不同土層中抗除草劑轉(zhuǎn)基因油菜與野生芥菜回交3代后代活力種子百分比的比較

王 鈺， 王曉蕾， 張慶玲， 王 建， 強(qiáng) 勝， 宋小玲

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 雜草研究室， 江蘇 南京 210095)

油菜(BrassicanapusLinn.)是重要的油料作物，可利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)油菜基因組進(jìn)行改造，目前已經(jīng)獲得許多具有新性狀的轉(zhuǎn)基因油菜，2017年全球轉(zhuǎn)基因油菜的種植面積達(dá)1.02×107hm2，占全球油菜種植總面積的30%[1]。油菜繁殖系數(shù)高，角果易開(kāi)裂，種子小且具有次生休眠等特性，因此，灑落的種子能在土壤中建立種子庫(kù)[2]。研究表明：轉(zhuǎn)基因油菜的種子可長(zhǎng)期保存在土壤種子庫(kù)中，并在適宜條件下萌發(fā)形成自生苗[3]。

抗除草劑轉(zhuǎn)基因油菜是目前商業(yè)化種植最廣的轉(zhuǎn)基因油菜，具有重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益，同時(shí)也帶來(lái)一定的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。目前，在轉(zhuǎn)基因油菜的商業(yè)化種植國(guó)家和進(jìn)口國(guó)家均發(fā)現(xiàn)了抗除草劑轉(zhuǎn)基因油菜的自生苗[3-11]。除了具有形成自生苗的風(fēng)險(xiǎn)外，抗除草劑轉(zhuǎn)基因油菜還可能通過(guò)花粉向近緣雜草發(fā)生基因漂移，導(dǎo)致抗性雜草產(chǎn)生，給農(nóng)田雜草防除帶來(lái)麻煩。研究者們已經(jīng)對(duì)轉(zhuǎn)基因油菜向近緣種蕓苔(B.campestrisLinn.)[12]、蕪菁(B.rapaLinn.)[13-15]、芥菜〔B.juncea(Linn.) Czern.〕[16]和野蘿卜(RaphanusraphanistrumLinn.)[17-18]發(fā)生基因漂移的可能性進(jìn)行了相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因油菜能否與近緣種成功發(fā)生基因漂移，與其攜帶抗性基因的后代種子活力在土壤中的保持時(shí)間密切相關(guān)[19-20]，若攜帶抗性基因的后代種子活力能在土壤中保持較長(zhǎng)時(shí)間，這些種子就有可能在適宜條件下形成自生苗，成為抗性基因再次逃逸的花粉源，并影響農(nóng)作物的產(chǎn)量。

研究表明：油菜與Hirschfeldiaincana(Linn.) Lagr.-Fossat和野蘿卜的雜交種子能夠在土壤中存活3 a[21]；油菜與具雜草性的蕓苔雜交可產(chǎn)生大量的雜交種子[22]；以油菜為母本、蕓苔為父本獲得的雜交種為母本，與蕓苔進(jìn)行回交，得到的回交種子中休眠種子的百分率雖然較蕓苔下降，但在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中仍可能持續(xù)存在[23]。野生芥菜(AABB，2n=36)是芥菜的自逸產(chǎn)物，目前已經(jīng)成為中國(guó)西北地區(qū)和長(zhǎng)江流域荒地及農(nóng)田的重要雜草[24]。野生芥菜與轉(zhuǎn)基因油菜(AACC，2n=38)均為異源四倍體，親緣關(guān)系很近。作者所在項(xiàng)目組通過(guò)人工雜交和回交方式獲得了抗草甘膦和抗草丁膦的回交3代子1代、子2代、子3代和子4代，并對(duì)這些回交后代的適合度進(jìn)行了研究[25-28]，結(jié)果表明：在田間自然條件下，這些回交后代的單株飽滿種子數(shù)至少1萬(wàn)粒，且回交后代的適合度隨自交代數(shù)增加而不斷升高，一旦這些種子進(jìn)入土壤種子庫(kù)，就有可能成為自生苗的來(lái)源。

