轉(zhuǎn)子的光學(xué)標測技術(shù)及進展

王澤呈 秦牧 劉旭

心房顫動(簡稱房顫)是臨床上常見的一種心律失常的類型，它的發(fā)病率高且隨著年齡的增長而升高。房顫會明顯的影響患者的心臟功能，并降低其生活質(zhì)量，增加其死亡率[1]。目前臨床上常用的治療房顫的方式主要為藥物控制心室率以及抗凝治療以預(yù)防血栓[2]，藥物治療可以改善患者癥狀，預(yù)防房顫的并發(fā)癥，但無法徹底治愈房顫。

目前臨床上認為導(dǎo)管射頻消融術(shù)是能治療房顫的方法之一，而環(huán)肺靜脈隔離(CPVI)又被認為是房顫導(dǎo)管消融的“基石”，它被廣泛的運用于陣發(fā)性房顫、持續(xù)性房顫及永久性房顫的治療中。對于陣發(fā)性房顫，目前臨床上主要以CPVI為主，而對于持續(xù)或永久性房顫，除CPVI外，術(shù)者通常還會采用線性消融或碎裂電位消融等補充術(shù)式，然而由于房顫的機制目前仍未闡明，對于房顫的射頻消融手術(shù)目前仍有較高復(fù)發(fā)率，醫(yī)生們迫切的希望尋找到一種更個體化、針對性的治療策略以改善這一困境。在Narayan等[3]的研究中，轉(zhuǎn)子(ROTOR)的概念被首次提及，在這項CON-FIRM研究中，術(shù)者在房顫患者的心房內(nèi)可以標測到一種螺旋波，他們把這種螺旋波稱為“轉(zhuǎn)子”，隨后對轉(zhuǎn)子進行消融可以有效的終止房顫。在研究者針對轉(zhuǎn)子進行進一步的研究證實中，運用了多種不同的標測方式，包括且不限于無創(chuàng)電生理成像(ECGi)[4]、腔內(nèi)全景式電生理標測[3]、對比劑延遲增強核磁共振顯像[5]、相位標測[6]等，而 “光學(xué)標測”(optical mapping)技術(shù)也被運用于研究轉(zhuǎn)子。筆者即針對光標測技術(shù)在轉(zhuǎn)子標測中的運用進行闡述。

1 光學(xué)標測技術(shù)的原理及方法

自Davila等[7]于1973年最早運用光學(xué)標測技術(shù)記錄了神經(jīng)細胞的動作電位，Salama等[8]于1976年運用光學(xué)標測技術(shù)記錄了心臟細胞的電活動，后于1990年，Davidenko等[9]運用光學(xué)標測在動物心臟中發(fā)現(xiàn)了螺旋波的存在，并證明它可以誘發(fā)室性心動過速，光學(xué)標測技術(shù)在細胞電活動的研究中已運用了很久。

光學(xué)標測技術(shù)的原理是基于波長相關(guān)的光與組織的相互作用，包括了光子的散射、吸收、反射和熒光效應(yīng)。通過光學(xué)標測技術(shù)研究心臟的電位變化，即是通過運用電壓敏感的熒光性染料作為標記物，使細胞跨膜電位的變化表現(xiàn)為熒光物質(zhì)亮度的變化，并被相關(guān)檢測裝置記錄下來。電壓敏感的熒光材料通常為鈣離子螯合劑，經(jīng)過熒光染料標記的細胞，其內(nèi)鈣離子與熒光染料相結(jié)合，使細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化可以被即時觀測，由此反應(yīng)出心肌細胞除極和復(fù)極的過程。再運用光學(xué)探頭，可以讓我們可以了解同一片心肌組織的不同區(qū)域在同一時間的除極和復(fù)極的情況，進而了解到這一片心肌組織在一個時間段內(nèi)的電活動過程，也正是如此光標測技術(shù)能非常好的運用于轉(zhuǎn)子的標測中。

