+RFA組及TACE組，提示其肝功能損傷更小，可能是治療肝癌更有益的方法。但本研究僅觀察至術后7天，尚待進一步研究。