鑒于此，以野生芥菜以及抗草甘膦和抗草丁膦轉(zhuǎn)基因油菜與野生芥菜的正向(以野生芥菜為母本)和反向(以野生芥菜為父本)回交3代子2代、子3代、子4代和子5代種子為研究對(duì)象，對(duì)在不同土層中埋藏前及埋藏2、4、6、8和10個(gè)月后野生芥菜和各回交后代的活力種子百分比進(jìn)行了比較，以期明確不同土層中各回交后代的活力種子百分比差異以及相同土層中各回交后代的活力種子百分比與野生芥菜活力種子百分比的差異，為深入研究抗除草劑轉(zhuǎn)基因油菜與野芥菜回交后代在田間的生存定植能力提供參考依據(jù)，并對(duì)評(píng)價(jià)抗除草劑轉(zhuǎn)基因油菜基因漂移的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用野生芥菜采自江蘇省南京市江浦，抗草甘膦轉(zhuǎn)基因油菜(DS-Roughrider， Roundup Ready， event RT73)和抗草丁膦轉(zhuǎn)基因油菜(Swallow， Liberty Link， event HCN92)均來(lái)自加拿大。以野生芥菜為母本，分別以抗草甘膦和抗草丁膦轉(zhuǎn)基因油菜為父本采用人工雜交方式獲得攜帶抗性基因的F1代；隨后，通過(guò)正向(以野生芥菜為母本、F1代為父本)和反向(以F1代為母本、野生芥菜為父本)回交分別獲得正向回交1代(BC1mF1)和反向回交1代(BC1pF1)；再以BC1mF1和BC1pF1為親本分別與野生芥菜進(jìn)行正向和反向回交，獲得正向和反向回交2代，即BC2mF1和BC2pF1；然后，采用同樣方法獲得正向和反向回交3代，即BC3mF1和BC3pF1。用目標(biāo)除草劑對(duì)正向和反向回交3代植株進(jìn)行抗性篩選，存活植株經(jīng)套袋自交獲得正向回交3代子1代(BC3mF2)和反向回交3代子1代(BC3pF2)；以同樣方法獲得正向回交3代子2代(BC3mF3)和反向回交3代子2代(BC3pF3)、正向回交3代子3代(BC3mF4)和反向回交3代子3代(BC3pF4)、正向回交3代子4代(BC3mF5)和反向回交3代子4代(BC3pF5)以及正向回交3代子5代(BC3mF6)和反向回交3代子子5代(BC3pF6)。抗草甘膦轉(zhuǎn)基因油菜后代用R表示，抗草丁膦轉(zhuǎn)基因油菜后代用L表示。

本研究實(shí)驗(yàn)地為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)牌樓實(shí)驗(yàn)基地的露天試驗(yàn)田，栽培土壤為粘土，有機(jī)質(zhì)含量38.51 g·kg-1，全氮含量2.20 g·kg-1，全鉀含量1.76 g·kg-1，全磷含量18.94 g·kg-1，速效磷含量47.81 mg·kg-1，堿解氮含量163.74 mg·kg-1。

1.2 方法

1.2.1 處理方法 參考王彥榮等[29]的方法，分別收集野生芥菜、抗草甘膦轉(zhuǎn)基因油菜與野生芥菜的正向回交3代子2代(BC3mF3R)和反向回交3代子2代(BC3pF3R)以及抗草丁膦轉(zhuǎn)基因油菜與野生芥菜的正向回交3代子2代(BC3mF3L)和反向回交3代子2代(BC3pF3L)各25粒種子，分別裝入0.2 mm孔徑尼龍網(wǎng)袋中，于2013年6月至2014年4月隨機(jī)埋藏在土層厚度3和15 cm的小區(qū)土壤內(nèi)，袋間距約20 cm，小區(qū)間距2.5 m，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

采用相同方法于2014年6月至2015年4月對(duì)野生芥菜和回交3代子3代種子進(jìn)行不同土層埋藏處理，于2015年7月至2016年5月對(duì)野生芥菜和回交3代子4代種子進(jìn)行不同土層埋藏處理，于2016年7月至2017年5月對(duì)野生芥菜和回交3代子5代種子進(jìn)行不同土層埋藏處理。

1.2.2 活力種子百分比檢測(cè) 參照Huang等[30]的方法統(tǒng)計(jì)有活力的種子數(shù)。每種材料分別在埋藏前及埋藏2、4、6、8和10個(gè)月各取1袋種子，每個(gè)時(shí)間重復(fù)取樣4次，統(tǒng)計(jì)每個(gè)網(wǎng)袋中萌發(fā)的種子數(shù)(a)；將未萌發(fā)的完整種子置于裝有潤(rùn)濕濾紙的培養(yǎng)皿中，在溫度25 ℃、空氣相對(duì)濕度80%、光照度5 500 lx、光照時(shí)間16 h·d-1的人工氣候箱中進(jìn)行種子萌發(fā)培養(yǎng)，每天添加蒸餾水保持濾紙濕度，培養(yǎng)2周后統(tǒng)計(jì)萌發(fā)的種子數(shù)(b)，以胚根突破種皮作為判定種子萌發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)；收集仍未萌發(fā)的完整種子，加入質(zhì)量濃度0.1 g·L-1赤霉素(GA3)溶液打破種子休眠，在上述培養(yǎng)條件下培養(yǎng)2周后統(tǒng)計(jì)萌發(fā)的種子數(shù)(c)；對(duì)仍未萌發(fā)的種子進(jìn)行TTC染色，種子被染成紅色表示有活力，統(tǒng)計(jì)有活力的種子數(shù)(d)。根據(jù)公式“活力種子百分比=(有活力的種子總數(shù)/供試種子總數(shù))×100%”計(jì)算活力種子百分比，式中，有活力的種子總數(shù)為a、b、c和d的總和。

