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    4種黏土對飼用植酸酶的吸附特性

    2019-12-16 01:42:53劉永紅孔晶楊志鵬
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年19期
    關(guān)鍵詞:吸附蒙脫石

    劉永紅 孔晶 楊志鵬

    摘要:通過振蕩吸附試驗(yàn),考察了振蕩時(shí)間、振蕩速度、pH值和黏土添加量等因素下,沸石粉、蒙脫石、酸化凹凸棒土和凹凸棒土對飼用植酸酶的吸附動(dòng)力學(xué)和等溫吸附特性。結(jié)果表明:飼用植酸酶能夠在60 min中內(nèi)快速吸附,120 min 內(nèi)達(dá)到吸附平衡;振蕩速度為150 r/min時(shí),4種黏土對飼用植酸酶吸附率達(dá)到最大,分別為:沸石粉31%,蒙脫石48%,酸化凹凸棒土53%,凹凸棒土35%。隨著pH值由2增至8,4種黏土對飼用植酸酶的吸附率逐漸減小。4種黏土對飼用植酸酶的吸附動(dòng)力學(xué)過程均符合準(zhǔn)二級動(dòng)力學(xué)模型。Langmuir模型對沸石粉、蒙脫石和凹凸棒土等溫吸附過程擬合程度較高,F(xiàn)reundlich模型對酸化凹凸棒土等溫吸附過程擬合較好。

    關(guān)鍵詞:沸石粉;蒙脫石;酸化凹凸棒土;凹凸棒土;飼用植酸酶;吸附

    中圖分類號:S816.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

    文章編號:1002-1302(2019)19-0194-06

    收稿日期:2018-08-16

    作者簡介:劉永紅(1992—),女,山東濰坊人,碩士研究生,研究方向?yàn)閼?yīng)用化學(xué)。E-mail:2396551894@qq.com。

    通信作者:孔 晶,博士,教授,主要從事黏土在飼料中的深加工。E-mail:cpukj@163.com。

    沸石粉、蒙脫石、凹凸棒土為常用的天然礦物質(zhì)飼料,最開始作為制粒的黏合劑用于畜牧業(yè),由于其比表面積和陽離子交換能力而對有機(jī)質(zhì)存在較強(qiáng)的吸附作用,后來用作促進(jìn)動(dòng)物生長的飼料添加劑及選擇性吸附劑[1]。植酸酶即肌醇六磷酸水解酶,可以促進(jìn)飼料中植酸水解吸收,從而降低外源性磷的添加,減少養(yǎng)殖業(yè)中磷的排放,降低環(huán)境“磷”污染[2]。飼用植酸酶是植酸酶的常用酶制劑,其原料組成含有黑曲霉或畢赤酵母、葡萄糖等,屬于微量添加劑。黏土與飼用植酸酶均是飼料中常規(guī)的原料,已有的研究多關(guān)注蒙脫石對植酸酶純品的吸附特性[3],凹凸棒土與沸石粉等其他黏土對植酸酶的吸附特性研究鮮有報(bào)道。且飼用植酸酶是復(fù)合制劑,其制劑內(nèi)的其他成分是否影響飼用植酸酶的吸附特性還鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)選擇飼料中常見的4種黏土為吸附載體,通過振蕩吸附試驗(yàn)研究這4種黏土對飼用植酸酶吸附動(dòng)力學(xué)和等溫吸附特性,為探討兩者在飼料中如何高效利用提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    凹凸棒土、蒙脫石和沸石粉,購于江蘇華正礦產(chǎn)品有限公司;飼用植酸酶,購于廣東溢多利生物科技股份有限公司;牛血清蛋白,購于北京索萊寶生物科技有限公司;乙酸鈉、乙酸、植酸鈉、硝酸、鉬酸銨、偏釩酸銨、磷酸、鹽酸、硫酸、考馬斯亮藍(lán)G250、95%乙醇、檸檬酸、磷酸氫二鈉等均為分析純,購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