在目前的光學(xué)成像技術(shù)中，接收成像裝置包括電子擴增管(photomultipliers,PMT)，激光掃描(laser scanning)，電荷耦合(charge-coupled device，CCD)照相機，光電二極管陣列(photodiode arrays，PDA)以及互補金屬氧化物半導(dǎo)體(complementary metal-oxide semiconductor,CMOS)照相機。其中PDA技術(shù)和CCD相機在心臟的成像中運用的較多，而CCD技術(shù)相較于PDA有著更高的空間分辨率，這得益于它感應(yīng)器上較多的像素點，但這與此同時也帶來了較低的靈敏度和較高的信噪比。

任意一個光學(xué)標測系統(tǒng)都包括一個二維的光學(xué)感受器和一個穩(wěn)定的光源，可選擇的光源包括了激光、鎢鹵素?zé)艋蛘甙l(fā)光二極管。圖1展示的是一個單透鏡的光學(xué)標測系統(tǒng)的構(gòu)造[10]，它包括一個光電二極管陣列，一個256通道的信號調(diào)整器/增幅器，模擬-數(shù)字信號轉(zhuǎn)換器以及一臺電腦。激發(fā)光束通過一個(520±30) nm的干涉濾光片并聚焦在預(yù)先放置于組織室內(nèi)的組織表面，相機鏡頭負責(zé)收集熒光，并將其引導(dǎo)通過一個610 nm長的濾鏡，將所選擇的心臟區(qū)域的圖像聚焦在PDA上面。

圖1 光標測試驗系統(tǒng)圖例[10]

2 光學(xué)標測技術(shù)在轉(zhuǎn)子標測中的運用

在房顫的維持機制中，折返一直占領(lǐng)著主要的地位。20世紀40年代，研究者們認為折返可能維持并驅(qū)動著房顫[11]，到了2012年，Narayan等[3]利用最新的腔內(nèi)全景式電生理標測技術(shù)，將兩個64極的籃網(wǎng)電極分別置入患者的左、右房內(nèi)，并在房顫的狀態(tài)下進行心房電活動的同步記錄，通過計算機的分析處理，找到轉(zhuǎn)子靶點，對其進行消融能有效的終止房顫的發(fā)作。而在隨后的研究中，研究者們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)子作為一種特殊的功能性折返，具有可移動的特點[12]，轉(zhuǎn)子發(fā)出的螺旋波圍繞著一個核心旋轉(zhuǎn)，且轉(zhuǎn)子的周長也具有不定性。當轉(zhuǎn)子的波前(wave front)在移動時如遇到障礙，會分裂產(chǎn)生更多子波[13]。以上這些對轉(zhuǎn)子更深入的研究，離不開各種標測技術(shù)的幫助，而光標測技術(shù)，就是在轉(zhuǎn)子研究中極為重要的工具之一。

早在1998年，Skenes等[14]就利用光學(xué)標測技術(shù)在房顫發(fā)作的羊心臟上發(fā)現(xiàn)了其電活動在時間及空間上具有周期性，而在此之前，房顫發(fā)作時不規(guī)則的電活動被普遍認為是無序的、隨機的。他們利用高分辨率的成像技術(shù)以及光學(xué)頻譜分析來研究置于6個灌注系統(tǒng)里的20個離體羊心臟，以確認連續(xù)的波前(wave fronts)具有時間及空間上的周期性。對房顫心臟的頻譜分析中顯示，所有的標本均有多個窄帶峰和一個主峰[(平均(9.4±2.6) Hz；周長(112±26)ms)]。20例右房光學(xué)標測記錄中的12例以及全部的左房標測結(jié)果證明了時間和空間上的周期性。在他們看來，在個別例子中，這種周期性的電活動來源于心外膜的轉(zhuǎn)子或周期性的可能代表了跨心房壁的折返的突破點(breakthroughs)。而在大多數(shù)情況下，他們觀察到的周期性的波是由視野外進入成像區(qū)域的。