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，采用Duncan’s新復(fù)極差法對(duì)活力種子百分比進(jìn)行多重比較，并采用配對(duì)樣本T檢驗(yàn)法分析埋藏相同時(shí)間不同土層厚度間同一回交后代活力種子百分比的差異。

2 結(jié)果和分析

2.1 回交3代子2代活力種子百分比的比較

不同土層中抗除草劑轉(zhuǎn)基因油菜與野生芥菜回交3代子2代活力種子百分比的比較結(jié)果見(jiàn)表1。

2.1.1 不同時(shí)間變化趨勢(shì)比較 總體來(lái)看，3和15 cm土層中野生芥菜和4種回交3代子2代的活力種子百分比變化趨勢(shì)相似，均隨埋藏時(shí)間延長(zhǎng)而下降。

2.1.2 不同樣品間比較 由表1可見(jiàn)：埋藏前，野生芥菜的活力種子百分比為99.0%，4種回交3代子2代的活力種子百分比為95.0%～99.0%，僅BC3mF3R(抗草甘膦轉(zhuǎn)基因油菜與野生芥菜正向回交3代子2代)的活力種子百分比顯著低于野生芥菜，其余3種回交3代子2代的活力種子百分比與野生芥菜均無(wú)明顯差異。在3 cm土層中埋藏2個(gè)月后，野生芥菜的活力種子百分比為90.0%，BC3mF3R和BC3pF3R(抗草甘膦轉(zhuǎn)基因油菜與野生芥菜反向回交3代子2代)的活力種子百分比與野生芥菜無(wú)顯著差異，但BC3mF3L(抗草丁膦轉(zhuǎn)基因油菜與野生芥菜正向回交3代子2代)和BC3pF3L(抗草丁膦轉(zhuǎn)基因油菜與野生芥菜反向回交3代子2代)的活力種子百分比顯著低于野生芥菜；總體來(lái)看，埋藏4、6、8和10個(gè)月后，BC3mF3R和BC3mF3L的活力種子百分比與野生芥菜無(wú)顯著差異，BC3pF3R和BC3pF3L的活力種子百分比分別高于或顯著低于野生芥菜。在15 cm土層中埋藏2、4、6、8和10個(gè)月后，BC3mF3R、BC3pF3R和BC3mF3L的活力種子百分比基本上與野生芥菜無(wú)顯著差異，但BC3pF3L的活力種子百分比顯著低于野生芥菜。

2.1.3 不同土層間比較 由表1還可見(jiàn)：在3 cm土層中埋藏4、6、8和10個(gè)月后野生芥菜、BC3mF3R和BC3pF3R的活力種子百分比顯著低于在15 cm土層中埋藏相同時(shí)間的活力種子百分比，而在3 cm土層中埋藏2、4、6、8和10個(gè)月后BC3mF3L和BC3pF3L的活力種子百分比顯著低于在15 cm土層中埋藏相同時(shí)間的活力種子百分比。

樣品1) Sample1)不同時(shí)間3 cm土層中的活力種子百分比/%2) Viable seed percentage in 3 cm soil layer at different times2)埋藏前Before burying2個(gè)月Two months4個(gè)月Four months6個(gè)月Six months8個(gè)月Eight months10個(gè)月Ten monthsW99.0±0.8a90.0±5.2a72.0±17.0bc75.0±11.9b75.0±14.4ab72.0±8.4abBC3mF3R95.0±2.2b90.0±2.3a73.0±2.0bc72.0±3.3b62.0±12.4bc66.0±3.7bBC3pF3R99.0±0.8a89.0±11.0a87.0±7.6a85.0±3.8a85.0±3.8a74.0±3.6aBC3mF3L98.0±0.8a80.0±3.3b78.0±2.3ab75.0±3.8b73.0±2.0ab76.0±3.6aBC3pF3L99.0±0.8a57.0±3.8c60.0±3.3c59.0±2.0c58.0±2.3c51.0±2.0c樣品1)Sample1)不同時(shí)間15 cm土層中的活力種子百分比/%2) Viable seed percentage in 15 cm soil layer at different times2)埋藏前Before burying2個(gè)月Two months4個(gè)月Four months6個(gè)月Six months8個(gè)月Eight months10個(gè)月Ten monthsW99.0±0.8a90.0±15.1a90.0±10.6a?95.0±7.6a?93.0±1.8a?86.0±1.6a?BC3mF3R95.0±2.2b91.0±3.8a90.0±2.3a?83.0±2.0b?80.0±7.5b?80.0±6.7a?BC3pF3R99.0±0.8a100.0±0.0a99.0±2.0a?92.0±3.3a?92.0±3.3a?85.0±4.8a?BC3mF3L98.0±0.8a94.0±5.2a?92.0±5.7a?95.0±3.8a?93.0±6.0a?89.0±4.2a?BC3pF3L99.0±0.8a77.0±2.0b?70.0±3.3b?70.0±4.0c?72.0±8.0b?70.0±11.4b?