    UV-2100PC紫外可見分光光度計(jì),購于優(yōu)尼科(上海)儀器有限公司上海丹鼎國際貿(mào)易有限公司;防水型筆試pH/℃測定儀,購于杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司;CH88-1數(shù)顯大功率恒溫磁力攪拌器,購于蘇州國華儀器有限公司;THZ-22臺(tái)式恒溫振蕩器,購于太倉文爾惠金儀器有限公司;高速離心機(jī),購于深圳市億天凈化技術(shù)有限公司;高速分散機(jī),購于上海沐軒實(shí)業(yè)有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 黏土的預(yù)處理

    將沸石粉、蒙脫石和凹凸棒土原土加入一定量去離子水,制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)約20%~25%的混懸液,高速打漿(10 000 r/min,30 min),漿料沉降后,離心(10 000 r/min,15 min),除去粗顆粒物質(zhì),剩余部分置于烘箱中烘干,研磨粉碎,過200目篩,備用。以上操作于2018年4月19—23日在淮陰工學(xué)院實(shí)驗(yàn)室完成。

    酸化凹凸棒土:取上述提純后的凹凸棒土按照固液比 3 g ∶1 mL(純化凹凸棒土與硫酸溶液比)加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的硫酸溶液,于80 ℃下活化2~3 h,漂洗至pH值為4~5,離心,除去上層水溶液,烘干,研磨粉碎,過200目篩,備用。以上操作于2018年4月24—27日在淮陰工學(xué)院實(shí)驗(yàn)室完成。

    1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

    稱取50 mg牛血清蛋白(精確至0.000 1 g)于燒杯中,加入pH值5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液(20.55 g無水乙酸鈉溶解于900 mL去離子水中,用乙酸調(diào)節(jié)pH值至5.5,定容至1 000 mL)溶解,移至50 mL容量瓶中,定容至刻度。取1 mL牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)母液,按照倍比稀釋法稀釋至0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625 mg/mL,各取1 mL,加入4 mL考馬斯亮藍(lán)G250染色劑(100 mg考馬斯亮藍(lán)G250溶解于50 mL 95%乙醇中,加入100 mL 85%磷酸,加去離子水稀釋,定容至1 000 mL),混勻,放置10 min,于 595 nm 處測吸光度[4],不加牛血清蛋白溶液為空白對照。以D595 nm對牛血清蛋白溶液濃度作圖,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以上操作于2018年5月7—8日在淮陰工學(xué)院實(shí)驗(yàn)室完成。

    1.2.3 試驗(yàn)方法

    飼用植酸酶含量測定:稱取1 g飼用植酸酶制劑,加入100 mL pH值5.5乙酸-乙酸鈉緩沖液,攪拌30 min,4 000 r/min離心15 min,取上清液1 mL,按考馬斯亮藍(lán)G250染色法,測上清液中飼用植酸酶蛋白含量。以上操作于2018年5月9日在淮陰工學(xué)院實(shí)驗(yàn)室完成。黏土添加量影響試驗(yàn):分別稱取0.1、0.3、0.5、0.8、1.0 g黏土,加入 30 mL、pH值5.5的飼用植酸酶溶液,恒溫25 ℃、150 r/min振蕩120 min,4 000 r/min離心15 min,取上清液1 mL,按照考馬斯亮藍(lán)G250染色法,測上清液中的飼用植酸酶蛋白含量。以上操作于2018年5月11—18日在淮陰工學(xué)院實(shí)驗(yàn)室完成。

    振蕩速度影響試驗(yàn):室溫下,在30 mL、pH值5.5的飼用植酸酶溶液中,分別加入0.5 g黏土,恒溫25 ℃,振蕩速度取50、100、150、200 r/min,振蕩120 min,4 000 r/min離心 15 min,取上清液1 mL,按考馬斯亮藍(lán)G250染色法,測上清液中飼用植酸酶蛋白含量。以上操作于2018年5月21—24日在淮陰工學(xué)院實(shí)驗(yàn)室完成。

    pH值影響試驗(yàn):稱取0.5 g黏土,加入10 mL飼用植酸酶溶液,用緩沖液調(diào)節(jié)pH值為2、3、4、5、6、7、8,恒溫25 ℃,150 r/min,振蕩120 min,4 000 r/min離心15 min,取上清液 1 mL,按照考馬斯亮藍(lán)法G250染色法,測上清液中飼用植酸酶蛋白含量。以上操作于2018年5月25—31日在淮陰工學(xué)院實(shí)驗(yàn)室完成。

