N-乙酰半胱氨酸腹腔注射對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷的預(yù)防作用觀察

馮艷，王榮麗

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，四川瀘州 646000)

急性肺損傷(ALI)是多種因素引起的彌漫性肺實(shí)質(zhì)損傷，也是全身炎癥反應(yīng)綜合征或多器官功能障礙綜合征在肺部的典型表現(xiàn)，其特點(diǎn)是肺泡-毛細(xì)血管屏障損傷所造成的彌散性肺泡損傷及肺間質(zhì)水腫，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及炎癥介質(zhì)過(guò)量表達(dá)和釋放[1，2]。ALI的機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，尚未完全闡明，但越來(lái)越多的證據(jù)表明多種信號(hào)通路及相關(guān)的蛋白可調(diào)節(jié)ALI的炎癥反應(yīng)[3]。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)是一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，普遍存在于真核細(xì)胞,高度進(jìn)化保守，能夠被多種因素激活。JNK屬于MAPK家族成員之一，是一種應(yīng)急激活的蛋白激酶(SAPK)，參與許多炎癥信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。N-乙酰半胱氨酸(NAC)作為祛痰藥廣泛應(yīng)用于臨床,其是一種含有巰基的化合物，能裂斷痰液中黏蛋白的二硫鍵(SS)，將黏蛋白分解，降低痰的黏滯[4]。除此之外，NAC還有抗氧化、抗炎作用[5,6]。Mao等[7]發(fā)現(xiàn)NAC通過(guò)TLR-4 / NF-κB 信號(hào)通路減輕LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷程度。張艱等[8]發(fā)現(xiàn)NAC對(duì)ALI的炎癥抑制可能是通過(guò)抑制p38MAPK的激活起作用。NAC能否通過(guò)JNK信號(hào)通路對(duì)LPS誘導(dǎo)的ALI發(fā)揮保護(hù)性調(diào)控，鮮見報(bào)道。2019年2～5月,本研究通過(guò)建立LPS誘導(dǎo)的ALI模型探討NAC對(duì)ALI的預(yù)防作用，并進(jìn)一步探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑、儀器 30只BALB/c 雌性小鼠，體質(zhì)量19～23 g，購(gòu)于重慶萊彼特生物科技有限公司，自由飲食、普通光照飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的開展取得了西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。NAC購(gòu)于大連美侖生物公司；脂多糖購(gòu)于Sigma；MPO檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京建成生化試劑公司；小鼠血管細(xì)胞黏附分子(VCAM)ELISA試劑盒購(gòu)于武漢科鹿生物科技公司；小鼠TNF-α ELISA 試劑盒購(gòu)于武漢科鹿生物科技公司；Western blotting相關(guān)試劑購(gòu)于武漢拜意爾生物科技有限公司；水合氯醛購(gòu)于廈門海標(biāo)科技有限公司。酶標(biāo)儀購(gòu)于Diatek公司；電泳儀及電泳槽購(gòu)于北京市六一儀器廠；臺(tái)式離心機(jī)購(gòu)于上海安亭科學(xué)儀器廠；冷凍離心機(jī)購(gòu)于湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司。

1.2 NAC腹腔注射及小鼠ALI模型制作 30只BALB/c雌性小鼠，隨機(jī)分為5組：NAC 1、2、3組，模型組，對(duì)照組，各組分別為6只。參照文獻(xiàn)[9]鼻孔滴入10 μg LPS制作ALI模型。各組均以水合氯醛腹腔麻醉。對(duì)照組鼻孔滴入50 μL PBS，模型組小鼠鼻孔滴入LPS 10 μg (LPS溶于50 μL的PBS溶液中)。NAC 1、2、3組分別腹腔注射NAC 100、200、300 mg/kg，0.5 h后小鼠鼻孔滴入LPS 10 μg。各組小鼠于滴鼻處理后7 h被處死。頸椎脫臼法處死小鼠后，取出雙肺，右肺上葉測(cè)定肺干濕重比(W/D)，取左肺經(jīng)4%甲醛液固定行病理組織學(xué)檢查，取右肺中葉檢測(cè)MPO、VCAM-1、TNF-α，取右肺下葉檢測(cè)pJNK蛋白。

1.3 小鼠肺組織病理變化觀察及肺W/D測(cè)算 采用HE染色觀察小鼠肺組織病理。小鼠左肺組織采用4%多聚甲醛進(jìn)行固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，后進(jìn)行HE染色，使用200倍光學(xué)顯微鏡下對(duì)小鼠肺組織病理學(xué)情況進(jìn)行記錄。取小鼠右肺組織，將肺組織表面的水分和血液用濾紙吸干后稱W，置于70 ℃烘烤箱內(nèi)烘干48 h至恒重，計(jì)算肺組織W/D。

