炭角菌分子鑒定及培養(yǎng)基配方優(yōu)化

聞紹鋒 曹 瑤 劉舒暢 周忠發(fā) 楊林雷 李榮春

（云南農(nóng)業(yè)大學食用菌研究所，云南 昆明 650201）

炭角菌（Xylaria）隸屬子囊菌亞綱、炭角目、炭角菌科、炭角菌屬[1,2]。炭角菌屬是子囊菌門和炭角菌科（Xylariaceae）中最早被描述的屬[3]，是白蟻“廢棄”菌圃上的一類優(yōu)勢真菌[4]。

真菌學家對炭角菌的研究可以追溯到19世紀至20世紀初期[5]，Hennings 1908年在菲律賓報道有21個炭角菌的種[6]，鄧叔群（1963）在《中國的真菌》中共描述了52個種[8]，Schumacher 1982年在泰國報道有10個炭角菌的種[7]。20世紀80年代，朱宇敏開始采集、純化、鑒定，描述許多炭角類的真菌，為真菌類群的研究奠定堅實的基礎[9]。炭角菌分布于溫帶、熱帶和亞熱帶地區(qū)，是一種中溫偏高溫型真菌[10,11]。1789年至今，全世界共發(fā)現(xiàn)300多種炭角屬真菌，種類繁多、分布廣泛，在我國分布于浙江、江西、福建、云南等地[12]。

炭角菌是藥食同源的兩用菌，其菌核幼嫩時可食用，成熟后是名貴中藥[13～15]，具有增強機體免疫力、抗衰老、抗氧化、抗腫瘤、延長壽命等功效[16～18]，生物活性高而無副作用，越來越受到人們的青睞[19]。因而實現(xiàn)其人工栽培具有重要的現(xiàn)實意義。篩選其栽培培養(yǎng)料適宜的碳、氮源及配方的結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

菌株由采集自云南昆明金源地區(qū)的野生子實體經(jīng)組織分離獲得。

1.2 培養(yǎng)基

（1）母種培養(yǎng)基（改良PDA培養(yǎng)基）：馬鈴薯200 g、水1 L，葡萄糖20 g、蛋白胨2.5 g、磷酸二氫鉀3 g、硫酸鎂1.5 g，滅菌條件為121℃、0.103 MPa、30 min[12]。

（2）液體純培養(yǎng)基的制備。液體培養(yǎng)基為不加瓊脂的PDA培養(yǎng)基，制備方法及滅菌同上。待錐形瓶中的培養(yǎng)基冷卻至常溫后接種，接種后放入搖床于120 r/min、25℃下培養(yǎng)5天。

（3）炭角菌菌種的分離、純化。清除采集的野生炭角菌子實體表面雜質(zhì)，用流水沖洗2～3次，沖洗時不損傷內(nèi)部組織。用解剖刀去除子實體兩端，再用鑷子挑取未與空氣接觸或者接觸較少的子實體內(nèi)部組織，放入培養(yǎng)基中進行純培養(yǎng)，得到較純的菌絲體，4℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

（4）ITS鑒定[20]。從液體純培養(yǎng)中，收集菌絲球用于DNA提取。DNA提取方法及步驟參照真菌DNA提取試劑盒（Bio Take Corporation）說明書。將清晰目的條帶的PCR產(chǎn)物送到生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將測序序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對分析（https：//blast.ncbi.nih.gov/Blast.cgi），鑒定物種。

（5）碳源篩選比較試驗。以綜合PDA培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，添加蛋白胨為氮源，以未添加碳源培養(yǎng)基為對照（CK）：馬鈴薯200 g、蛋白胨2.5 g、瓊脂20 g、KH2PO43 g、MgSO41.5 g，定容至1 000 mL，pH自然。設添加葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、果糖、糊精、淀粉、甘露醇等9種不同碳源，各添加20 g，培養(yǎng)基于121℃、0.103 MPa下滅菌30 min，倒入平板備用。

在無菌條件下接種，每處理重復5次，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)。記錄菌絲萌發(fā)時間并觀察生長情況，從菌絲萌發(fā)、沿四周生長開始，每天從四個方向標記一次菌絲生長位置。以第一個菌絲長滿平板培養(yǎng)基為截止標記時間，計算菌絲生長速率，并記錄菌絲形態(tài)及長勢。使用SPSS20.0、Excel處理數(shù)據(jù)。

菌絲平均速率（mm/d）=所測得菌落半徑 /菌絲生長天數(shù)。

（6）氮源篩選比較試驗。以綜合PDA為基礎培養(yǎng)基，添加葡萄糖作為碳源，以無氮源培養(yǎng)基為對照（CK）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、KH2PO43 g、MgSO41.5 g、水1 000 mL，pH自然。以分別添加蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、硫酸銨、酒石酸銨、硝酸鈉、尿素等7種不同氮源（各添加2.5 g）為試驗配方，試驗方法同上。

