龍眼MSIL全基因組鑒定及表達(dá)分析

許小瓊 陳曉慧 申序 徐小萍 林玉玲 賴(lài)鐘雄

摘 ?要MSIL（Muliticopy suppressor of IRA homolog1-Like）基因是WD重復(fù)蛋白的一個(gè)亞家族，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。為了解龍眼MSIL（DlMSIL）基因家族的生物學(xué)功能，本研究基于基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，采用生物信息學(xué)分析法對(duì)DlMSIL基因成員進(jìn)行鑒定，并進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)分析、系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建、啟動(dòng)子順式作用元件分析、龍眼體胚階段和不同組織器官表達(dá)情況以及GA₃處理下的定量表達(dá)分析。結(jié)果表明：DlMSIL基因家族含有6個(gè)成員屬于WD40和CAF1C_H4-bd超家族，可分為3類(lèi);DlMSIL蛋白編碼393～551?aa，等電點(diǎn)為4.68～7.62，該家族成員均不屬于分泌蛋白;基因家族成員的內(nèi)含子數(shù)目在4～14之間;DlMSIL啟動(dòng)子序列包含大量非生物脅迫響應(yīng)元件及MYB結(jié)合位點(diǎn)，推測(cè)DlMSIL基因家族可能參與多種非生物脅迫反應(yīng);DlMSIL可能參與不同胚胎的發(fā)育過(guò)程和不同組織器官的形態(tài)建成。GA₃處理下的表達(dá)分析顯示高濃度時(shí)，DlMSI1a與DlMSI1c的表達(dá)受到了一定的抑制，而DlMSI4a的表達(dá)量呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢(shì)，推測(cè)DlMSIL可能參與激素響應(yīng)途徑。本研究表明，DlMSIL基因家族成員可能參與胚胎發(fā)育、激素信號(hào)通路以及非生物脅迫反應(yīng)等多種生物學(xué)功能，體現(xiàn)了龍眼MSIL基因家族功能具有多樣性。

關(guān)鍵詞 ?龍眼;體胚;MSIL;生物信息學(xué)分析;qPCR中圖分類(lèi)號(hào)??S667.2; Q943.2??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼??A

Genome-wide Identification and Expression Analysis of MSILGene FamilyDuring?Somatic Embryogenesis in Dimocarpus longan?Lour.

XU?Xiaoqiong，?CHEN Xiaohui，?SHEN Xu，?XU?Xiaoping，?LIN Yuling，?LAI Zhongxiong^*

Institute of Horticultural Bioengineering， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian?350002， China

Abstract ?TheMSIL （Multicopy suppressor of IRA homolog1-Like） gene is a subfamily of WD repeat proteins and plays an important role in growth and development?of?plants. In order to understand the biological function of the longanMSIL（DlMSIL） gene family， biological analysis was used to identifyDlMSILgene membersand the protein structure physical and chemical properties， promoter cis-acting element， expression of?longan somatic embryo stage and different tissues and organs， and quantitative expression under GA₃treatment?were analyzed， based on genome and transcriptome data. TheDlMSIL gene family?was?consisted?of six members belonging?to the WD40 and CAF1C_H4-bd superfamily，?which could?be divided into three categories. The DlMSIL protein encoded?393–551 amino acids， and the isoelectric point was between 4.68 and 7.62. It was?secreted protein. The number of introns of the gene family members was between 4 and 14. TheDlMSILpromoter sequence contained?many?abiotic stress response elements andMYBbinding sites， suggesting that theDlMSILgene family maight?be involved in some?abiotic stress responses. TheDlMSILmaight?be involved in?the morphogenesis of different embryonic development processes and different tissues and organs. The expression analysis of GA₃treatment showed that the relative expression ofDlMSI1aandDlMSI1cwas inhibited with the increase of the concentration at high concentration， while the expression ofDlMSI4adecreased first， then increased and then decreased. It is speculated thatDlMSILmay be involved in the hormone response pathway. The?study shows that the members of theDlMSILgene family may be involved in various biological functions such as embryonic development， hormone signaling pathways and abiotic stress responses， reflecting the diversity of longanMSILgene family functions.