1.4 小鼠肺組織MPO 、TNF-及VCAM-1檢測(cè) 取小鼠肺組織，使用勻漿器充分勻漿(冰上操作)，10 000 r/min離心10 min，收集離心后上清，即為肺臟組織勻漿液。采用ELISA方法，根據(jù)MPO試劑盒說(shuō)明書的操作步驟測(cè)定勻漿液在480 nm處的吸光度值(OD值)，根據(jù)吸光度值計(jì)算不同肺臟組織的MPO活性。計(jì)算公式：MPO活性=(測(cè)定OD值-對(duì)照OD值)/11.3×取樣量(克)。采用ELISA法檢測(cè)肺組織勻漿中TNF-α、VCAM-1，用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD 值)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算肺組織TNF-α、VCAM-1的濃度。

1.5 小鼠肺組織p-JNK蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。肺組織塊用PBS漂洗，制成勻漿，提取并測(cè)定蛋白濃度。配制SDS-PAGE 濃縮膠、SDS-PAGE分離膠，按濃縮膠80 V、分離膠120 V進(jìn)行恒壓電泳。準(zhǔn)備轉(zhuǎn)膜濾紙和PVDF膜，恒流轉(zhuǎn)膜。將轉(zhuǎn)好的膜加入封閉液，室溫封閉。除去封閉液，加入以下一抗：抗GAPDH 單克隆抗體，抗p-JNK抗體，過(guò)夜。然后將膜在室溫下與驢抗兔二抗一起溫育，隨后用TBST洗滌4次。滴加ECL混合溶液到膜的蛋白面?zhèn)?，暗室中曝光。膠片進(jìn)行掃描存檔，使用 GAPDH 作為參考，AlphaEaseFC軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶OD值。

2 結(jié)果

2.1 肺組織大體病理表現(xiàn)及肺W/D 對(duì)照組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡間隔無(wú)增寬，可見少量炎性細(xì)浸潤(rùn)。模型組肺組織損傷嚴(yán)重，肺泡間隔增寬，肺組織間質(zhì)及肺泡腔可見大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；NAC預(yù)處理的各組肺組織相對(duì)模型組隨劑量增加損傷程度減輕；NAC3組光鏡下可見肺泡壁多數(shù)完整，肺泡隔較模型組明顯變窄，肺組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少。NAC 1、2、3組，模型組，對(duì)照組肺W/D分別為7.20±0.49、6.04±0.62、5.02±0.42、7.93±0.69、4.36±0.20。與對(duì)照組相比，模型組肺組織W/D升高(P<0.001)；與模型組相比，NAC 1 、2、3組肺W/D降低(P均<0.05)，且NAC1、2、3組之間兩兩比較，P均<0.05。

2.2 各組肺組織MPO活性、TNF-α含量 、VCAM-1含量及p-JNK蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組相比，模型組肺組織MPO活性，TNF-α、VCAM-1含量，p-JNK蛋白相對(duì)表達(dá)量升高(P<0.001)；與模型組相比，NAC 1 、2、3組肺組織MPO活性，TNF-α、VCAM-1含量，p-JNK蛋白相對(duì)表達(dá)量降低(P均<0.05)，NAC 1、2、3組肺組織MPO活性、TNF-α含量、p-JNK蛋白相對(duì)表達(dá)量之間兩兩比較，P均<0.05。NAC 各組VCAM-1含量?jī)蓛杀容^：NAC 1組與3組、2與3組之間比較，P均<0.05；NAC1、2組之間比較，P>0.05。見表1。

表1 各組肺組織MPO活性，TNF-α、VCAM-1含量及p-JNK蛋白相對(duì)表達(dá)量

3 討論

ALI是由嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、休克、中毒、吸入性有害氣體、急性胰腺炎等引起的急性進(jìn)行性呼吸衰竭[9，10]。其病理生理機(jī)制表現(xiàn)為肺泡-毛細(xì)血管屏障損傷、炎癥、氧化損傷和肺泡細(xì)胞凋亡[2]。在 ALI 炎癥過(guò)程中，炎癥細(xì)胞在肺內(nèi)大量積聚浸潤(rùn)，炎癥介質(zhì)過(guò)度釋放、活化和抗炎因子相對(duì)減少，引發(fā)體內(nèi)炎癥反應(yīng)失衡。此外，炎性細(xì)胞因子和趨化因子可以募集中性粒細(xì)胞和其他炎性細(xì)胞，以進(jìn)一步釋放促進(jìn)肺部炎癥的炎性因子和細(xì)胞因子，導(dǎo)致 ALI 的發(fā)展。目前ALI的治療干預(yù)措施，如低潮氣量通氣或俯臥位，主要是支持或旨在通過(guò)機(jī)械通氣避免額外的肺損傷[11]。然而，機(jī)械通氣不能夠逆轉(zhuǎn)ALI患者病情，且由于ALI患者肺臟病變不均一，仍有部分患者會(huì)出現(xiàn)呼吸機(jī)相關(guān)肺損傷，進(jìn)而使得病情惡化[12]。NAC是一種具有抗炎特性的含硫醇抗氧化劑[6]。本研究采用LPS滴鼻建立ALI動(dòng)物模型。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NAC預(yù)處理能夠減輕LPS誘導(dǎo)的ALI，降低了W/D、MPO活性，抑制了炎性細(xì)胞因子TNF-α、黏附分子VCAM-1的分泌以及JNK的磷酸化。NAC預(yù)處理能夠減輕LPS誘導(dǎo)的ALI肺組織病理?yè)p傷，表明NAC對(duì)ALI產(chǎn)生了有效的保護(hù)作用。