圖2中的上圖是Skenes等離體羊心臟實驗裝置的示意圖，在這次實驗中，研究者們?nèi)』铙w羊的心臟標本置入灌注裝置，冠狀動脈通過主動脈根部的套管在115～140 mL/min的恒定流量下持續(xù)灌注，在實驗開始時，確保心臟處于竇性節(jié)律，并有節(jié)奏地有力收縮。甲氧基維拉帕米(D600, 2×10-6mol/L)作為電解耦劑添加到臺式液(Tyrode′s solution)中。注射5～10 ml的電位染料di-4-ANEPPS (10 mg/mL)以同時成像心外膜電位變化引起的熒光。研究者們使用兩個相同的攝像機同時記錄了右房游離壁的20 000個位點和左房附著物的10 000個位點。利用準單色光(535 nm)直接照射到心房的心外膜表面。發(fā)射的熒光通過645 nm濾波器，投射到CCD攝像機上，以每秒120幀的速度采集(采樣間隔為8.33 ms)。兩個攝像機都是由一個脈沖同時觸發(fā)的。隨后研究者們用心外膜的高頻刺激誘發(fā)房顫，并開始進行光學(xué)標測，如圖2中下圖所示，4張連續(xù)的等時線圖記錄了490 ms時間內(nèi)左房的激活情況，從圖中可以看出這段時間內(nèi)，左房被相同的空間定向的波陣面(右下角來源)反復(fù)激活，波陣面的周長為120 ms，這也與連接于心外膜的雙極心電圖的主頻一致。

圖2 離體羊心臟的光學(xué)標測裝置示意及標測結(jié)果[14]

Skenes等的實驗，利用高精密度的光學(xué)標測技術(shù)證實了房顫發(fā)作時，心房電活動在時間及空間上具有周期性，改變了以往人們對房顫發(fā)作時的心電活動規(guī)律的看法，房顫發(fā)作時，心房的電活動并非是無組織，無規(guī)律的活動。同時，如圖3所示，Skenes等首次在左房中利用光學(xué)標測技術(shù)發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)子的存在，提出了轉(zhuǎn)子的概念，并指出，轉(zhuǎn)子是基于組織傳導(dǎo)的異質(zhì)性和不應(yīng)期而形成的。不過當時雖有提及轉(zhuǎn)子的理念，但研究者們并沒有深入研究轉(zhuǎn)子在房顫維持機制中發(fā)揮的巨大作用，也沒有發(fā)現(xiàn)對轉(zhuǎn)子的消融能有效終止房顫，轉(zhuǎn)子的概念仍未得到廣泛的重視。

到了2015年，在Hansen等[15]的研究中，研究者們在人類心臟的內(nèi)外膜同時進行光學(xué)標測，提出了房顫由轉(zhuǎn)子維持的新證據(jù)。如圖4中所示，在這項研究中，研究者們?nèi)∮?個冠狀動脈灌注下的患有房顫的人類右房，并用近紅外光譜的di-4-ANBDQBS染料染色。他們使用雙面的光學(xué)標測系統(tǒng)[(內(nèi)膜以及外膜，分辨率330 μm2和一個全景的，分辨率940μm2的CMOS照相機(100×100像素)]對心臟的內(nèi)膜以及外膜的動作電位同時進行標測，同時計算得到內(nèi)外膜間的電位延遲，由全景相機得到的平均的主頻率可計算出房顫的周長。研究者們還利用3D釓對比增強核磁共振(GE-MRI，分辨率80μm3)來顯示心房壁的結(jié)構(gòu)，包括其厚度、跨膜纖維的角度差異以及間質(zhì)的纖維化程度。研究者們同樣是以高頻刺激來誘發(fā)房顫并使其維持。