    吸附動(dòng)力學(xué)試驗(yàn):稱取0.5 g黏土,加入30 mL、pH值5.5的飼用植酸酶溶液,恒溫25 ℃,150 r/min,于5、10、20、30、40、50、60、90、120、150 min取樣,4 000 r/min離心15 min,取上清液1 mL,按照考馬斯亮藍(lán)G250染色法,測上清液中飼用植酸酶蛋白含量,繪制吸附動(dòng)力學(xué)曲線。以上操作于2018年6月9—23日在淮陰工學(xué)院實(shí)驗(yàn)室完成。

    等溫吸附試驗(yàn):稱取黏土0.5 g,加入30 mL、pH值5.5的不同濃度的飼用植酸酶溶液,恒溫25 ℃,150 r/min,振蕩 120 min,4 000 r/min離心15 min,取上清液1 mL,按照考馬斯亮藍(lán)G250染色法,測上清液中飼用植酸酶蛋白含量,繪制等溫吸附曲線。以上操作于2018年6月25日至7月13日在淮陰工學(xué)院實(shí)驗(yàn)室完成。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

    如圖1所示,牛血清蛋白溶液與吸光度呈線性關(guān)系,其線性方程為y=5.517 05x+0.076 53,r2=0.999 62。

    2.2 振蕩速度對黏土吸附飼用植酸酶的影響

    由圖2可知,隨著振蕩速度的增加,黏土與飼用植酸酶的接觸更加充分,吸附率隨之增加。在振蕩速度在50 r/min時(shí),蒙脫石、凹凸棒土和酸化凹凸棒土對飼用植酸酶仍有較大的吸附率,其中酸化凹凸棒土對飼用植酸酶的吸附率最大,達(dá)到20%,但沸石粉對飼用植酸酶的吸附率遠(yuǎn)小于其余3種黏土,只有7%。隨著振蕩速度增加,尤其在150 r/min時(shí),4種黏土對植酸酶的吸附率達(dá)到較大水平,沸石粉28%,蒙脫石49%,酸化凹凸棒土54%,凹凸棒土35%。在200 r/min時(shí),蒙脫石與酸化凹土棒土對飼用植酸酶吸附率略有減小。所以,以下試驗(yàn)振蕩速度選擇150 r/min。

    2.3 黏土添加量對飼用植酸酶吸附的影響

    由圖3可知,隨著4種黏土添加量的增加,黏土對飼用植酸酶的吸附率也隨之增大。4種黏土添加量為0.1 g時(shí),黏土對飼用植酸酶的吸附率為:沸石粉0.045%,蒙脫石28%,酸化凹凸棒土12%,凹凸棒土0.77%。當(dāng)4種黏土添加量均增加到0.5 g時(shí),吸附率為:沸石粉20%,蒙脫石53%,酸化凹凸棒土55%,凹凸棒土33%,吸附率快速上升。黏土添加量為1.0 g時(shí),吸附率為:沸石粉25%,蒙脫石55%,酸化凹凸棒土60%,凹凸棒土38%。與黏土添加量0.5 g時(shí)相比,增加黏土添加量對飼用植酸酶的吸附率雖然有所上升,但是曲線斜率逐漸減小,表明吸附速率隨著添加量的增加逐漸減緩,也就是單位質(zhì)量的黏土對飼用植酸酶的吸附量緩慢下降。綜合考慮,黏土的用量均選擇0.5 g。