1)W： 野生芥菜 WildBrassicajuncea(Linn.) Czern.； BC3mF3R： 抗草甘膦轉(zhuǎn)基因油菜與野生芥菜正向回交3代子2代 The second progeny of the third forward backcross generation between glyphosate-resistant transgenicB.napusLinn. and wildB.juncea； BC3pF3R： 抗草甘膦轉(zhuǎn)基因油菜與野生芥菜反向回交3代子2代 The second progeny of the third reverse backcross generation between glyphosate-resistant transgenicB.napusand wildB.juncea； BC3mF3L： 抗草丁膦轉(zhuǎn)基因油菜與野生芥菜正向回交3代子2代 The second progeny of the third forward backcross generation between glufosinate-resistant transgenicB.napusand wildB.juncea； BC3pF3L： 抗草丁膦轉(zhuǎn)基因油菜與野生芥菜反向回交3代子2代 The second progeny of the third reverse backcross generation between glufosinate-resistant transgenicB.napusand wildB.juncea.

2)同列中不同的小寫(xiě)字母表示相同時(shí)間同一土層中各樣品間活力種子百分比差異顯著(P<0.05) Different lowercases in the same column indicate the significant (P<0.05) difference in viable seed percentage among different samples in the same soil layer at the same time； *： 相同時(shí)間同一樣品的活力種子百分比在3和15 cm土層間差異顯著(P<0.05) The significant (P<0.05) difference in viable seed percentage of the same sample in 3 and 15 cm soil layers at the same time.

2.2 回交3代子3代活力種子百分比的比較

不同土層中抗除草劑轉(zhuǎn)基因油菜與野生芥菜回交3代子3代活力種子百分比的比較結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.1 不同時(shí)間變化趨勢(shì)比較 總體來(lái)看，3和15 cm土層中野生芥菜和4種回交3代子3代的活力種子百分比變化趨勢(shì)相似，均隨埋藏時(shí)間延長(zhǎng)而下降。

2.2.2 不同樣品間比較 由表2可見(jiàn)：埋藏前，野生芥菜及4種回交3代子3代的活力種子百分比均為100.0%。在3 cm土層中埋藏2和4個(gè)月后，野生芥菜的活力種子百分比分別為98.0%和90.0%，BC3mF4R(抗草甘膦轉(zhuǎn)基因油菜與野生芥菜正向回交3代子3代)、BC3pF4R(抗草甘膦轉(zhuǎn)基因油菜與野生芥菜反向回交3代子3代)和BC3mF4L(抗草丁膦轉(zhuǎn)基因油菜與野生芥菜正向回交3代子3代)的活力種子百分比與野生芥菜無(wú)顯著差異，BC3pF4L(抗草丁膦轉(zhuǎn)基因油菜與野生芥菜反向回交3代子3代)的活力種子百分比顯著低于野生芥菜；埋藏6、8和10個(gè)月后，4種回交3代子3代的活力種子百分比基本上顯著低于野生芥菜。在15 cm土層中埋藏2、4、6和8個(gè)月后，BC3mF4R、BC3pF4R和BC3mF4L的活力種子百分比與野生芥菜無(wú)顯著差異，但BC3pF4L的活力種子百分比顯著低于野生芥菜；埋藏10個(gè)月后4種回交3代子3代的活力種子百分比與野生芥菜無(wú)顯著差異。

2.2.3 不同土層間比較 由表2還可見(jiàn)：在3 cm土層中埋藏2和4個(gè)月后野生芥菜和4種回交3代子3代的活力種子百分比略低于在15 cm土層中埋藏相同時(shí)間的活力種子百分比，而在3 cm土層中埋藏6、8和10個(gè)月后4種回交3代子3代的活力種子百分比顯著低于在15 cm土層中埋藏相同時(shí)間的活力種子百分比。