Keywords ?Dimocarpus longanLour.;?somatic embryo;MSIL（Multicopy suppressor of IRA homolog1-like?gene）;?bioinformatics analysis;?qPCR

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.10.006

WD重復(fù)蛋白是一種調(diào)控蛋白超家族，具有豐富的多樣性。迄今為止，在進(jìn)行WD40蛋白的研究歷程中，發(fā)現(xiàn)其廣泛存在于真核生物，而在原核生物中很少出現(xiàn)^[1]。據(jù)研究表明，WD40結(jié)構(gòu)域通常以Trp-Asp結(jié)尾，并由40～60個(gè)保守的氨基酸殘基組成^[2]。WD40重復(fù)序列主要通過(guò)介導(dǎo)蛋白之間的相互作用來(lái)參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、mRNA剪接、組蛋白修飾和細(xì)胞周期調(diào)控等重要過(guò)程^[3]。該超家族的成員在植物特異性發(fā)育過(guò)程中扮演著重要的角色，它們通過(guò)上游信號(hào)通路或下游效應(yīng)因子來(lái)實(shí)現(xiàn)其功能特異性^[4]。例如，在擬南芥中，AGB1（含有7個(gè)WD40重復(fù)蛋白）功能的喪失會(huì)導(dǎo)致果實(shí)縮短^[5]，下胚軸和根的細(xì)胞分裂模式發(fā)生改變^[6]。綜上所述，可見(jiàn)WD40超家族參與多種生物學(xué)功能的發(fā)生過(guò)程。

MSIL蛋白是WD重復(fù)蛋白大家族中的亞家族，也是形成參與染色質(zhì)組裝、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和細(xì)胞分裂等各種生物途徑的蛋白復(fù)合物的一部分^[7]。大多數(shù)MSIL基因家族成員包含了7個(gè)WD40重復(fù)蛋白^[8]。1989年，Ruggieri等^[9]首次在釀酒酵母IRA1多拷貝抑制因子（multicopy suppressor of the iral mutation 1）中將MSI1篩選出來(lái)，并確定MSI1蛋白是釀酒酵母RAS介導(dǎo)的cAMP通路的負(fù)調(diào)控因子。據(jù)研究表明，MSIL基因在染色質(zhì)重塑、細(xì)胞分裂和分化、植物開(kāi)花調(diào)控、DNA損傷修復(fù)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能^[8]。擬南芥中，該基因家族共有5個(gè)成員（AtMSI1-5）^[8]，其中，AtMSIL1是染色質(zhì)組裝因子-1（CAF-1）、組蛋白去乙酰化酶、多冠抑制復(fù)合體-2（PRC2）等多種復(fù)合物的亞基，分別參與染色質(zhì)的組裝、脫落酸（ABA）機(jī)制的微調(diào)、春化反應(yīng)等過(guò)程，與擬南芥的營(yíng)養(yǎng)狀況和生殖發(fā)育密切相關(guān)^[10-12];此外，K?hler等^[13]還證明了AtMSIL1在擬南芥種子發(fā)育的過(guò)程中不可缺少。在擬南芥中，不僅AtMSI1扮演著重要的角色，AtMSI4在擬南芥生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程中也發(fā)揮著不可忽視的作用。例如，Pazhouhandeh等^[14]通過(guò)研究表明，AtMSI4可以結(jié)合纖環(huán)泛素連接酶和CLF-PRC2復(fù)合物調(diào)控?cái)M南芥的開(kāi)花過(guò)程。此外，AtMSI4對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育起促進(jìn)作用，并參與某些生物和非生物的脅迫反應(yīng)^[15]。而關(guān)于AtMSI2、AtMSI3在擬南芥中發(fā)揮什么樣的功能，目前研究較少，因此其生物學(xué)功能尚不能確定。此外，周群豐^[16]對(duì)水稻MSIL的研究表明水稻MSIL基因可以控制細(xì)胞的分裂分化，而OsMSI1對(duì)DNA甲基化及組蛋白H3K27甲基化修飾有重要的影響。MSIL不僅在植物中發(fā)揮作用，在哺乳動(dòng)物中也是必不可少的，如MSIL可形成MSIL-pRB復(fù)合物參與抑制E2F轉(zhuǎn)錄因子的靶基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程^[17]。綜上所述，MSIL基因家族有著豐富多樣的生物學(xué)功能，在植物和動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著不可忽視的作用。因此，有必要對(duì)龍眼MSIL基因家族進(jìn)行進(jìn)一步的分析，了解其在龍眼生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮的作用。

