BDE-47對小鼠肝腎和腦氧化應激及炎癥反應的影響

莊娟　單群　張子峰　徐建明　鄭元林

摘要：主要探討了持續(xù)性有機環(huán)境污染物2，2′，4，4′-四溴聯苯醚（2，2′，4，4′-tetrabromodiphenyl ether，BDE-47）對小鼠肝腎和腦組織氧化應激及炎癥反應的毒性效應。將C57BL/6J小鼠分為4組，即對照組小鼠灌胃玉米油，低劑量組、中劑量組和高劑量組為對小鼠分別灌胃10、20、40 mg/kg BDE-47，每天處理1次，4、6、8周后稱肝腎和腦組織濕質量并計算臟器系數，測定染毒8周后的小鼠肝腎和腦組織活性氧水平及炎癥因子IL-6和TNF-α的表達情況。結果發(fā)現，BDE-47可造成肝臟臟器系數增大，腎臟和腦臟器系數減小，BDE-47可促進肝腎和腦組織活性氧堆積，炎癥因子IL-6和TNF-α表達增強，這可能是造成這些組織損傷的重要機制。

關鍵詞：BDE-47;肝臟;腎臟;腦;臟器系數;氧化應激;炎癥反應;基因表達

中圖分類號： X174文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）19-0302-05

收稿日期：2018-07-09

基金項目：國家自然科學基金（編號：81171012、81570531、31200873）;江蘇高校品牌專業(yè)建設工程（編號：PPZY2015A018）;江蘇省高校自然科學基金（編號：18KJB330001）。

作者簡介：莊 娟（1977—），女，江蘇南通人，博士，講師，主要從事環(huán)境毒理研究。E-mail：dajiangsky@163.com。

通信作者：鄭元林，博士，教授，主要從事抗衰老的分子生物學機制研究。E-mail：zhengyl@jsnu.edu.cn。

多溴聯苯醚（polybrominated diphenyl ethers，PBDEs）是一類重要的溴代阻燃物，廣泛應用于電子設備、紡織品、塑料及建筑裝潢材料中。PBDEs具有高脂溶性，降解周期長，生物蓄積性強，是一類潛在的持久性有機污染物（persistent organic pollutants，POPs）[1]。因為PBDEs與載體之間以非化學鍵相連，因此在使用和處置過程中，PBDEs會從產品中釋放到環(huán)境介質中[2]，可通過飲食、吸入和皮膚接觸進入機體[3-4]。PBDEs含有209種同源物，其中BDE-47分布最廣，在環(huán)境和人體樣本中都有較高的檢測水平[5-6]。毒理學研究發(fā)現，較其他PBDEs，BDE-47在體內代謝周期長，生物蓄積性更強[7]，因此BDE-47的毒作用及毒性機制受到越來越多的關注。筆者之前的研究發(fā)現，BDE-47可造成肝腎和腦組織損傷[8-10]，但具體的機制尚不清楚。

臟器系數是毒理學試驗評價外源化學物對動物臟器受損的一項常用指標[8，11]，氧化應激和炎癥反應是造成組織損傷的重要機制[12-13]，本試驗采用10、20、40 mg/kg BDE-47對小鼠進行灌胃染毒，探究BDE-47對小鼠肝腎和腦組織臟器系數、氧化狀態(tài)和炎癥反應的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

7周齡C57BL/6J小鼠40只，購于北京維通利華試驗動物技術有限公司。小鼠飼養(yǎng)在溫度為（22±1） ℃、濕度為（50±10）%、12 h光照/12 h黑暗的環(huán)境中，自由進水和食物。

1.2 試劑

BDE-47純度大于99%，購于美國Chem. Service Inc.;活性氧測定試劑盒OxiSelectTM In Vitro ROS/RNS Assay Kit購于美國Cell Biolabs Inc.;Trizol試劑盒購至美國Invitrogen;TaKaRa反轉錄試劑盒和SYBR預混Ex Taq購于寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 方法

BDE-47按相應染毒劑量溶解于玉米油。8周齡C57BL/6J小鼠分為4組，即玉米油對照組、低劑量組（10 mg/kg BDE-47）、中劑量組（20 mg/kg BDE-47）和高劑量組（40 mg/kg BDE-47），小鼠每天按相應劑量灌胃1次，連續(xù)灌胃4、6、8周，小鼠禁食過夜，于次日09：00—10：00間稱體質量，麻醉并頸椎脫臼處死，迅速取出肝腎和腦組織并稱質量，計算臟器系數（臟器系數=臟器質量/空腹體質量×100%，每組統(tǒng)計4～6個樣本）。所有試驗在2015—2016年于江蘇師范大學江蘇省藥用植物生物技術重點實驗室開展。

