植物頂端有限生長相關(guān)基因與基因編輯育種研究進展

郭品品 任鋼 李重 曾少華 德塔娜 王瑛

摘 ?要??隨著勞動力成本的增加，農(nóng)作物的采收將逐步從人工采收過渡到機械采收，因此培育緊湊、矮化、果實成熟集中、耐密植、適宜機械化操作的新品種已成為作物遺傳改良的主要目標。本文重點綜述了不同物種FT及其同源基因?qū)χ参锍苫ǖ恼{(diào)控功能，植株頂端的無限生長和有限生長的控制基因及其功能研究進展，以及通過基因編輯促進頂端成花進而導致植株頂端由無限營養(yǎng)生長轉(zhuǎn)變?yōu)橛邢奚成L，進一步介紹了通過多基因同時編輯的方法推動植物株型改變并培育新品種的成功案例。植株頂端成花和有限生長的特性可以促進果實的統(tǒng)一成熟，為適宜機械化采收的株型育種提供理論支持和實踐指導。

關(guān)鍵詞 ?株型;開花;有限生長;基因編輯中圖分類號??Q943.2??????文獻標識碼??A

Progress of Determinate Growth Genes and Gene Editing Breeding

GUO Pinpin¹，?REN Gang²，?LI Zhong³，?ZENG Shaohua¹，?DE Tana²， WANG Ying^1*

1. South China Botanical Garden， Chinese Academy of Sciences / Key Laboratory of South China Agricultural Plant Molecular Analysis and Genetic Improvement， Chinese Academy of Sciences / Guangdong Provincial Key Laboratory of Applied Botany， Guangzhou， Guangdong 510650， China; 2. Haixi Institute of Agricultural Science， Delingha， Qinghai 817000， China; 3. Bryel Goji Stock Co.， Ltd.， Yinchuan， Ningxia 750200， China

Abstract ?With the increase of labor cost， there will be a gradually transition for the harvesting of fruits and vegetables from manual harvesting to mechanical harvesting. Therefore， developing new compact and mechanical harvest plant varieties with synchronized ripening period has become the main target of genetic improvement. This review summarized the flower development related genes， especiallyFTand homologous genes controlling the indeterminate and determinate growth at the top of the main stem of plants， and the successful breeding model of promoting the apical flower formation using the CRISPR/CAS9 gene editing system， which leads to the transformation of the top of the main stem into flower development and stops continuing to grow. In addition， gene editing of multiple genes relating to plant apical structure and fruit characters were successfully used for new cultivar development. Apical flower and determinate growth can promote the synchronized fruit ripening and faciliate mechanical harvest， which would provide a theoretical and practical guidance for the future breeding alternating plant structure or plant type.

Keywords ?plant type; flowering time; determinate growth; gene editing

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.10.014

植物株型就是植株的形狀，即植株個體在空間的幾何分布狀態(tài)。植株的主干頂端的特征直接決定植株的高度和產(chǎn)量，以及植株整體的果實成熟一致性。植株的株型研究多年來一直是作物生理、栽培和育種等學科研究的熱點。不同物種的植株株型及其生長發(fā)育特征直接跟產(chǎn)量、品質(zhì)、栽培管理成本等密切相關(guān)。目前中國勞動力供求格局發(fā)生了質(zhì)的變化，農(nóng)村的農(nóng)業(yè)勞動力數(shù)量短缺和勞動力質(zhì)量下降現(xiàn)象非常嚴重，我國的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)正在經(jīng)歷著從勞動密集型到工業(yè)化和機械化農(nóng)業(yè)的轉(zhuǎn)變。因此，隨著勞動力成本的增加，培育株型緊湊、矮化、成熟集中、耐密植、適宜機械化的新品種已成為遺傳改良的主攻目標，本文綜述了花發(fā)育的基因功能，植株頂端的無限生長和有限生長的控制基因及其功能研究進展，以及通過基因編輯促進頂端成花進而導致植株頂端轉(zhuǎn)變?yōu)橛邢奚L的成功育種模式，進一步探討了通過基因編輯的方法推動植物株型改變并培育新品種的新進展。

1 ?株型育種理論

農(nóng)作物的株型一般分為葉型、莖型、穗型和根型。其中葉型和莖型明顯地影響植株的冠層大小、分布、田間群體結(jié)構(gòu)狀況和小氣候，研究它對提高光能利用率和作物產(chǎn)量、降低栽培用工量，發(fā)展工業(yè)化農(nóng)業(yè)，促進農(nóng)業(yè)機械化、自動化和信息化有著重要意義。植株主莖頂端的發(fā)育對于莖型的改變、植株高度、植株密度、生長發(fā)育周期及產(chǎn)量具有重要的影響。