（7）栽培料配方篩選試驗。炭角菌栽培培養(yǎng)基設6個配方，輔料相同，均為糖1%、石膏1%；主料分別為：配方①雜木屑49%、土49%；配方②雜木屑39%、土59%；配方③雜木屑32.4%、土65.6%；配方④雜木屑24.5%、土73.5%；配方⑤雜木屑19.6%、土78.4%；配方⑥雜木屑14%、土84%。含水量均為65%，pH 6.5。

將基料分別按比例混勻，再加入水，使各配方的含水量都在65%左右（常用測水分方法是用手捏基料，以手指間有水跡但不流出為適）。將配制好的基料裝入規(guī)格為8×11（cm）的栽培瓶內(nèi)，裝料高約5 cm，松緊適宜，并用電子天平稱量，確保每瓶培養(yǎng)料重約100 g。每配方10個重復。裝料后于121℃、0.103 MPa下滅菌2 h。

接種后的培養(yǎng)瓶置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，每天觀察、測量、記錄菌絲的生長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS分子試驗比較結(jié)果

將試驗菌株的測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行比對分析顯示，該菌株的ITS序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中痂炭角菌的基因同源性為99%。利用真菌通用引物ITS4和ITS5進行PCR擴增，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，該菌株的片段大小約為580 bp（圖1）。

圖1 ITS基因PCR擴增與炭角菌菌絲體

2.2 炭角菌的生物學特性

（1）不同碳源對炭角菌菌絲生長的影響。試驗炭角菌菌株在10組不同碳源培養(yǎng)基中均能生長，但生長速率及長勢存在差異（表1）。從菌絲生長速率看，以可溶性淀粉組的菌絲長速較快，其次是乳糖組。綜合菌絲長勢，試驗菌株適宜的碳源優(yōu)劣依次為可溶性淀粉、乳糖、蔗糖、糊精、葡萄糖、麥芽糖、半乳糖、果糖、甘露醇。

（2）不同氮源對炭角菌菌絲生長的影響。炭角菌菌絲在8組不同氮源培養(yǎng)基中均能生長，但生長速率及長勢存在差異（表2）。綜合菌絲生長速率和生長勢來看，以蛋白胨培養(yǎng)基表現(xiàn)較佳，菌絲生長快，長勢粗壯、濃密，氣生菌絲發(fā)達，其他處理菌絲長勢較差，表現(xiàn)為稀疏、纖細。其次為酵母膏。炭角菌對酒石酸銨、尿素的吸收較差，不適于菌絲培養(yǎng)。此外，未添加氮源的處理也不利于菌絲生長。

表1 不同碳源炭角菌菌絲生長發(fā)育情況

表2 不同氮源炭角菌菌絲生長發(fā)育情況

（3）不同栽培料配方對炭角菌菌絲生長的影響。試驗結(jié)果（表3）表明，炭角菌在配方⑥中菌絲生長速率快，6天即長滿栽培瓶，菌絲濃密粗壯，表現(xiàn)佳，其次為配方④和配方③，均7天滿袋。

表3 不同栽培料配方的炭角菌菌絲生長情況

3 結(jié)論與討論

本試驗對炭角菌的子實體進行分離、純化培養(yǎng)及生物學特性研究，篩選最佳碳、氮源。結(jié)果為，炭角菌菌株適宜的最佳碳源為可溶性淀粉，最佳氮源為蛋白胨。試驗得出適宜的栽培料配方為配方⑥：雜木屑14%、腐殖土84%、糖1%、石膏1%，含水量65%，pH 6.5。

在生產(chǎn)上栽培炭角菌，建議選擇有機氮源與無機氮源相結(jié)合，以使氮源的利用率達到最大化。查閱文獻發(fā)現(xiàn)，對炭角菌的最佳碳、氮源的研究結(jié)論各不相同。如朱志熊研究顯示炭角菌的最佳碳源為葡萄糖[8]；馬橙研究黑柄炭角菌的最佳碳源為葡萄糖和果糖[1]。原因可能與供試菌株不同有關。

本次試驗還發(fā)現(xiàn)，炭角菌菌絲生長速率快，1天就可以長滿平板，但是菌絲稀疏、不粗壯，隨著培養(yǎng)時間的增加，菌絲逐漸變粗壯，氣生菌絲變發(fā)達。因此，在使用母種時，不僅要選擇適宜的碳氮源，而且要注意培養(yǎng)時間。