樣品1)Sample1)不同時(shí)間3 cm土層中的活力種子百分比/%2) Viable seed percentage in 3 cm soil layer at different times2)埋藏前Before burying2個(gè)月Two months4個(gè)月Four months6個(gè)月Six months8個(gè)月Eight months10個(gè)月Ten monthsW100.0±0.0a98.0±2.3a90.0±9.5a96.0±3.3a86.0±9.5a83.0±9.5aBC3mF4R100.0±0.0a96.0±3.3a94.0±2.3a88.0±3.3b69.0±6.8b66.0±6.8bBC3pF4R100.0±0.0a98.0±2.3a92.0±4.0a90.0±2.3b75.0±3.8ab67.5±4.9bBC3mF4L100.0±0.0a92.0±3.3a92.0±5.7a86.0±4.0b72.0±3.3b69.0±2.0bBC3pF4L100.0±0.0a76.0±14.2b72.0±10.6b48.0±5.7c33.0±11.0c33.0±7.4c樣品1)Sample1)不同時(shí)間15 cm土層中的活力種子百分比/%2) Viable seed percentage in 15 cm soil layer at different times2)埋藏前Before burying2個(gè)月Two months4個(gè)月Four months6個(gè)月Six months8個(gè)月Eight months10個(gè)月Ten monthsW100.0±0.0a100.0±0.0a99.0±2.0a99.0±2.0a89.0±3.8ab86.0±1.6abBC3mF4R100.0±0.0a98.0±4.0a96.0±5.7a94.0±2.3a?87.0±6.8ab?87.0±5.0a?BC3pF4R100.0±0.0a98.0±4.0a97.0±2.0a99.0±2.0a?85.0±3.8bc?85.0±3.6ab?BC3mF4L100.0±0.0a97.0±3.8a95.0±5.0a98.0±2.3a?93.0±2.2a?90.0±2.2a?BC3pF4L100.0±0.0a78.0±7.7b75.0±8.9b76.0±10.6b?79.0±5.0c?81.0±2.5b?

1)W： 野生芥菜 WildBrassicajuncea(Linn.) Czern.； BC3mF4R： 抗草甘膦轉(zhuǎn)基因油菜與野生芥菜正向回交3代子3代 The third progeny of the third forward backcross generation between glyphosate-resistant transgenicB.napusLinn. and wildB.juncea； BC3pF4R： 抗草甘膦轉(zhuǎn)基因油菜與野生芥菜反向回交3代子3代 The third progeny of the third reverse backcross generation between glyphosate-resistant transgenicB.napusand wildB.juncea； BC3mF4L： 抗草丁膦轉(zhuǎn)基因油菜與野生芥菜正向回交3代子3代 The third progeny of the third forward backcross generation between glufosinate-resistant transgenicB.napusand wildB.juncea； BC3pF4L： 抗草丁膦轉(zhuǎn)基因油菜與野生芥菜反向回交3代子3代 The third progeny of the third reverse backcross generation between glufosinate-resistant transgenicB.napusand wildB.juncea.

2)同列中不同的小寫(xiě)字母表示相同時(shí)間同一土層中各樣品間活力種子百分比差異顯著(P<0.05) Different lowercases in the same column indicate the significant (P<0.05) difference in viable seed percentage among different samples in the same soil layer at the same time； *： 相同時(shí)間同一樣品的活力種子百分比在3和15 cm土層間差異顯著(P<0.05) The significant (P<0.05) difference in viable seed percentage of the same sample in 3 and 15 cm soil layers at the same time.

2.3 回交3代子4代活力種子百分比的比較

不同土層中抗除草劑轉(zhuǎn)基因油菜與野生芥菜回交3代子4代活力種子百分比的比較結(jié)果見(jiàn)表3。

2.3.1 不同時(shí)間變化趨勢(shì)比較 總體來(lái)看，3和15 cm土層中野生芥菜和4種回交3代子4代的活力種子百分比變化趨勢(shì)相似，均隨埋藏時(shí)間延長(zhǎng)而下降。

2.3.2 不同樣品間比較 由表3可見(jiàn)：埋藏前，野生芥菜及4種回交3代子4代的活力種子百分比均為100.0%。在3 cm土層中埋藏2個(gè)月后，野生芥菜的活力種子百分比為97.0%，BC3mF5R(抗草甘膦轉(zhuǎn)基因油菜與野生芥菜正向回交3代子4代)和BC3pF5R(抗草甘膦轉(zhuǎn)基因油菜與野生芥菜反向回交3代子4代)的活力種子百分比顯著低于野生芥菜，而B(niǎo)C3mF5L(抗草丁膦轉(zhuǎn)基因油菜與野生芥菜正向回交3代子4代)和BC3pF5L(抗草丁膦轉(zhuǎn)基因油菜與野生芥菜反向回交3代子4代)的活力種子百分比與野生芥菜無(wú)顯著差異；埋藏4、6、8和10個(gè)月后，4種回交3代子4代的活力種子百分比基本上顯著低于野生芥菜。在15 cm土層中埋藏2、4和6個(gè)月后，4種回交3代子4代的活力種子百分比與野生芥菜無(wú)顯著差異；埋藏8個(gè)月后，4種回交3代子4代的活力種子百分比顯著低于野生芥菜；埋藏10個(gè)月后，僅BC3mF5L的活力種子百分比顯著低于野生芥菜，其余3種回交3代子4代的活力種子百分比與野生芥菜無(wú)顯著差異。