龍眼（Dimocarpus longan Lour.）是一種常綠果樹(shù)，屬于無(wú)患子科。原產(chǎn)于亞洲溫帶和熱帶，在我國(guó)廣泛種植于南部和東南亞地區(qū)^[18]。龍眼胚胎發(fā)育狀況影響其種子大小、果實(shí)品質(zhì)及果實(shí)產(chǎn)量^[19]，因此，對(duì)龍眼胚胎發(fā)育調(diào)控進(jìn)行研究是十分有必要的。在進(jìn)行龍眼胚胎發(fā)育的研究過(guò)程中，本實(shí)驗(yàn)室提供的龍眼基因組^[20]帶來(lái)了巨大的便利。目前，對(duì)于龍眼胚胎發(fā)育的研究已經(jīng)有了一些進(jìn)展。例如，DlRan參與了生長(zhǎng)素類(lèi)似物（2，4-D）誘導(dǎo)的龍眼體細(xì)胞胚胎生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程^[21]，龍眼體細(xì)胞胚胎形態(tài)和結(jié)構(gòu)的建立則需要很多的lncRNA共同參與^[22]。對(duì)于MSIL基因家族在植物胚胎發(fā)育過(guò)程中所發(fā)揮作用的研究較少，Rossi等^[7]通過(guò)實(shí)驗(yàn)探討了ZmRbAp基因在胚乳早期分化的作用，發(fā)現(xiàn)ZmRbAp1參與了胚乳早期的形成，而且ZmRbAp基因可能有助于生殖器官細(xì)胞分裂和形態(tài)建成。由此推測(cè)，龍眼MSIL基因家族也有類(lèi)似的生物學(xué)功能。因此，本文通過(guò)對(duì)龍眼基因組進(jìn)行篩選，共獲得6條龍眼MSIL基因即DlMSI1a、DlMSI1b、DlMSI1c、DlMSI2、DlMSI4a、DlMSI4b，并根據(jù)轉(zhuǎn)錄組對(duì)龍眼MSIL基因在不同胚性發(fā)生階段和不同組織器官中的特異性表達(dá)進(jìn)行分析，初步了解在體胚階段與非體胚階段龍眼MSIL基因表達(dá)的差異性。然后通過(guò)對(duì)龍眼MSIL基因家族成員的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)、基因結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域以及啟動(dòng)子順式作用元件進(jìn)行分析，從而對(duì)龍眼MSIL基因的生物學(xué)功能有了初步的了解。最后，采用熒光定量PCR分析（qPCR）研究龍眼MSIL基因部分成員在不同激素濃度下的表達(dá)情況。以期為研究龍眼MSIL基因家族在龍眼體胚及生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1??材料與方法

1.1材料

實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的龍眼基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（NCBI登錄號(hào)：BioProject PRJNA305337）、龍眼轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)（SRA050205），在Uniprot（https：//www.uniprot.?org/）數(shù)據(jù)庫(kù)中下載擬南芥（Arabidopsis thaliana）MSIL家族的基因序列和氨基酸序列，phytozome（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）數(shù)據(jù)庫(kù)下載水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）、蘋(píng)果（Malus domestica）、大豆（Glycine max）、甜橙（Citrus sinensis）、馬鈴薯（Solanum tuberosum）、番茄（Solanum lycopersicum）MSIL家族的基因序列和氨基酸序列。

將實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)了20?d的生長(zhǎng)發(fā)育較好的龍眼胚性愈傷組織作為材料，并選出0.5?g的松散、淺黃且顆粒較細(xì)的龍眼愈傷組織作為不同激素處理的備用材料。首先選取5個(gè)干燥潔凈的錐形瓶，然后加入50?mL的MS液體培養(yǎng)基，再分別加入濃度為0、2.5、12.5、62.5?mg/L的赤霉素激素，把選好的愈傷組織接種于配好的液體培養(yǎng)基中，在25?℃、110 r/min的搖床中，黑暗培養(yǎng)24?h。最后收集上述處理的材料，用液氮速凍后保存在?80?℃的冰箱中，用于熒光定量分析^[23]。

1.2方法

1.2.1DlMSIL家族成員的鑒定和進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建??為鑒定龍眼MSIL基因家族成員，首先采用Conserved Domains Database（CDD;https：// www.?ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml）對(duì)擬南芥MSIL氨基酸序列的蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行初步分析，再通過(guò)TBtools^[24]進(jìn)行繪制，最后根據(jù)獲得的擬南芥MSIL保守結(jié)構(gòu)域并結(jié)合NCBI Blast同源比對(duì)結(jié)果，進(jìn)行龍眼MSIL基因家族成員的篩選，篩選過(guò)后共獲得6條龍眼MSIL候選序列。