1.4 活性氧含量檢測

活性氧（ROS）含量的測定方法按試劑盒說明書進行。小鼠在麻醉后冰上取出肝腎和腦組織，加入預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS，pH值7.2），低溫超聲勻漿后于4 ℃下以10 000 g轉速離心10 min，取上清，測定活性氧含量。激發(fā)光波長 484 nm 和發(fā)射波長530 nm測定DCF的數量，根據DCF標準曲線進行樣本ROS定量，表示為1 min 1 μg組織蛋白提取液生成的DCF量（nmol）。

1.5 定量實時聚合酶鏈反應

Trizol試劑盒購提取各組小鼠肝腎和腦組織總RNA，采用紫外分光光度法進行RNA定量。按照TaKaRa反轉錄試劑盒說明，取1 μg RNA為模板用于反轉錄互補DNA。TNF-α引物（5′-3′），CCAGACCCTCACACTCAGATCATC，引物（3′-5′），CCTTGAAGAGAACCTGGGAGTAGAC;IL-6引物（5′-3′），GTCCTTCCTACCCCAATTTCCAA，引物（3′-5′），GAATGTCCACAAACTGATATGCTTAGG。GAPDH為內參，均由生工生物（上海）股份有限公司合成。使用TaKaRa SYBR預混Ex Taq進行熒光定量實時PCR，每個樣本設3個平行，檢測mRNA含量。

1.6 統(tǒng)計方法

采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進行數據統(tǒng)計，試驗數據采用One-Way ANOVA進行單因素方差分析，Tukeys顯著性分析，其中P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 BDE-47對C57BL/6小鼠體質量及一般狀況的影響

試驗期間各組動物飲食、飲水等狀況未見明顯異常，動物無死亡。染毒4周，高劑量組小鼠活動性變差，皮毛凌亂，毛發(fā)無光澤;染毒6周，中劑量組小鼠皮毛光澤度變差。處理4、6、8周后對小鼠禁食后稱質量，結果（表1）表明，BDE-47暴露對小鼠體質量無顯著影響。

2.2 BDE-47對小鼠肝腎和腦組織質量的影響

處理4、6、8周后對小鼠進行解剖，各組小鼠腎臟和腦組織外觀正常。染毒8周，高劑量組有3只小鼠肝臟表面可見灰白色斑點。隨著BDE-47染毒劑量增大和染毒時間延長，解剖可見小鼠肝臟變大，雙腎或單腎變小，腦組織變小。

2.2.1 肝臟濕質量及臟器系數

各組小鼠平均肝臟濕質量和臟器系數見表2和表3。染毒4周，與對照組相比，高劑量 BDE-47造成肝臟濕質量和臟器系數顯著增加;染毒6周，與對照組相比，中劑量組、高劑量組小鼠肝臟質量和臟器系數分別在0.05、0.01水平上顯著提高;隨著染毒時間延長，肝臟增大現象更為嚴重，即染毒8周，中劑量組、高劑量組分別在0.01、0.001水平上顯著提高。

2.2.2 腎臟濕質量及臟器系數

各組小鼠腎臟濕質量和臟器系數見表4和表5。染毒4周，BDE-47中劑量組小鼠雙腎組織濕質量降低，高劑量組小鼠雙腎組織濕質量增加，但與對照組相比差異均不顯著;染毒8周，與對照組相比，BDE-

47高劑量組小鼠雙腎組織濕質量和臟器系數分別在0.01、0.05水平上顯著降低。

2.2.3 腦濕質量及腦臟器系數

表6顯示，染毒4周，各組小鼠平均腦濕質量無顯著差異。隨著染毒時間延長和染毒劑量增加，小鼠腦平均濕質量降低。其中，與對照組相比，染毒6周的高劑量組小鼠腦濕質量在0.01水平上顯著降低;染毒8[CM（25*8]周，中劑量組、高劑量組分別在0.05、0.001水平上顯著降低。進一步統(tǒng)計腦臟器系數，其結果見表7。染毒6周，造成小鼠腦臟器系數下降，但與對照組相比差異不顯著。染毒8周，與對照組相比，中劑量組、高劑量組小鼠腦臟器系數分別在0.05、0.01水平上顯著降低。

2.3 BDE-47對小鼠肝腎和腦組織活性氧含量的影響

染毒8周后，檢測各組小鼠肝臟、腎臟和腦組織活性氧（ROS）含量，結果見圖1。與對照組相比，低劑量BDE-47對小鼠肝腎和腦組織ROS含量影響不顯著;中劑量組小鼠肝臟和腦組織ROS顯著堆積（P<0.001）;高劑量組小鼠肝腎和腦組織ROS含量顯著增加（P<0.001）。

2.3 BDE-47對小鼠肝腎和腦組織IL-6和TNF-α基因表達的影響

染毒8周后，檢測各組小鼠肝腎和腦組織進行IL-6和TNF-α基因表達情況，結果見圖2。與對照組相比，低劑量BDE-47對小鼠肝腎和腦組織IL-6和TNF-α基因表達影響不顯著。隨著BDE-47暴露劑量增加，與對照組相比，IL-6和TNF-α基因在肝臟組織（中劑量組、高劑量組在 0.01 水平）、腎臟組織（高劑量組在0.001水平）和腦組織（IL-6，中劑量組、高劑量組在0.05、0.01水平;TNF-α，低劑量組、高劑量組在0.01）中表達顯著增加。