圖5中展示了Hansen等的一部分研究成果，A、B兩圖是三維釓對比劑增強核磁共振顯像結(jié)果，該結(jié)果顯示出了房顫的傳導(dǎo)路徑(紅箭頭)以及驅(qū)動它的折返(黑箭頭)。B圖通過三維釓對比劑增強核磁共振成像顯示的心肌截面，在這些截面中發(fā)現(xiàn)了在折返環(huán)路上存在著的間質(zhì)纖維化(白箭頭所指)。C圖展示了通過光學(xué)標測得到的房顫的主頻率，其中a區(qū)顯示了驅(qū)動灶的頻率，達到了15.6 Hz，b區(qū)則為驅(qū)動灶外的頻率，平均在8.9 Hz。D圖展示了相同區(qū)域，心內(nèi)膜和心外膜光學(xué)標測的成像結(jié)果，在心內(nèi)膜發(fā)現(xiàn)了折返，其路徑由黑色箭頭所指，而在心外膜則表現(xiàn)為一個突破，黑色虛線顯示了心內(nèi)膜折返環(huán)的位置。E圖展示了這個折返的光學(xué)動作電位情況，可以觀察到透壁電位傳導(dǎo)的延遲。

圖5 離體人類心臟在房顫下的內(nèi)外膜同步光學(xué)標測及三維對比劑增強核磁共振(GE-MRI)顯像結(jié)果[15]

這次光學(xué)標測的結(jié)果再次證實了折返是房顫維持的重要機制，而心內(nèi)外膜同時的標測更清晰的展示出了動作電位在透壁傳導(dǎo)時出現(xiàn)的延遲，同時揭示出在心內(nèi)膜標測到的轉(zhuǎn)子有多種表現(xiàn)形式的原因——即轉(zhuǎn)子具有空間立體的結(jié)構(gòu)。當我們在心內(nèi)膜進行標測時，轉(zhuǎn)子可能表現(xiàn)一個局部高頻且離散的電位、一個局灶的興奮點抑或是高頻的電位，這三種多樣化的標測結(jié)果所形成的原因主要取決于轉(zhuǎn)子的空間結(jié)構(gòu)，當轉(zhuǎn)子在內(nèi)膜平面上旋轉(zhuǎn)時，它表現(xiàn)為局部高頻且離散的電位；當它在內(nèi)外膜間折返時，轉(zhuǎn)子在心內(nèi)膜表現(xiàn)為一個突破；當轉(zhuǎn)子在心外膜旋轉(zhuǎn)時，我們則可以在內(nèi)膜標測到多個高頻的電位。再結(jié)合對比增強核磁共振的顯像，讓我們對折返環(huán)上的解剖結(jié)構(gòu)有了更直觀的認識，也證明了纖維化在轉(zhuǎn)子形成和維持中發(fā)揮著巨大的作用。該實驗結(jié)果不僅揭示出轉(zhuǎn)子是呈現(xiàn)空間立體的結(jié)構(gòu)，也指導(dǎo)我們在心內(nèi)膜對轉(zhuǎn)子進行標測時須注意到轉(zhuǎn)子不同的表現(xiàn)形式，提高了轉(zhuǎn)子消融的成功率。

光學(xué)標測自1998年第一次運用于轉(zhuǎn)子的標測，如今已走過20個年頭，作為轉(zhuǎn)子研究中最重要的武器之一，多次光學(xué)標測的結(jié)果讓我們對轉(zhuǎn)子有了更清晰的了解與認識，本文取兩例有代表性的轉(zhuǎn)子光學(xué)標測的研究進行介紹，僅是光學(xué)標測在轉(zhuǎn)子研究中貢獻的冰山一角。通過目前各光學(xué)標測的研究結(jié)果，結(jié)合無創(chuàng)電生理成像(ECGi)、腔內(nèi)全景式電生理標測、相位標測等不同標測方式的成果，研究者們對于轉(zhuǎn)子的形成以及維持運轉(zhuǎn)的認識愈發(fā)清晰，臨床上對轉(zhuǎn)子消融的結(jié)果也在陸續(xù)發(fā)表，且成績喜人，我們有理由相信，隨著轉(zhuǎn)子研究的更加深入以及轉(zhuǎn)子消融技術(shù)的逐漸展開，房顫這一疾病的治療也將逐漸變得個體化、精確化，房顫消融術(shù)的成功率也將得到明顯改善。