1968年，澳大利亞科學家Donald提出作物的理想株型，是指每單位生產(chǎn)的干物質(zhì)要對資源的需求降到最低，并指出小麥的理想株型主要包括短而強壯的莖稈，葉片直立狀、穗大、花多等指標，以及高密度栽培下的產(chǎn)量問題^[1]。之后關(guān)于水稻、玉米、大麥、黃豆、番茄、月季等植物的株型育種研究陸續(xù)開展起來^[2]。

2 ?植物成花誘導基因的研究進展

成花素“florigen”（flower-former）于1936年提出，被定義為一種具有刺激成花功能的物質(zhì)^[3]，FT（FLOWERING LOCUS T）是擬南芥中編碼成花素的候選基因，和分生組織基因LFY（LEAFY）一起，在接收到光受體傳給轉(zhuǎn)錄因子CO（CONSTANS）的信號后，促進植物開花，但FT拮抗TFL1（TERMINAL FLOWER1）^[4]。

FT在促進擬南芥開花時，與一個bZIP轉(zhuǎn)錄因子FD（FLOWERING LOCUS D）協(xié)同作用，FD在成花誘導之前就已經(jīng)在莖尖處表達^[5]，而FT mRNA在葉片中表達，F(xiàn)D蛋白整合時間和空間上的信息后，和FT蛋白形成復合體反過來激活花形成基因，如AP1（APETALA1）^[6]。嫁接實驗表明，FT在葉片中轉(zhuǎn)錄后，不需要其他媒介物便可以從韌皮部移動至莖尖端，進行長距離運輸^[7]，F(xiàn)T蛋白便可作為這種可移動的信號物質(zhì)^[8]。

FT作為開花整合因子，需整合光周期途徑、自主途徑、赤霉素途徑、年齡途徑、溫敏途徑、春化途徑等至少6條途徑，調(diào)控植物開花^[9]。從晚花擬南芥中分離出來的FLF（FLOWERING LOCUS F），編碼1個MADS-box蛋白，經(jīng)過圖位克隆和分析，認為和FLC（FLOWERING LOCUS C）是同1個基因^[10]。春化作用下促進擬南芥晚花生態(tài)型和晚花突變體開花，是通過降低FLC表達水平實現(xiàn)的^[11]，由此可以看出，在開花調(diào)控途徑中，FT位于FLC下游。FT不僅能夠促進植物開花，還可以促進種子萌發(fā)，而且具有母體遺傳效應^[12]。不同于開花，FT調(diào)控種子休眠時，是位于FLC的上游，抑制FLC表達;ChIP實驗表明FT結(jié)合在FLC的下游區(qū)域，即COOLAIR轉(zhuǎn)錄起始位點附近^[13]。也有研究表明，FT抑制FLC表達是通過FLC上游啟動子區(qū)域進行的^[14]。

水稻中FT的同源基因是Hd3a（Heading date 3a），由葉片向頂端分生組織中運輸，并誘導水稻開花，Hd3a蛋白很有可能就是水稻成花素^[15]。Hd3a蛋白可以和GF14c（G-box factor 14-3-3c）蛋白互作，GF14c是水稻開花的負調(diào)節(jié)蛋白^[16]。在水稻莖尖頂端細胞中，Hd3a蛋白和GF14c蛋白形成復合體遷移至細胞核內(nèi)，結(jié)合水稻中FD的同源轉(zhuǎn)錄因子OsFD1，組成三元成花素激活復合體FAC（FLORIGEN ACTIVATION COMPLEX），激活水稻中AP1的同源基因OsMADS15轉(zhuǎn)錄，進而促進水稻開花^[17]。

番茄中FT的同源基因是SFT（SINGLE FLOWER TRUSS），sft突變體屬于晚開花表型：初級分生組織形成的第1個花序是在植株長出15～20片葉子后，相比于野生型的8～12片葉子;此外，sft突變體相比于野生型番茄，在合軸分生組織處變成了營養(yǎng)型花序：葉片增多，花朵減少，且每個花朵中有1片花萼增大^[18]。

甜菜中FT的同源基因BvFT1（Betta vulgaris FLOWERING LOCUS T）抑制開花，同時它的下調(diào)對于春花作用的響應也至關(guān)重要，而BvFT2具有保守的FT功能，促進甜菜開花^[19]。

