蘆葦葉片中總氮同位素及游離氨基酸濃度對水淹的響應(yīng)

賴媛媛， 朱仁果， 羅 笠， 呂 哲， 孫啟斌

(1. 昆明理工大學(xué)機電工程學(xué)院， 云南 昆明 650093；2. 東華理工大學(xué) 江西省大氣污染成因與控制重點實驗室， 江西 南昌330013； 3. 中山大學(xué)大氣科學(xué)學(xué)院， 廣東 廣州510275)

濕地植物經(jīng)常受到周期性或永久性的水淹脅迫[1]。長期水淹會導(dǎo)致植物根系缺氧，限制植物的生長和發(fā)育[2-3]。蘆葦〔Phragmitesaustralis(Cav.) Trin. ex Steud.〕因適應(yīng)力強、生產(chǎn)力高而廣泛分布在濕地中[4]。水淹條件下，蘆葦會形成大量通氣組織[5]以及高且少的莖節(jié)[6]。

植物組織中總氮同位素(δ15N)被用于示蹤植物在不同環(huán)境濕度下氮代謝變化[7]。游離氨基酸作為植物中重要的初級氮代謝產(chǎn)物[8]，其濃度可以指示植物是否受到環(huán)境壓力[9]，且游離氨基酸濃度對環(huán)境壓力的響應(yīng)較總氮含量更靈敏[10]。Hsu等[11]的研究結(jié)果表明：洋蒲桃〔Syzygiumsamarangense(Blume) Merr. et L. M. Perry〕葉片中總游離氨基酸濃度在水淹14 d后升高了26%，而其總氮含量在水淹35 d后才出現(xiàn)顯著變化。

本研究以鄱陽湖典型濕地植物蘆葦為研究對象，分析蘆葦葉片中總氮含量、δ15N值及游離氨基酸濃度對水淹時間的響應(yīng)，以期明確水淹條件下蘆葦葉片各指標的變化趨勢，為鄱陽湖濕地植物保護提供科學(xué)支持。

1 材料和方法

1.1 材料

供試蘆葦于2016年4月采自江西省鄱陽湖南磯濕地國家級自然保護區(qū)(北緯28°54′、東經(jīng)116°15′)。將只保留根部的蘆葦樣品栽植于塑料盆(長70 cm、寬40 cm、高27 cm)中，栽培土壤為原植物生長土壤。定期澆水維持植物正常生長。2個月后，將長勢相對一致的蘆葦樣品移栽到PVC管(直徑15 cm、高30 cm)中，管內(nèi)裝15 cm深的原植物生長土壤，每管1株，2周后，置于水箱(長120 cm、寬100 cm、高96 cm)中進行水淹(自來水)實驗。每天補充水箱內(nèi)水量以保證水面淹沒植株頂端。水淹實驗在東華理工大學(xué)戶外實驗地進行。

1.2 方法

1.2.1 實驗設(shè)計 設(shè)置水淹0(未淹水)、1、4和11 d共4個處理，每個處理5株，視為5次重復(fù)。實驗完成后采集植物樣品置于干凈的自封袋中，立即帶回實驗室。

1.2.2 樣品前處理 采集的蘆葦葉片用超純水反復(fù)沖洗，徹底去除葉片表面的顆粒物和塵土，然后于75 ℃烘干48 h，磨碎，過200目篩，干燥保存。取樣品0.1 g，用液氮磨碎后，加入2 mL超純水超聲(180 W)提取5 min，于1 000 r·min-1、5 ℃離心5 min，取上清液。使用Dowex 50WX8 H+陽離子交換樹脂(美國Sigma-Aldrich公司)純化氨基酸。

1.2.3 總氮含量和總氮同位素(δ15N)的測定 取1.5 mg上述樣品，采用EA-IRMS〔FLASH 2000元素分析儀，253 Plus同位素比值質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)〕測定其總氮含量及δ15N值。采用購自國際原子能機構(gòu)的咖啡因(IAEA-600，δ15N值為+1‰)、硫酸銨(IAEA-N-2，δ15N值為+20.3‰)和谷氨酸(USGS41a，δ15N值為+47.6‰)標準品對測定值進行校正，樣品重復(fù)測量精度小于0.2‰。

δ15N標準物質(zhì)為大氣氮，樣品中δ15N=〔(R樣品/R標準)-1〕×1 000‰。式中，R樣品和R標準分別為樣品和標準品中15N和14N自然豐度比?？偟亢挺?5N值測定均在江西省大氣污染成因與控制重點實驗室完成。

1.2.4 游離氨基酸濃度的測定 20種氨基酸混合標準溶液硅烷化衍生后[12]，采用GC-MS〔TRACE GC1310氣相色譜，ISQ QD單四極桿質(zhì)譜(美國Thermo Fisher Scientific公司)〕進行測定，結(jié)合氨基酸NIST標準質(zhì)譜圖，僅列出存在顯著差異的絲氨酸(Ser)、天冬氨酸(Asp)和天冬酰胺(Asn)的保留時間及特征離子(表1)。取1 μL游離氨基酸硅烷化衍生產(chǎn)物進行GC-MS分析。通過與標準品對比，結(jié)合氨基酸NIST標準質(zhì)譜圖，對樣品中Ser、Asp和Asn進行定性分析。選用1 nmol·L-1γ-氨基丁酸為內(nèi)標，以游離氨基酸峰面積與γ-氨基丁酸峰面積比為橫坐標(x)，以游離氨基酸濃度為縱坐標(y)進行回歸分析，得到線性回歸方程及R2值(表1)，檢測精度小于0.01‰。

表1 游離氨基酸衍生物特征

Table 1 Characteristics of free amino acid derivatives

氨基酸Amino acid保留時間/minRetentiontime線性回歸方程1)Linear regression equation1)R2主要離子碎片Main ion fragments絲氨酸Ser37.1y=0.795 3x-0.033 70.990 373,362,390,288天冬氨酸Asp40.0y=0.869 8x-0.035 70.993 873,75,302,57天冬酰胺Asn42.1y=1.001 7x-0.009 30.996 773,417,75,147

1)x： 游離氨基酸峰面積與γ-氨基丁酸峰面積比Ratio of peak area of free amino acid to peak area ofγ-aminobutyric acid；y： 游離氨基酸濃度Free amino acid concentration.