通過(guò)CDD進(jìn)行龍眼MSIL候選序列和AtMSI1序列的蛋白結(jié)構(gòu)域分析，再采用TBtools軟件對(duì)龍眼MSIL候選序列的蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行繪制;利用DNAMAN對(duì)龍眼MSIL候選序列和AtMSL1蛋白序列進(jìn)行同源性對(duì)比;采用MEGA?5.05軟件對(duì)龍眼、擬南芥、水稻、玉米、蘋(píng)果、大豆、甜橙、馬鈴薯、番茄的MSIL蛋白家族序列進(jìn)行序列對(duì)比并手動(dòng)刪除同源性相差較大的序列，然后通過(guò)鄰近法（Neighbor-joining method）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，將自展法系數(shù)（Bootstrap）設(shè)置為1000次進(jìn)行重復(fù)檢驗(yàn)。采用同樣的方法，單獨(dú)對(duì)龍眼MSIL基因家族成員進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建。

1.2.2DlMSIL基因結(jié)構(gòu)以及蛋白結(jié)構(gòu)域分析??通過(guò)GSDS在線分析龍眼MSIL家族成員基因結(jié)構(gòu)中內(nèi)含子與外顯子的數(shù)量和位置;通過(guò)ExPASy、SignalP4.0在線分析龍眼MSIL家族成員氨基酸序列的等電點(diǎn)（pI）、蛋白質(zhì)分子量（Mw）、氨基酸數(shù)目以及N端信號(hào)肽;通過(guò)NetNGlyc在線分析DlMSIL家族成員氨基酸序列的糖基化位點(diǎn)（Threshold=0.5）;通過(guò)MEME對(duì)DlMSIL家族成員進(jìn)行motif分析，然后再通過(guò)TBtools將得到的motif結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步繪制。

1.2.3DlMSIL基因的啟動(dòng)子分析??采用Plant care在線網(wǎng)站分析龍眼MSIL家族成員的啟動(dòng)子特征以及順式作用元件的特點(diǎn)，然后再采用GraphPad Prism軟件對(duì)順式作用元件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，從而對(duì)DlMSIL家族成員的順式元件有更加深入的了解。

1.2.4DlMSIL基因家族成員在不同體胚階段、不同器官及不同激素處理下的特異性表達(dá)??利用在龍眼轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中提取的DlMSIL家族成員在不同體胚發(fā)生階段即非胚性愈傷組織（non-embryonic callus，NEC）、不完全胚性緊實(shí)結(jié)構(gòu)（incomplete compact pro-embrogenic cultures，ICpEC）、球形胚（globular embryos，GE）和不同組織器官即種子、根、莖、葉、花蕾、果肉、幼果、果皮以及不同激素（2，4-D、2，4-D-KT、KT、MS）中特異表達(dá)的FPKM值，通過(guò)TBtools制作熱圖，以便了解該基因家族成員在不同體胚階段、不同器官及不同激素處理下的差異性表達(dá)。

1.2.5DlMSIL基因家族部分成員qPCR引物設(shè)計(jì)和分析??利用DlMSI1a、DlMSI1c、DlMSI4a3條龍眼MSIL基因家族成員的CDS序列，通過(guò)Primer Premier6.0初步尋找其正向與反向引物，再通過(guò)DNAMAN進(jìn)行二次篩選，得到以下符合引物設(shè)計(jì)原則的引物（表1）。以EF-1a為內(nèi)參^[25]，采用Excel并參考單內(nèi)參系統(tǒng)檢驗(yàn)DlMSIL基因家族成員的表達(dá)情況，利用IBM SPSS Statistics 24軟件進(jìn)一步了解龍眼EC階段中DlMSIL1a、DlMSI1c、DlMSI4a在不同濃度的赤霉素濃度處理下的特異性表達(dá)。

25.89%、52.69%、23.15%和21.36%，由此可見(jiàn)，DlMSI1b與AtMSI1同源性最高，因此進(jìn)一步推測(cè)DlMSI1b與AtMSI1可能具有類(lèi)似的功能。

2.4DlMSIL基因家族成員啟動(dòng)子分析

為了進(jìn)一步了解龍眼MSIL基因家族成員的基因表達(dá)調(diào)控基本情況，通過(guò)Plant Care在線網(wǎng)站對(duì)龍眼MSIL基因上游2000 bp的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行了順式元件分析。結(jié)果表明，龍眼MSIL基因家族成員均含有CAAT-box和TATA-box，并且CAAT-box均多于TATA-box，這表明該基因家族成員均能正常轉(zhuǎn)錄（圖5）。

為了更好的了解龍眼MSIL基因家族成員的生物學(xué)功能，對(duì)該基因家族成員的主要啟動(dòng)子的順式作用元件進(jìn)行了分析（圖6）。結(jié)果表明，龍眼MSIL基因家族成員均含有光響應(yīng)元件、增強(qiáng)子順式作用元件及在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)?30附近的核心啟動(dòng)子響應(yīng)元件，并且在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)?30附近的核心啟動(dòng)子響應(yīng)元件含量最多。大部分龍眼