2.3.3 不同土層間比較 由表3還可見(jiàn)：在3 cm土層中埋藏2個(gè)月后BC3mF5R、BC3mF5L和BC3pF5L的活力種子百分比顯著低于在15 cm土層中埋藏相同時(shí)間的活力種子百分比，而在3 cm土層中埋藏4、6、8和10個(gè)月后4種回交3代子4代的活力種子百分比顯著低于在15 cm土層中埋藏相同時(shí)間的活力種子百分比，并且，在3 cm土層中埋藏6和8個(gè)月后野生芥菜的活力種子百分比也顯著低于在15 cm土層中埋藏相同時(shí)間的活力種子百分比。

樣品1)Sample1)不同時(shí)間3 cm土層中的活力種子百分比/%2) Viable seed percentage in 3 cm soil layer at different times2)埋藏前Before burying2個(gè)月Two months4個(gè)月Four months6個(gè)月Six months8個(gè)月Eight months10個(gè)月Ten monthsW100.0±0.0a97.0±6.0a93.0±8.9a84.0±7.3a82.0±8.3a83.0±6.0aBC3mF5R100.0±0.0a85.0±3.8b75.0±11.0b74.0±5.2b75.0±3.8ab71.0±2.0bBC3pF5R100.0±0.0a88.0±6.5b76.0±3.3b74.0±2.3b69.0±3.8b65.0±6.0bcBC3mF5L100.0±0.0a91.0±2.0ab74.0±5.2b72.0±3.3b72.0±3.3b64.0±3.3bcBC3pF5L100.0±0.0a91.0±5.0ab74.0±2.3b71.0±2.0b71.0±5.0b63.0±3.8c樣品1)Sample1)不同時(shí)間15 cm土層中的活力種子百分比/%2) Viable seed percentage in 15 cm soil layer at different times2)埋藏前Before burying2個(gè)月Two months4個(gè)月Four months6個(gè)月Six months8個(gè)月Eight months10個(gè)月Ten monthsW100.0±0.0a100.0±0.0a99.0±2.0a98.0±4.0a?97.0±3.8a?89.0±6.0aBC3mF5R100.0±0.0a98.0±4.0a?92.0±5.7a?96.0±4.6a?86.0±5.2b?83.0±8.9ab?BC3pF5R100.0±0.0a94.0±7.7a92.0±7.3a?95.0±6.0a?87.0±6.0b?79.0±5.0ab?BC3mF5L100.0±0.0a100.0±0.0a?97.0±2.0a?95.0±3.8a?83.0±3.8b?78.0±4.0b?BC3pF5L100.0±0.0a100.0±0.0a?98.0±2.3a?97.0±3.8a?85.0±6.8b?80.0±6.5ab?

1)W： 野生芥菜 WildBrassicajuncea(Linn.) Czern.； BC3mF5R： 抗草甘膦轉(zhuǎn)基因油菜與野生芥菜正向回交3代子4代 The fourth progeny of the third forward backcross generation between glyphosate-resistant transgenicB.napusLinn. and wildB.juncea； BC3pF5R： 抗草甘膦轉(zhuǎn)基因油菜與野生芥菜反向回交3代子4代 The fourth progeny of the third reverse backcross generation between glyphosate-resistant transgenicB.napusand wildB.juncea； BC3mF5L： 抗草丁膦轉(zhuǎn)基因油菜與野生芥菜正向回交3代子4代 The fourth progeny of the third forward backcross generation between glufosinate-resistant transgenicB.napusand wildB.juncea； BC3pF5L： 抗草丁膦轉(zhuǎn)基因油菜與野生芥菜反向回交3代子4代 The fourth progeny of the third reverse backcross generation between glufosinate-resistant transgenicB.napusand wildB.juncea.

2)同列中不同的小寫(xiě)字母表示相同時(shí)間同一土層中各樣品間活力種子百分比差異顯著(P<0.05) Different lowercases in the same column indicate the significant (P<0.05) difference in viable seed percentage among different samples in the same soil layer at the same time； *： 相同時(shí)間同一樣品的活力種子百分比在3和15 cm土層間差異顯著(P<0.05) The significant (P<0.05) difference in viable seed percentage of the same sample in 3 and 15 cm soil layers at the same time.