肺泡屏障功能的破壞，導(dǎo)致對(duì)水、蛋白質(zhì)和其他溶質(zhì)的滲透性增加，是臨床和實(shí)驗(yàn)性 ALI 的標(biāo)志[13]。在動(dòng)物研究[14]中，肺血管通透性可以根據(jù)肺組織樣品的W/D來(lái)評(píng)估。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NAC能夠顯著降低W/D，且呈劑量依賴性降低，表明NAC可改善肺微血管通透性，抑制漿液向肺組織的滲漏。

白細(xì)胞浸潤(rùn)，特別是中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)是LPS 損傷后的肺部炎癥的特征[15]。中性粒細(xì)胞激活后從脈管系統(tǒng)遷移到肺泡腔內(nèi)，導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子水平升高，促進(jìn)肺損傷的發(fā)展和持續(xù)[16]。MPO是中性粒細(xì)胞粒細(xì)胞中的一種豐富的酶，可產(chǎn)生次氯酸，用于殺死入侵的細(xì)菌，因此，MPO活性反映了中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)數(shù)目和活性[17]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)NAC可顯著降低MPO活性，表明NAC可抑制中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，改善小鼠肺損傷程度。TNF-是ALI早期階段的生物標(biāo)志物，可引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，并誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞產(chǎn)生其他細(xì)胞因子，如IL-6[18]。實(shí)驗(yàn)中，NAC干預(yù)可使肺組織中TNF-α分泌水平明顯降低，呈劑量依賴性降低，表明NAC顯著抑制TNF-α的分泌，來(lái)改善ALI小鼠的炎癥反應(yīng)。中性粒細(xì)胞向發(fā)炎肺部的遷移是由多種因素介導(dǎo)的，其中細(xì)胞黏附分子和趨化因子被認(rèn)為是最重要的因素[19]。外周血中性粒細(xì)胞通過(guò)VCAM-1透過(guò)肺泡毛細(xì)血管屏障募集到發(fā)炎的肺組織中[20]。VCAM-1主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)。正常生理?xiàng)l件下，肺血管內(nèi)皮細(xì)胞不表達(dá)或者僅少量表達(dá)VCAM-1，內(nèi)毒素、促炎因子等刺激致黏附分子大量表達(dá)[21]。經(jīng)NAC干預(yù)后，VCAM-1的表達(dá)顯著降低，并呈劑量依賴性降低，表明NAC可以降低黏附分子的表達(dá)，減輕VCAM-1所介導(dǎo)的中性粒細(xì)胞在肺組織中的募集和錨定，從而減輕ALI。

MAPK家族的成員主要包括JNK，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)和p38MAPK。MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路高度進(jìn)化保守，能夠?qū)Σ煌拇碳ぷ龀鰠f(xié)調(diào)和整合，調(diào)控著細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖、分化、成熟、凋亡等過(guò)程，也是細(xì)胞內(nèi)觸發(fā)炎性反應(yīng)的主要通路。JNK一旦被激活則成為p-JNK，其包含雙磷酸化的功能區(qū)與c-Jun N端的活化區(qū)結(jié)合，使其第63、73位絲氨酸殘基磷酸化。c-Jun是轉(zhuǎn)錄因子活化蛋白1(AP-1)的組成部分，而活化的AP-1是與應(yīng)激和炎癥有關(guān)基因的關(guān)鍵反式激活劑。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS誘導(dǎo)ALI小鼠的肺組織中JNK磷酸化明顯增強(qiáng)，肺組織炎癥介質(zhì)升高，且模型組的p-JNK表達(dá)量最大，肺組織炎癥介質(zhì)含量最高，提示JNK信號(hào)通路參與了LPS誘導(dǎo)的ALI炎癥反應(yīng)。為了明確NAC對(duì)LPS誘導(dǎo)ALI的保護(hù)性作用是否是通過(guò)JNK信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的，我們給予3種不同劑量NAC預(yù)處理ALI大鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NAC預(yù)處理組p-JNK蛋白表達(dá)均有不同程度的減少，且呈劑量依賴性方式降低，表明NAC能夠抑制JNK的磷酸化。JNK生物學(xué)活性是在其磷酸化狀態(tài)下實(shí)現(xiàn)的，NAC可能通過(guò)抑制p-JNK表達(dá)在一定程度上抑制LPS誘導(dǎo)的ALI炎癥反應(yīng)。

綜上所述， NAC能夠通過(guò)減輕ALI小鼠肺水腫，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)及TNF-α、VCAM-1的表達(dá)發(fā)揮有效保護(hù)作用；NAC能夠抑制LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠JNK信號(hào)通路的激活。NAC可能通過(guò)抑制JNK信號(hào)通路對(duì)LPS誘導(dǎo)的ALI發(fā)揮保護(hù)性作用。