MSIL基因家族成員具有厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件，參與赤霉素、水楊酸的激素應(yīng)答以及低溫脅迫;50%的基因響應(yīng)茉莉酸甲酯、脫落酸的激素應(yīng)答以及玉米醇溶蛋白的代謝調(diào)控，還含有光脅迫和干旱脅迫下MYB轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn);33.3%的基因具有生長(zhǎng)素響應(yīng)元件和防御與應(yīng)激響應(yīng)元件。此外，與黃酮類(lèi)化合物生物合成相關(guān)基因調(diào)控的MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)只存在DlMSI1a基因中，參與晝夜控制的順式作用調(diào)控元件和在α-淀粉酶啟動(dòng)子中保守的序列只存在于DlMSI4a基因中，只有DlMSI2基因具有MYBHV1結(jié)合位點(diǎn)，只有DlMSI4b具有缺氧特異性誘導(dǎo)響應(yīng)。由此可見(jiàn)，龍眼MSIL基因家族成員具有大量的光響應(yīng)元件、激素響應(yīng)元件、脅迫響應(yīng)元件以及其他參與植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)的順式響應(yīng)元件。不同的成員所包含的順式作用元件及其數(shù)量有所不同，這可能導(dǎo)致不同成員產(chǎn)生的光周期效應(yīng)不同，對(duì)不同的脅迫響應(yīng)具有一定的區(qū)別，參與龍眼生長(zhǎng)過(guò)程中相關(guān)的激素應(yīng)答存在顯著差異，并且不同成員對(duì)龍眼生長(zhǎng)過(guò)程中有不同的特異性功能。而特有的順式調(diào)控元件，則可能導(dǎo)致龍眼MSIL基因家族成員之間出現(xiàn)功能特異性的情況。

2.5 DlMSIL基因家族成員在不同體胚階段和不同器官中特異性表達(dá)分析

為了解龍眼MSIL基因在不同體胚階段和不同器官的特異性表達(dá)，利用TBtools制作了熱圖（圖7）。結(jié)果顯示，不同體胚發(fā)生過(guò)程中，龍眼MSIL基因在ICpEC階段中均表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá);在NEC階段中只有DlMSI1c上調(diào)表達(dá);在EC階段DlMSI1b、DlMSI1c下調(diào)表達(dá)，其余龍眼MSIL基因家族成員均上調(diào)表達(dá);在GE階段中只有DlMSI1c下調(diào)表達(dá)。由此可見(jiàn)，龍眼MSIL基因家族成員在體胚發(fā)生階段總體呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)的趨勢(shì)，這可能與龍眼MSIL基因家族成員在體胚發(fā)生階段具有重要功能有關(guān)。除此之外，發(fā)現(xiàn)DlMSI1c在不同體胚發(fā)生過(guò)程中與大部分龍眼MSIL基因發(fā)生表達(dá)的不同，這可能與DlMSI1c基因在體胚發(fā)生過(guò)程中不同的生物學(xué)功能有關(guān)。

在不同組織器官中，龍眼MSIL基因家族成員在種子、花、花蕾、果皮均表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá);在幼果中DlMSI1a、DlMSI1b、DlMSI1c上調(diào)表達(dá)，DlMSI2、DlMSI4a、DlMSI4b下調(diào)表達(dá);在葉子中，只有DlMSI1c上調(diào)表達(dá)，其余龍眼MSIL基因均下調(diào)表達(dá);在果肉中，DlMSI1a、DlMSI4a下調(diào)表達(dá)，DlMSI1b、DlMSI1c、DlMSI2、DlMSI4b上調(diào)表達(dá);在根中，DlMSI1a、DlMSI1b、DlMSI4a下調(diào)表達(dá)，DlMSI1c、DlMSI2、DlMSI4b上調(diào)表達(dá);在莖中，DlMSI1b、DlMSI1c上調(diào)表達(dá)，其余均下調(diào)表達(dá)。由此可見(jiàn)，龍眼MSIL基因在組織器官中總體呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)。

綜上所述，從體胚階段到非體胚階段龍眼MSIL基因總表達(dá)水平呈現(xiàn)一種逐漸降低的趨勢(shì)，暗示龍眼MSIL基因可能更多參與龍眼植株的體胚階段。龍眼MSIL基因在體胚發(fā)生階段發(fā)揮著重要的作用，其中在不完全胚性階段均表達(dá)，大部分成員在胚性階段表達(dá)，而在非胚性階段有5個(gè)成員不表達(dá)，這體現(xiàn)出龍眼MSIL基因在胚性階段和非胚性階段的顯著差異;在組織器官中，大部分龍眼MSIL基因不表達(dá)，尤其在種子、花、花蕾、果皮中均不表達(dá)，也可能是由于龍眼MSIL基因較少參與組織器官的形態(tài)建成。