2.4 回交3代子5代活力種子百分比的比較

不同土層中抗除草劑轉(zhuǎn)基因油菜與野生芥菜回交3代子5代活力種子百分比的比較結(jié)果見(jiàn)表4。

2.4.1 不同時(shí)間變化趨勢(shì)比較 總體來(lái)看，3和15 cm土層中野生芥菜和4種回交3代子5代的活力種子百分比變化趨勢(shì)相似，均隨埋藏時(shí)間延長(zhǎng)而下降。

2.4.2 不同樣品間比較 由表4可見(jiàn)：埋藏前，野生芥菜及4種回交3代子5代的活力種子百分比均為100.0%。在3 cm土層中埋藏2個(gè)月后，野生芥菜的活力種子百分比為97.0%，4種回交3代子5代的活力種子百分比與野生芥菜無(wú)顯著差異；埋藏4個(gè)月后，野生芥菜的活力種子百分比為95.0%，4種回交3代子5代的活力種子百分比顯著低于野生芥菜；埋藏6個(gè)月后，僅BC3pF6R(抗草甘膦轉(zhuǎn)基因油菜與野生芥菜反向回交3代子5代)的活力種子百分比顯著低于野生芥菜，其余3種回交3代子5代的活力種子百分比與野生芥菜無(wú)顯著差異；埋藏8個(gè)月后，BC3pF6R和BC3mF6L(抗草丁膦轉(zhuǎn)基因油菜與野生芥菜正向回交3代子5代)的活力種子百分比顯著低于野生芥菜，BC3mF6R(抗草甘膦轉(zhuǎn)基因油菜與野生芥菜正向回交3代子5代)和BC3pF6L(抗草丁膦轉(zhuǎn)基因油菜與野生芥菜反向回交3代子5代)的活力種子百分比與野生芥菜無(wú)顯著差異；埋藏10個(gè)月后，野生芥菜活力種子百分比為79.0%，4種回交3代子5代的活力種子百分比顯著低于野生芥菜。在15 cm土層中埋藏2、4、6、8和10個(gè)月后，4種回交3代子5代的活力種子百分比與野生芥菜基本上無(wú)顯著差異。

2.4.3 不同土層間比較 由表4還可見(jiàn)：在3 cm土層中埋藏2個(gè)月后BC3mF6R的活力種子百分比顯著低于在15 cm土層中埋藏相同時(shí)間的活力種子百分比，而在3 cm土層中埋藏4、6、8和10個(gè)月后，4種回交3代子5代的活力種子百分比顯著低于在15 cm土層中埋藏相同時(shí)間的活力種子百分比，并且，在3 cm土層中埋藏6、8和10個(gè)月后野生芥菜的活力種子百分比也顯著低于在15 cm土層中埋藏相同時(shí)間的活力種子百分比。

樣品1)Sample1)不同時(shí)間3 cm土層中的活力種子百分比/%2) Viable seed percentage in 3 cm soil layer at different times2)埋藏前Before burying2個(gè)月Two months4個(gè)月Four months6個(gè)月Six months8個(gè)月Eight months10個(gè)月Ten monthsW100.0±0.0a97.0±6.0a95.0±5.0a83.0±3.8a80.0±3.3a79.0±2.0aBC3mF6R100.0±0.0a91.0±3.8a75.0±6.0b76.0±3.3ab75.0±5.0ab66.0±5.2bBC3pF6R100.0±0.0a91.0±7.6a72.0±7.3b72.0±5.7b66.0±5.2c64.0±5.7bBC3mF6L100.0±0.0a96.0±3.3a78.0±4.0b78.0±6.9ab71.0±7.6bc69.0±6.0bBC3pF6L100.0±0.0a95.0±6.0a80.0±3.3b77.0±2.0ab76.0±3.3ab70.0±5.2b樣品1)Sample1)不同時(shí)間15 cm土層中的活力種子百分比/%2) Viable seed percentage in 15 cm soil layer at different times2)埋藏前Before burying2個(gè)月Two months4個(gè)月Four months6個(gè)月Six months8個(gè)月Eight months10個(gè)月Ten monthsW100.0±0.0a100.0±0.0a97.0±3.8a94.0±7.7a?86.0±2.3a?83.0±2.0a?BC3mF6R100.0±0.0a98.0±4.0a?87.0±2.0b?85.0±6.0a?83.0±3.8a?78.0±5.2a?BC3pF6R100.0±0.0a95.0±6.0a89.0±5.0ab?87.0±5.0a?82.0±5.2a?77.0±3.8a?BC3mF6L100.0±0.0a100.0±0.0a91.0±8.3ab?92.0±7.3a?86.0±6.9a?81.0±6.0a?BC3pF6L100.0±0.0a97.0±3.8a93.0±6.0ab?88.0±3.3a?87.0±3.8a?81.0±3.8a?