3 ?植株頂端分生組織的有限生長和無限生長控制基因研究進展

植株頂端的分生組織有營養(yǎng)生長和生殖生長2種狀態(tài)。植株主莖頂端營養(yǎng)生長可以使植株持續(xù)長高，為無限生長類型;其轉(zhuǎn)變?yōu)樯成L與頂端的花分化密切相關(guān)，進而形成有限生長的植株。

野生型擬南芥花朵在頂端分生組織處依次螺旋生長，稱之為無限生長（indeterminate growth），突變體terminal flower在長出一些正常帶花梗的花之后，頂端分生組織中發(fā)育出部分缺少花梗的花朵而使花序停止生長，表現(xiàn)為有限生長（determinate growth）^[20]。同樣，金魚草在成花誘導幾天后，CENTRORADIALIS（CEN）在花序頂端表達，使得花序以一朵花的形式停止生長，也表現(xiàn)為有限生長^[21]。HvCEN（Hordeum vulgare CENTROR ADIALIS）是大麥中CEN的同源基因，它是對遺傳變異的選擇和富集，而不是馴化獲得的突變^[22]。

TERMINAL FLOWER1（TFL1）是金魚草中CEN的同源基因，不同的是TFL1也在營養(yǎng)生長階段表達，并推遲了向花序發(fā)育的轉(zhuǎn)變，進而推遲了花序分生組織的形成^[23]。水稻中TFL1/CEN-like基因在調(diào)控居間分生組織活動中也發(fā)揮著重要作用^[24]。此外，TFL1蛋白像FT蛋白一樣，也是作為一種移動的信號物質(zhì)在分生組織間傳遞，但是TFL1蛋白并不進入到分生組織周圍的細胞內(nèi)，進而不會對原基分化產(chǎn)生影響^[25]。

月季和草莓中TFL1的同源基因，在持續(xù)開花型CF（continuous flowering）和僅開1次花型OF（once flowering）中，不同的反轉(zhuǎn)座子插入，改變它們的開花季節(jié)^[26]。葡萄中TFL1的同源基因，使葡萄呈現(xiàn)簇狀變異^[27]。

SELF-PRUNING（SP）是番茄中CEN和TFL1的同源基因，調(diào)控合軸分生組織從營養(yǎng)生長階段到生殖生長階段的轉(zhuǎn)變;含有隱性純合SP基因植株中，合軸單元間的葉片數(shù)連續(xù)減少，并以最終形成的2個連續(xù)花序，使得植株頂端停止生長，即有限生長。SP基因型的番茄中主干封頂?shù)牧曅栽趥?cè)枝中一樣出現(xiàn)，使得每個枝條生長被壓縮，株型緊湊，坐果期一致;隨著隱性SP滲入到番茄栽培種中，這種封頂生長習CENTRORADIALIS性促進了番茄的機械化采收^[28]。

CEN、TFL1和SP等基因，在不同物種中具有保守地改變植物株型的重要作用，歸類為CETS基因，編碼一類和14-3-3家族相似功能的蛋白^[29]，屬于磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白基因家族（phospha tidylethanolamine-binding protein，PEBP），具有保守的PBP（PF01161）結(jié)構(gòu)域。擬南芥中PEBP家族基因主要包括FT、TFL1、TSF（TWIN SISTER of FT）、MFT（MOTHER of FT and TFL1）、BFT（BROTHER of FT and TFL1）、ATC（Ara bidopsis thaliana CENTRORADIALIS homologue）6個成員。

4??植物頂端生長性狀的基因編輯育種進展

封頂（determinacy）是大豆馴化的重要農(nóng)藝性狀之一，有限生長型（determinate genotype）dt1/dt1和無限生長型（indeterminate genotype）Dt1/Dt1雜交后代中出現(xiàn)單基因分離模式^[30]。從大豆基因組中分離出2個同源基因GmTFL1a（Glycine max TFL1a）和GmTFL1b（Glycine max TFL1b），GmTFL1b是Dt1的候選基因，通過基因沉默改變1個氨基酸可以獲得封頂?shù)挠邢奚L的大豆^[31]。