3 討論與結論

早期研究者使用 14C標記的方式檢測了BDE-47灌胃后在小鼠和大鼠機體內的分布情況。結果顯示，BDE-47主要分布于脂肪組織，其次是肝腎等組織。此外，BDE-47可以通過血腦屏障分布至腦[14-15]。經檢測，浙江電子垃圾拆解區(qū)癌癥患者肝腎組織中含有較高的BDE-47[16]。該地區(qū)居民腎損傷分子β2微球蛋白含量和BDE-47呈正相關[17]。此外，尸檢腦樣本中可檢測出7種PBDEs，其中BDE-47含量最高[18]。這些試驗結果說明BDE-47可影響肝腎和腦組織。

本試驗結果表明，BDE-47可影響肝腎和腦組織。臟器系數常被用來評價外源化學物對動物臟器的損害[8]。慢性BDE-47暴露可造成小鼠肝臟質量增加，臟器系數增加;腎臟和腦組織質量減少，臟器系數減小。筆者之前的試驗發(fā)現，8周齡ICR小鼠接受150 mg/kg BDE-47處理12周后出現肝臟氧化損傷，肝臟臟器系數增加[19]。與本試驗結果相比，染毒劑量大，說明C57BL/6小鼠的肝臟對BDE-47影響的敏感性較強。目前還沒有文獻報道BDE-47對腎臟臟器系數的影響。筆者發(fā)現，40 mg/kg BDE-47處理8周后可引起小鼠雙腎濕質量和臟器系數下降;但與肝臟相比，引起腎臟濕質量變化的BDE-47劑量大，作用時間長;此外，BDE-47導致腦組織濕質量減輕的有效劑量為20 mg/kg，且須處理8周，說明不同組織對BDE-47反應存在差異。

雖然BDE-47的毒性機理尚不清楚，氧化應激被認為是BDE-47引起組織損傷的一個重要原因[20]。氧化應激與細胞內ROS含量升高有關。Reistad等首次報道了BDE-47會引起人中性粒細胞ROS含量升高[21]。ROS是細胞有氧代謝的副產物，當ROS含量水平超過細胞抗氧化能力時就會對細胞產生毒害，造成細胞內DNA、蛋白質和膜脂損傷。本研究進一步的檢測結果顯示，BDE-47可造成肝腎和腦組織ROS堆積，肝臟和腦組織對BDE-47誘導的氧化壓力較腎臟組織敏感。筆者之前發(fā)現，150 mg/kg BDE-47處理12周可造成ICR小鼠肝臟氧化損傷[8]。而本試驗誘導肝臟氧化應激所需的BDE-47劑量小、時間短，該結果與BDE-47對小鼠臟器系數的影響一致，進一步說明了C57BL/6J小鼠肝臟對BDE-47具有較強的敏感性。之前的文獻報道，小鼠出生后第10天接受10 mg/kg BDE-47灌胃處理后，腦組織會出現氧化應激[20]。代謝動力學的證據表明，乳鼠BDE-47的代謝能力較成年鼠差，并且發(fā)育中的腦組織對外源化學物的敏感性較強[7]。因此，本研究中引起腦組織氧化應激的BDE-47有效劑量相對較高，為20 mg/kg。

炎癥反應在外源化學物造成組織損傷中扮演重要角色[22]，當氧化壓力增強時會引發(fā)炎癥反應[23]。體外試驗證明，BDE-47可誘導人早孕絨毛外滋養(yǎng)細胞HTR-8/SVneo炎癥因子IL-6釋放[24]，但關于BDE-47誘導機體炎癥反應的研究較少。筆者之前用150 mg/kg BDE-47慢性處理ICR小鼠發(fā)現，可促進小鼠肝臟炎癥因子表達，導致肝臟炎癥損傷[19]。本試驗結果與此一致，證明BDE-47可誘導小鼠肝臟組織炎癥反應，但較ICR小鼠，C57BL/6J品系小鼠肝臟對BDE-47的炎癥反應更為敏感。此外筆者還發(fā)現，BDE-47可引發(fā)腎臟和腦組織IL-6和TNF-α基因表達增強。相對于肝臟和腦組織，引發(fā)腎臟炎癥反應的BDE-47有效劑量較高。

本試驗以C57BL/6J小鼠為對象，評價了慢性BDE-47暴露對肝腎和腦組織臟器系數的影響，初步揭示了BDE-47對這些組織的毒性作用。BDE-47可能通過引發(fā)氧化應激，誘導炎癥反應，毒害肝腎和腦組織，具體的毒作用機制有待進一步深入研究。

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