1)W： 野生芥菜 WildBrassicajuncea(Linn.) Czern.； BC3mF6R： 抗草甘膦轉(zhuǎn)基因油菜與野生芥菜正向回交3代子5代 The fifth progeny of the third forward backcross generation between glyphosate-resistant transgenicB.napusLinn. and wildB.juncea； BC3pF6R： 抗草甘膦轉(zhuǎn)基因油菜與野生芥菜反向回交3代子5代 The fifth progeny of the third reverse backcross generation between glyphosate-resistant transgenicB.napusand wildB.juncea； BC3mF6L： 抗草丁膦轉(zhuǎn)基因油菜與野生芥菜正向回交3代子5代 The fifth progeny of the third forward backcross generation between glufosinate-resistant transgenicB.napusand wildB.juncea； BC3pF6L： 抗草丁膦轉(zhuǎn)基因油菜與野生芥菜反向回交3代子5代 The fifth progeny of the third reverse backcross generation between glufosinate-resistant transgenicB.napusand wildB.juncea.

2)同列中不同的小寫(xiě)字母表示相同時(shí)間同一土層中各樣品間活力種子百分比差異顯著(P<0.05) Different lowercases in the same column indicate the significant (P<0.05) difference in viable seed percentage among different samples in the same soil layer at the same time； *： 相同時(shí)間同一樣品的活力種子百分比在3和15 cm土層間差異顯著(P<0.05) The significant (P<0.05) difference in viable seed percentage of the same sample in 3 and 15 cm soil layers at the same time.

3 討論和結(jié)論

土壤種子庫(kù)對(duì)于生態(tài)系統(tǒng)的植被更新至關(guān)重要[31-32]，有活力的種子為植物群落的一部分，是新植物的起源。本研究結(jié)果表明：隨埋藏時(shí)間延長(zhǎng)，3和15 cm土層中野生芥菜及各回交后代的活力種子百分比總體呈下降趨勢(shì)，這是因?yàn)殡S埋藏時(shí)間延長(zhǎng)，種子儲(chǔ)存的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不斷消耗，導(dǎo)致活力種子百分比下降。在3和15 cm土層中埋藏10個(gè)月后，各回交后代的活力種子百分比存在差異，這可能與轉(zhuǎn)基因油菜后代的基因型不同有關(guān)[33-38]。

研究表明：土層深度對(duì)植物的種子活力有很大影響[39-40]。在15 cm土層中埋藏6、8和10個(gè)月后，各回交后代的活力種子百分比顯著高于在3 cm土層中埋藏相同時(shí)間的活力種子百分比，說(shuō)明土壤埋藏深度對(duì)抗除草劑轉(zhuǎn)基因油菜與野生芥菜回交后代的種子活力有顯著影響。比較發(fā)現(xiàn)：活力種子百分比在15 cm土層中的下降速度較3 cm土層慢，這可能是因?yàn)樵谏钔翆又械姆N子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗較少[40]，所處環(huán)境的溫度和濕度相對(duì)穩(wěn)定，有利于種子保持休眠[41-44]；還可能是因?yàn)楸韺踊驕\層土壤中的種子易被動(dòng)物取食、易被微生物侵染霉變失活、易受環(huán)境因子(溫度和濕度等)影響[40-41]。

研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因油菜種子在收獲及運(yùn)輸途中極易發(fā)生逃逸，且逃逸種子可在土壤中存活多年，并能形成自生苗[45-46]；轉(zhuǎn)基因油菜自生苗的抗性基因可通過(guò)花粉漂移至野生近緣種，導(dǎo)致野生近緣種的適合度發(fā)生改變[47]。本研究中，在3 cm土層中埋藏10個(gè)月后，BC3pF4L(抗草丁膦轉(zhuǎn)基因油菜與野生芥菜反向回交3代子3代)的活力種子百分比最低(33.00%)。但由于BC3pF3L(抗草丁膦轉(zhuǎn)基因油菜與野生芥菜反向回交3代子2代)單株可產(chǎn)生至少1萬(wàn)粒飽滿的BC3pF4L種子[25]，若部分種子落入土壤，仍可能產(chǎn)生很多自生苗，具有很大的潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，在評(píng)估轉(zhuǎn)基因作物的抗性能否滲入野生近緣種時(shí)，除了研究轉(zhuǎn)基因作物與野生近緣種的回交后代適合度外，還應(yīng)研究其回交后代種子在土壤中的活力。若土壤種子庫(kù)中存在有活力的回交后代種子，就可能產(chǎn)生自生苗。鑒于此，應(yīng)加強(qiáng)防范轉(zhuǎn)基因油菜的抗性基因向野生芥菜漂移，杜絕產(chǎn)生回交后代；在轉(zhuǎn)基因油菜進(jìn)口過(guò)程中應(yīng)采取有效措施，盡量避免種子逃逸，并加強(qiáng)對(duì)自生苗的監(jiān)測(cè)。