2.6 ?DlMSIL基因家族成員在不同激素下的表達(dá)模式分析

為了解DlMSIL基因家族成員在不同激素下的特異性表達(dá)，通過(guò)TBtools制作了熱圖（圖8）。結(jié)果顯示，龍眼MSIL基因家族成員在2，4-D與2，4-D-KT激素處理下，均呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá);而在KT與MS激素處理下，均呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)。推測(cè)2，4D可能抑制龍眼MSIL基因家族成員的表達(dá)，KT與MS則促進(jìn)龍眼MSIL基因家族成員的表達(dá)。

研究龍眼EC階段中DlMSIL1a、DlMSI1c、DlMSI4a在不同濃度的赤霉素（GA₃）中的特異性表達(dá)，結(jié)果如圖9所示。在GA₃不同濃度的處理下，DlMSI1a和DlMSI1c在不同GA₃濃度處理下的表達(dá)均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，由此可見(jiàn)在低濃度處理下對(duì)DlMSI1a和DlMSI1c具有上調(diào)表達(dá)作用，而高濃度處理具有下調(diào)表達(dá)作用，且在GA₃濃度為2.5 mg/L時(shí)相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最大值，總體表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)，區(qū)別是DlMSI1c的表達(dá)隨著GA₃濃度變化的幅度較小;?DlMSI4a的相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)為先下降再上升最后下降的趨勢(shì)，DlMSI4a表達(dá)的變化幅度較大，較低的GA₃濃度時(shí)其表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)，較高濃度則表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)。此外，DlMSI4a在GA₃濃度為12.5?mg/L時(shí)相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最大值，因此可以認(rèn)為在GA₃濃度為12.5?mg/L的處理下最利于DlMSI4a進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。隨著GA₃濃度的改變DlMSI4a變化幅度劇烈的表達(dá)模式，暗示其受到GA₃濃度的調(diào)控作用。

3??討論

3.1 ?DlMSIL基因家族成員的功能可能具有多樣性

CAF1C_H4-bd是CAF1復(fù)合物的亞基，而CAF-1是一種保守的雜三聚體蛋白復(fù)合物，促進(jìn)主要的組蛋白H3復(fù)制依賴(lài)的核小體組裝。在DNA復(fù)制與損傷修復(fù)過(guò)程中，CAF-1主要參與染色質(zhì)的形成^[26]。研究發(fā)現(xiàn)，在果蠅中，最大的亞基CAF-1 p180是控制異染色質(zhì)形成和維持表觀遺傳的重要因素^[27]。在擬南芥中，AtMSI1與RDR1結(jié)合抑制雌配子中MET1的表達(dá)，從而導(dǎo)致印記基因FIS2/FWA不能被甲基化修飾，而影響胚乳的形成^[28]。前面我們已經(jīng)知道，WD40超家族具有多種生物學(xué)功能。結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果顯示龍眼MSIL家族成員均屬于WD40超家族和CAF1C_H4-bd超家族，且AtMSI1與DlMSI1a、DlMSI1b、DlMSI2的蛋白序列的同源性較高，推測(cè)DlMSIL在龍眼的生長(zhǎng)與發(fā)育過(guò)程中可能參與染色質(zhì)組裝、胚乳發(fā)育等生物學(xué)途徑。再結(jié)合啟動(dòng)子順式元件分析，結(jié)果顯示龍眼MSIL基因家族具有干旱脅迫和光脅迫下MYB轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，暗示龍眼MSIL基因可能受MYB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控途徑作用，從而增強(qiáng)抵抗逆境脅迫的能力。