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 23.0軟件處理數(shù)據(jù)，采用Tukey檢驗進行多重比較。

2 結(jié)果和分析

實驗結(jié)果(表2)表明：水淹0～11 d，蘆葦葉片中總氮含量無顯著變化。水淹11 d，蘆葦葉片中總氮同位素(δ15N)較水淹0 d顯著(P<0.05)偏負。隨著水淹天數(shù)的增加，蘆葦葉片中總游離氨基酸、絲氨酸(Ser)、天冬氨酸(Asp)和天冬酰胺(Asn)濃度均呈先升高后降低的趨勢，其中，水淹4和11 d，總游離氨基酸、Ser、Asp和Asn濃度較水淹1 d顯著下降。

水淹天數(shù)/dFlooding days總氮含量/%Total nitrogen content總氮同位素/‰Total nitrogen isotope濃度/(μmol·g-1) Concentration總游離氨基酸Total free amino acids絲氨酸Ser天冬氨酸Asp天冬酰胺Asn02.35±0.88a+(2.08±0.74)a20.03±9.23ab1.59±0.69b2.22±1.04ab2.33±2.17ab12.09±0.31a+(1.43±0.47)ab27.66±1.93a3.09±0.48a3.34±0.30a4.07±1.72a42.11±0.17a+(1.03±0.18)ab10.42±7.66bc0.85±0.83b1.37±1.27b0.64±0.92b112.26±0.10a+(0.98±0.51)b6.05±3.32c0.57±0.39b0.85±0.35b0.39±0.27b

1)同列中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Different lowercases in the same column indicate the significant (P<0.05) difference.

3 討論和結(jié)論

氮同位素已被廣泛用于了解植物在不同環(huán)境壓力下(如干旱、水淹和營養(yǎng)限制等)的氮代謝機制研究[13]。本研究中，隨水淹時間的延長，蘆葦葉片中總氮同位素逐漸偏負，這可能與高含水量土壤中微生物活性降低及凈硝化作用受到限制有關(guān)[14]，說明蘆葦葉片中總氮同位素能響應(yīng)環(huán)境水分變化。但植物組織不同代謝過程中產(chǎn)生的總氮同位素分餾差異很大[13]，植物中總氮同位素會掩蓋植物代謝產(chǎn)物不同單體間的氮同位素差異[15]。

游離氨基酸的通量變化可以響應(yīng)環(huán)境壓力(水淹)的變化[16]。蘆葦葉片中總氮含量在水淹0～11 d無顯著變化，而總游離氨基酸濃度在水淹4和11 d后較水淹1 d顯著下降，可能由于植物中厭氧誘導(dǎo)酶的生物合成對氨基酸的需求增加[17]，也可能由于水淹條件下植物對硝酸鹽的吸收下降加劇根部呼吸作用減弱，導(dǎo)致能量(ATP)減少，造成從環(huán)境中獲得的氮素被植物同化為氨基酸的過程受到影響[11]。

植物為了適應(yīng)外界環(huán)境的改變會快速做出應(yīng)激反應(yīng)。本研究中，蘆葦葉片中絲氨酸(Ser)濃度在水淹1 d后顯著上升，該結(jié)果與Koppitz等[18]對經(jīng)歷洪水后蘆葦?shù)难芯拷Y(jié)果保持一致。推測可能由于水淹條件下，氧氣濃度急劇下降，植物對碳水化合物需求的增加導(dǎo)致糖酵解代謝加快[5]，中間產(chǎn)物3-磷酸甘油酸鹽積累，進而通過轉(zhuǎn)氨作用造成Ser積累[19]。水淹4和11 d后，蘆葦葉片中Ser濃度顯著降低，一方面與水淹條件下厭氧誘導(dǎo)酶的生物合成對氨基酸的需求增加有關(guān)[17]，另一方面可能與Ser被用于合成其他氨基酸及蛋白質(zhì)有關(guān)[19]。

天冬氨酸(Asp)和天冬酰胺(Asn)是高等植物氮運輸中儲存和運輸化合物的主要氨基酸[5]。本研究中，水淹4 d后，蘆葦葉片中Asp和Asn濃度顯著下降，與水淹21 d后象牙花(ErythrinaspeciosaAndr.)[20]的變化趨勢相似，可能是因為缺氧會減少碳流入三羧酸(TCA)循環(huán)，導(dǎo)致與TCA循環(huán)有關(guān)的酶活性下降，使TCA循環(huán)受限，從而造成植物組織中與TCA循環(huán)有關(guān)的氨基酸濃度下降[21]。

綜上所述，蘆葦葉片中總氮同位素和游離氨基酸濃度對水淹的響應(yīng)較總氮含量更靈敏，是指示蘆葦受到環(huán)境壓力(水淹)的良好指標。