    2.4 pH值對黏土吸附飼用植酸酶的影響

    由圖4可知,4種黏土對飼用植酸酶的吸附率隨著pH值的增大而減小,pH值為2.0時(shí),黏土對飼用植酸酶的吸附率分別為:沸石粉94%;蒙脫石94%;酸化凹凸棒土89%;凹凸棒土97%。其原因可能是黏土本身帶有負(fù)電荷,飼用植酸酶的等電點(diǎn)(pI)在4.5~4.8,黏土對飼用植酸酶的吸附過程本就是一個(gè)離子交換與物理吸附協(xié)同作用的過程,在pH值﹤5的環(huán)境中,飼用植酸酶帶正電荷,飼用植酸酶以陽離子形式存在,靜電作用可促進(jìn)離子交換過程,增加黏土對飼用植酸酶的吸附。隨著pH值增大,飼用植酸酶所帶的負(fù)電荷增加,與黏土表面的負(fù)電荷產(chǎn)生靜電斥力,離子交換減弱,主要是物理吸附在起作用[3],當(dāng)pH值為8.0時(shí),黏土對飼用植酸酶的吸附率分別下降為:沸石粉65%,蒙脫石34%,酸化凹凸棒土0,凹凸棒土55%。其中吸附過程受影響較大的是酸化凹凸棒土和蒙脫石,pH值對沸石粉和凹凸棒土吸附飼用植酸酶的影響相對較小。

    2.5 黏土對飼用植酸酶的吸附動(dòng)力學(xué)

    2.5.1 準(zhǔn)一級動(dòng)力學(xué)模型

    用ln(Qe-Qt)對t作圖得到直線,利用斜率和截距可以求出K1和理論吸附量[5]。

    ln(Qe-Qt)=lnQe-K1t。

    式中:Qt是t時(shí)刻單位質(zhì)量的吸附劑所吸附的吸附質(zhì)的量,mg/g;K1為一級動(dòng)力學(xué)模型速率常數(shù),min-1;Qe為吸附達(dá)到平衡時(shí)的最大吸附量,mg/g;

    2.5.2 準(zhǔn)二級動(dòng)力學(xué)模型

    用t/Qt對t作圖得到直線,利用斜率和截距可以求出理論吸附量和K2。

    t/Qt=1/(K2Q2e)+t/Qe。

    式中:K2為二級動(dòng)力學(xué)吸附速率常數(shù),min-1。

    由圖5可知,隨著時(shí)間的變化,4種黏土對飼用植酸酶的吸附均在60 min內(nèi)快速吸附,120 min后達(dá)到吸附平衡。

    由圖6、圖7、表1、表2可知,準(zhǔn)二級動(dòng)力學(xué)模型擬合相關(guān)系數(shù)均大于準(zhǔn)一級動(dòng)力學(xué)模型擬合相關(guān)系數(shù),計(jì)算值與試驗(yàn)所測值更接近,表明4種黏土對飼用植酸酶的吸附動(dòng)力學(xué)更符合準(zhǔn)二級動(dòng)力學(xué)模型,可以推測4種黏土對飼用植酸酶的

    2.6 黏土對飼用植酸酶的等溫吸附

    2.6.1 Langmuir吸附模型

    通過Ce/Qe對Ce作圖得到直線,KL和Qm利用線性方程截距和斜率求出[6-7]。

    Qe=(QmKLCe)/(1+KLCe);

    RL=1/(1+KLCe)。

    式中:KL為Langmuir模型常數(shù),L/mg;Qm為理論最大吸附量,mg/g;RL為無量綱分離因子;其他符號含義同前。

    2.6.2 Freundlich吸附模型

    通過lnQe對lnCe作圖得到直線,利用線性方程截距和斜率可以求出KF和1/n。

    Qe=KFCe1/n。

    式中:KF為Freundlich模型常數(shù),可反映吸附容量的大小;n與吸附強(qiáng)度有關(guān),是吸附劑本身的吸附特性,是代表吸附強(qiáng)弱的系數(shù)[8]。其他符號含義同前。

    由圖8、圖9、表3、表4可知,對于沸石粉、蒙脫石、酸化凹凸棒土與凹凸棒土,Langmuir模型能夠較好地描述4種黏土的吸附等溫線,說明這4種黏土吸附劑表面位點(diǎn)是均勻分布的,飼用植酸酶以單層分子的形式吸附在4種黏土表面。此外,對于酸化凹凸棒土,F(xiàn)reundlich擬合相關(guān)系數(shù)更高,r2=0.999 2,表明飼用植酸酶在酸化凹土棒土上的吸附過程中可能存在不同能量的作用力作用。1/n在0到1之間,其大小可以反映吸附質(zhì)濃度對吸附量影響的強(qiáng)弱,1/n越小,吸附性能越好。0﹤1/n﹤0.5,說明酸化凹凸棒土對飼用植酸酶具有很好的吸附性能,吸附過程較容易進(jìn)行[10]。