3.2 ?DlMSIL基因家族成員可能在龍眼胚胎發(fā)育過(guò)程中起著關(guān)鍵作用

迄今為止，已有研究表明MSIL基因家族成員在胚胎生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程中發(fā)揮著不可忽視的作用。如擬南芥AtMSI1同F(xiàn)IE、MEA共同構(gòu)成FIS復(fù)合物，而FIS復(fù)合體中的任何一個(gè)亞基的缺乏都會(huì)導(dǎo)致與受精無(wú)關(guān)的種子發(fā)育和種子敗育，K?hler等^[13]的研究結(jié)果表明AtMSI1對(duì)擬南芥種子發(fā)育的正確起始和發(fā)展過(guò)程有著舉足輕重的作用。后來(lái)，Dumbliauskas等^[29]還發(fā)現(xiàn)AtMSI1與CUL4-DDB1結(jié)合形成控制胚乳形成和維持MEDEA親本印記過(guò)程的蛋白復(fù)合物。根據(jù)我們對(duì)龍眼MSIL基因家族成員在不同胚性發(fā)生階段和不同器官中的特異性表達(dá)結(jié)果可知，DlMSIL在胚性發(fā)生階段具有明顯的上調(diào)表達(dá)，尤其是在胚胎發(fā)育的成熟階段表現(xiàn)出較高的表達(dá)，而在不同器官中DlMSIL的表達(dá)顯著下調(diào)。因此，我們推測(cè)DlMSIL基因家族是胚胎生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。此外，值得注意的是，在體胚發(fā)生階段中，DlMSI1c的表達(dá)與大部分DlMSIL基因成員相反，在NEC階段中其他DlMSIL基因成員表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)，DlMSI1c則表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá);在GE階段中其他DlMSIL基因成員表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)，DlMSI1c則表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)。由此推測(cè)，在龍眼DlMSIL基因中，只有DlMSI1c參與龍眼胚胎體細(xì)胞的發(fā)生過(guò)程，而其他DlMSIL基因成員則主要參與胚胎的發(fā)育過(guò)程。

3.3 ?DlMSIL基因家族成員可能參與多種植物激素信號(hào)通路和某些非生物脅迫

DlMSIL基因家族中有50%以上的成員具有赤霉素響應(yīng)元件。赤霉素是調(diào)節(jié)植物細(xì)胞伸長(zhǎng)的主要激素之一，如果缺乏赤霉素會(huì)導(dǎo)致植物生長(zhǎng)矮小^[30]。而周群豐^[16]經(jīng)研究表明油菜素內(nèi)酯和赤霉素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中受阻可能造成植株矮化。本研究就不同GA₃濃度對(duì)DlMSI1a、DlMSI1c及DlMSI4a進(jìn)行了定量表達(dá)研究，結(jié)果表明，DlMSI1a與DlMSI1c在高濃度時(shí)其表達(dá)模式表現(xiàn)為抑制作用，而DlMSI4a在不同濃度處理下其表達(dá)模式呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢(shì)，表明DlMSI4a的表達(dá)容易受到GA₃濃度的調(diào)控，因此推測(cè)DlMSIL可以通過(guò)赤霉素信號(hào)通路在種子生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮作用。除此之外，DlMSIL基因家族還具有脫落酸、茉莉酸甲酯、赤霉素、水楊酸等激素應(yīng)答響應(yīng)元件。由此推測(cè)，DlMSIL基因成員參與多種激素信號(hào)傳遞。

根據(jù)Mehdi等^[11]研究表明，MSI1與組蛋白去乙?；?9（HDA19）屬于一個(gè)復(fù)合體，MSI1或HDA19可以都反向調(diào)控ABA的敏感性和鹽脅迫的耐受性。此外，ABA還是對(duì)非生物脅迫的主要介質(zhì)。因此根據(jù)我們對(duì)龍眼MSIL基因家族成員啟動(dòng)子順式作用元件的分析，我們可知該基因家族有50%的成員具有ABA響應(yīng)元件，從而初步推測(cè)龍眼MSIL基因家族部分成員可以調(diào)控ABA的敏感性和鹽脅迫的耐受性。除此之外，在龍眼MSIL基因家族中，50%及以上成員具有低溫應(yīng)激、厭氧脅迫、光脅迫和干旱脅迫等非生物脅迫響應(yīng)元件，由此我們猜測(cè)龍眼MSIL基因參與植株生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的非生物脅迫過(guò)程。Kim等^[31]通過(guò)研究得知，AtMSI4/FVE在調(diào)控植物開(kāi)花和抗寒脅迫方面具有雙重作用，這種作用可能為植物提供進(jìn)化適應(yīng)性。此外，面對(duì)非最佳環(huán)境狀態(tài)時(shí)，植物利用大量的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)來(lái)面對(duì)某些非生物脅迫，這些轉(zhuǎn)錄調(diào)控在很大程度上受染色質(zhì)控制^[32]，而MSIL基因家族又是參與染色質(zhì)組裝的蛋白復(fù)合物的一部分，并且該基因家族部分成員具有非生物脅迫響應(yīng)元件，因此，我們猜測(cè)龍眼MSIL基因家族部分成員在多種非生物脅迫上發(fā)揮著不可忽視作用。