番茄中純合基因型SP背景下，sft突變后，植株開花推遲，長出的花朵和果實減少，但雜合狀態(tài)的sft番茄植株產(chǎn)量卻增加60%，說明sft具有雜種優(yōu)勢效應^[32]。雜合狀態(tài)的sft在延遲番茄主干和側(cè)枝開花方面具有半顯性作用，通過對頂端分生組織的轉(zhuǎn)錄組測序，說明成花素途徑中SFT轉(zhuǎn)錄本水平對于產(chǎn)量的增加具有劑量效應^[33]。誘導成花素途徑中基因突變，便可改變植株產(chǎn)量;SUPPRESSOR of SP（SSP）可以使SP突變體恢復無限生長，ssp-1906突變體和野生型一樣，每一個合軸分生組織間3片葉子，但是ssp-2129和ssp-610突變體每個合軸分生組織是2片葉子，相比于野生型，花序密度更高^[34]。此外，SP5G（SELF-PRUNING 5G）促進長日照條件下番茄果實的早熟和高產(chǎn)^[35]。2018年，許操和高彩霞團隊合作，以野生醋栗番茄為基礎(chǔ)材料，利用含有多個基因的CRISPR/CAS9載體系統(tǒng)，基因編輯同時精準靶向開花光周期敏感性、頂端封頂和果實同步成熟控制基因SP和SP5G、果實大小控制基因SlCLV3和SlWUS和維生素C合成酶基因SlGGP1，將產(chǎn)量和品質(zhì)性狀精準地導入野生番茄，加速了野生植物的人工馴化，成功將醋栗番茄無限生長型的株型變成了“雙有限”生長型的緊湊株型，提高了坐果率、果實成熟的同步性和收獲指數(shù)^[36]。該研究首次通過多基因多靶點的同時基因編輯實現(xiàn)野生植物的快速馴化，為新品種的精準設(shè)計和創(chuàng)造全新作物提供了新的策略，開啟了多基因同時編輯的育種時代。

多年生木本植物獼猴桃（Actinidia）染色體基數(shù)為29，倍性變化大，且植株本身具有攀爬習性。新西蘭的研究團隊通過對獼猴桃中CEN（CENTRORADIALIS）-like基因AcCEN4和AcCEN進行基因編輯，產(chǎn)生的雙等位基因變異，呈現(xiàn)早花表型、頂端有限生長和植株緊湊生長習性，最重要的是，這種編輯成功做到了把多年生木本植物的生活周期一年內(nèi)便可完成，極速加快了育種進程^[37]。

不同于擬南芥的單軸分枝、番茄的合軸分枝，棉花葉枝單軸分枝而結(jié)果枝合軸分枝，并且結(jié)果枝對于棉花株型和產(chǎn)量有重要影響。研究發(fā)現(xiàn)控制海島棉腋生花基因GbAF（Gossypium barbadense axillary flowering）和陸地棉簇生花基因cl1（Gossypium hirsutum clustered boll）是Cl1位點的等位基因，更是番茄中SP同源基因，通過基因編輯突變四倍體棉花A或D亞基因組中任何一個GoSP基因，產(chǎn)生簇生花，同時基因編輯突變這2個GoSPs，結(jié)果枝表現(xiàn)為有限生長，這樣的緊湊株型使得棉花可以高密度種植，不僅能夠增加產(chǎn)量，而且利于棉花的機械化采收^[38]。此外，GhSP（Gossypium hirsutum SELF-PRUNING）維持陸地棉中各頂端的生長狀態(tài)，基因編輯能夠突變GhSP，使單軸分枝和合軸分枝的無限生長變?yōu)橛邢奚L，推動了陸地棉的基因編輯育種的發(fā)展^[39]。

此外，通過基因編輯技術(shù)，靶向編輯茄科的孤生作物菇娘果中的SP和SP5G同源基因，使得無限生長的蔓生植株呈現(xiàn)封頂表型，該研究發(fā)現(xiàn)基因編輯技術(shù)對于這種遺傳背景尚不清晰的植物的育種改良，同樣能夠達到預期的效果，可以推動小作物的快速育種^[40]。