    4種黏土對飼用植酸酶的吸附均為單分子層的吸附,這也證明4種黏土表面分布著均勻的吸附位點(diǎn)并有著相似的親和力,RL均在0~1之間(表3),吸附過程為優(yōu)惠吸附,利于吸附質(zhì)與吸附劑之間發(fā)生吸附反應(yīng)。

    3 結(jié)論

    沸石粉、蒙脫石以及凹凸棒土等黏土價(jià)格低廉,且具有良好的吸附、潤滑、黏合及膨脹等理化特性,常用作飼料的添加劑、黏合劑[9],還可以解決一部分畜禽營養(yǎng)上的不足以及由于營養(yǎng)缺乏而造成的動(dòng)物免疫力低下及相關(guān)的疾病,從而改善畜禽的生產(chǎn)性能[11]。本試驗(yàn)所使用的植酸酶為飼用植酸酶, 含有黑曲霉或畢赤酵母、葡萄糖等物質(zhì),如果直接稱量飼用植酸酶進(jìn)行試驗(yàn),會(huì)對試驗(yàn)產(chǎn)生干擾,所以本試驗(yàn)使用按照GB/T 18634—2009[CM(17*2]《飼用植酸酶活性的測定 分光光度法》中酶制劑提取方法進(jìn)行提取,得到的飼用植酸酶溶液進(jìn)行吸附研究。

    與蒙脫石、酸化凹凸棒土相比,凹凸棒土和沸石粉對飼用植酸酶的吸附量較小,其原因與黏土礦物的種類有關(guān)。凹凸棒土經(jīng)酸化改性后,黏土粒度減小,比表面積增大,孔道增多,所以對飼用植酸酶的吸附力相比較凹凸棒土得到提高[12];沸石粉較沸石顆粒雖然比表面積增加,但是由于沸石形成條件較為復(fù)雜,孔道較小,吸附速率較慢,對飼用植酸酶的吸附量較低,導(dǎo)致其對飼用植酸酶的吸附量遠(yuǎn)小于蒙脫石等[13];蒙脫石層間距大且?guī)в泻芏嚓栯x子,其晶層對陽離子的吸附力弱,容易與飼用植酸酶發(fā)生離子交換和靜電作用而吸附。蒙脫石對飼用植酸酶的吸附機(jī)制與植酸酶純品一致,但是吸附量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于蒙脫石對植酸酶純品的吸附量[3],究其原因,主要是飼用植酸酶中雜質(zhì)多,即便經(jīng)過提取,仍然存在可溶性的干擾成分,影響吸附作用,且飼用植酸酶濃度較小,在一定體積范圍內(nèi)與黏土的接觸面積小,無法吸附完全。

    試驗(yàn)結(jié)果表明,4種黏土對飼用植酸酶吸附速率很快,在開始吸附的60 min內(nèi),大部分飼用植酸酶都被吸附通過Langmuir和Freundlich模型對等溫吸附過程進(jìn)行擬合,4種黏土對植酸酶的吸附均為單分子層吸附。準(zhǔn)二級動(dòng)力學(xué)模型較好地?cái)M合了4種黏土對飼用植酸酶的動(dòng)力學(xué)吸附試驗(yàn)數(shù)據(jù),4種黏土主要由化學(xué)吸附為主要控制速率。

    在飼料混合過程中,加入飼用植酸酶和黏土后,吸附作用隨即產(chǎn)生。在pH值為2~8時(shí),隨著pH值的增加,黏土對飼用植酸酶的吸附量逐漸減少,當(dāng)混合飼料到達(dá)胃部,環(huán)境pH值在2左右時(shí),4種黏土對飼用植酸酶的吸附均達(dá)到90%以上。建議實(shí)際生產(chǎn)飼用植酸酶時(shí)加入保護(hù)劑,將酶與外界環(huán)境隔開,保護(hù)劑應(yīng)選用容易成膜且在酸性環(huán)境中不易分解的材料,這樣在飼料混合過程中可以避免飼用植酸酶與黏土之間接觸,防止發(fā)生吸附作用,從而保護(hù)酶制劑功效的正常發(fā)揮。

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