5 ?總結(jié)與展望

隨著基因組編輯技術(shù)的發(fā)展，作物育種在發(fā)生革命性的變化^[41]。通過優(yōu)化CRISPR/Cas9系統(tǒng)，使得基因編輯在模式和非模式物種中都得到了廣泛而深入的應用，F(xiàn)eng等^[42]將dmc1啟動子驅(qū)動Csa9蛋白表達實現(xiàn)了對玉米基因組的高效編輯;Liu等通過優(yōu)化sgRNA表達框?qū)崿F(xiàn)了對浮萍的有效編輯^[43];Liu等通過在表達框中添加了PF框（PAP1促進花青素的積累，F(xiàn)T促進花期提前）實現(xiàn)了可視化選擇陽性植株，獲得的紫色葉片且花期提前的植株轉(zhuǎn)基因事件發(fā)生的概率為100%，極大地提高穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)換后期篩選工作效率^[44];Wang等開發(fā)了PTG/Cas9基因編輯系統(tǒng)，PTG/Cas9的編輯效率是CRISPR/Cas9的32倍以上，并在獼猴桃中實現(xiàn)了定向編輯^[45]。運用多元CRISPR/Cas9系統(tǒng)對野生番茄中位于基因編碼區(qū)、順式調(diào)控區(qū)、開放閱讀框上游序列等實現(xiàn)靶向基因編輯，成功編輯株型、花朵、產(chǎn)量相關(guān)基因，從而加速馴化和育種改良進程^[36]。此外，基因編輯技術(shù)已經(jīng)能夠?qū)崿F(xiàn)番茄中提高減數(shù)分裂時交換發(fā)生的頻率以及調(diào)控減數(shù)分裂發(fā)生位置，來簡化育種程序、縮短育種周期^[46]?；蚪M編輯技術(shù)的不斷發(fā)展，大大的提高了該技術(shù)的適用范圍，同時針對某個物種的定向優(yōu)化提高了CRISPR/Cas9系統(tǒng)的特異性，使得該系統(tǒng)能夠針對特定物種的高編輯效率，低脫靶失誤成為可能。

因此，結(jié)合新基因功能發(fā)現(xiàn)和定向優(yōu)化CRISPR基因編輯技術(shù)，可以在推動快速挖掘和鑒定新基因功能的同時，通過設(shè)計物種特異的基因組編輯系統(tǒng)進行人工定向育種，可以實現(xiàn)真正意義的分子設(shè)計育種。這一技術(shù)將成為基因組和遺傳背景研究尚未深入的小作物或經(jīng)濟作物（如熱帶和亞熱帶的藥用植物等資源植物）高效精準育種的新技術(shù)。同時我們必須看到，目前CRISPR基因編輯技術(shù)中的編輯效率和脫靶率是未來研究的關(guān)注重點，不同作物需要優(yōu)化的CRISPR載體，才能提高編輯效率，降低脫靶率，達到物種較高編輯效率，真正縮短育種時間和提高育種效率。除此之外，仍需注意基因編輯產(chǎn)生的變異與生物體內(nèi)已有隱秘變異（Cryptic variation）之間的作用，對基因編輯育種的影響^[47]。

2016年，美國賓夕法尼亞州大學伯克分校的楊亦農(nóng)專家團隊通過編輯白色雙孢菇中一類編碼導致褐變的多酚氧化酶（PPO），而使它具有了抗褐變能力，且美國農(nóng)業(yè)部表示并不認為有必要對此基因編輯蘑菇進行監(jiān)管，意味著這種基因編輯蘑菇可以直接用于種植和銷售^[48]。美國農(nóng)業(yè)部作為評估轉(zhuǎn)基因農(nóng)業(yè)產(chǎn)品部門之一，認為基因編輯作物不應像“傳統(tǒng)”轉(zhuǎn)基因生物那樣接受同樣嚴格的監(jiān)管，而傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)必須接受動植物檢疫局（APHIS）監(jiān)管;接著，全球第四大農(nóng)化產(chǎn)品公司杜邦公司宣布了其使用基因編輯技術(shù)得到的高質(zhì)量糯玉米品種（監(jiān)管豁免）上市計劃;加拿大、阿根廷、巴西、智利、以色列等國家已發(fā)布類似美國的基因編輯作物管理政策。2018年，日本政府委員會規(guī)定基因編輯作物不屬于轉(zhuǎn)基因法規(guī)監(jiān)管范疇;澳大利亞亦不將基因編輯視為“基因改造”;英國政府也已批準以試驗方式種植經(jīng)過基因編輯旨在強化omega-3含量的亞麻籽。我國對于基因編輯新品種的管理制度尚在完善過程中，未來基因編輯技術(shù)的發(fā)展和應用前景廣闊。

機遇與挑戰(zhàn)并存，基因組編輯技術(shù)的不斷優(yōu)化將極大地變革傳統(tǒng)育種方式，同時基因組編輯技術(shù)也將彌補分子設(shè)計育種存在的先天不足，實現(xiàn)優(yōu)勢互補，這對未來提高經(jīng)濟作物產(chǎn)量和質(zhì)量大有裨益。

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