除此之外，龍眼MSIL基因家族成員均含有大量的光響應(yīng)元件，這說(shuō)明該基因家族在光響應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮著舉足輕重的作用。不難發(fā)現(xiàn)，在龍眼MSIL基因家族中，只有DlMSI4a具有參與晝夜控制的順式作用調(diào)控元件，因此我們推測(cè)該成員在調(diào)節(jié)植物晝夜節(jié)律上發(fā)揮重要的作用。同時(shí)只有DlMSI1c具有與黃酮類(lèi)化合物生物合成相關(guān)基因調(diào)控的MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，因此在龍眼生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，該成員可能參與種子成熟或者果皮成色階段。

總之，龍眼MSIL基因家族成員在體胚階段如何應(yīng)對(duì)多種生物脅迫，如何參與激素響應(yīng)以及在龍眼生長(zhǎng)發(fā)育及代謝中如何起作用還需要進(jìn)一步深入研究。

參考文獻(xiàn)

[1] Li Q， Zhao P， Li J， et al. Genome-wide analysis of theWD-repeat protein family in cucumber and Arabidopsis[J].Molecular Genetics and Genomics， 2014， 289（1）： 103-124.

[2] Wall M A， Coleman D E， Lee E， et al. The structure of the Gprotein heterotrimer Giα1β1γ2[J]. Cell， 1995， 83（6）：1047-1058.

[3] 李 頔， 唐曉鳳， 劉永勝. 番茄 MSI2-like 基因的克隆及功能初探[J]. 四川大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2015， 52（4）：871-878.

[4] van Nocker S， Ludwig P. The WD-repeat proteinsuperfamily in Arabidopsis： conservation and divergence instructure and function[J]. BMC Genomics， 2003， 4（1）： 50.

[5] Lease K A， Wen J， Li J， et al. A mutant Arabidopsisheterotrimeric G-protein β subunit affects leaf， flower， andfruit development[J]. The Plant Cell， 2001， 13（12）：2631-2641.

[6] Ullah H， Chen J G， Temple B， et al. The β-subunit of theArabidopsis G protein negatively regulates auxin-inducedcell division and affects multiple developmental processes[J].The Plant Cell， 2003， 15（2）： 393-409.

[7] Rossi V， Varotto S， Locatelli S， et al. The maize WD-repeatgene ZmRbAp1 encodes a member of the MSI/RbApsub-family and is differentially expressed during endospermdevelopment[J]. Molecular Genetics and Genomics， 2001，265（4）： 576-584.

[8]?Hennig L， Bouveret R， Gruissem W. MSI1-like proteins： an escort service for chromatin assembly and remodeling complexes[J]. Trends in Cell Biology， 2005， 15（6）： 295-302.

[9]?Ruggieri R， Tanaka K， Nakafuku M，et al.MSI1， a negative regulator of the RAS-cAMP pathway inSaccharomyces cerevisiae[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences?of the United States of America， 1989， 86（22）： 8778-8782.

[10] Kaya H， Shibahara K I， Taoka K I， et al. FASCIATA genesfor chromatin assembly factor-1 in Arabidopsis maintain thecellular organization of apical meristems[J]. Cell， 2001，104（1）： 131-142.

[11] Mehdi S， Derkacheva M， Ramstr?m M， et al. The WD40domain protein MSI1 functions in a histone deacetylasecomplex to fine-tune abscisic acid signaling[J]. The PlantCell， 2016， 28（1）： 42-54.

[12] Derkacheva M， Steinbach Y， Wildhaber T， et al. ArabidopsisMSI1 connects LHP1 to PRC2 complexes[J]. The EMBOJournal， 2013， 32（14）： 2073-2085.

[13] K?hler C， Hennig L， Bouveret R， et al. Arabidopsis MSI1 isa component of the MEA/FIE Polycomb group complex andrequired for seed development[J]. The EMBO Journal， 2003，22（18）： 4804-4814.

[14] Pazhouhandeh M， Molinier J， Berr A， et al. MSI4/FVEinteracts with CUL4-DDB1 and a PRC2-like complex tocontrol epigenetic regulation of flowering time inArabidopsis[J]. Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America， 2011， 108（8）：3430-3435.

[15] Kenzior A， Folk W R. Arabidopsis thaliana MSI4/FVEassociates with members of a novel family of plant specificPWWP/RRM domain proteins[J]. Plant Molecular Biology，2015， 87（4-5）： 329-339.

[16] 周群豐. OsMSIL 類(lèi)基因在水稻表觀調(diào)控中的功能研究[D].武漢： 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2015.

[17] Ross J F， Liu X， Dynlacht B D. Mechanism of transcriptionalrepression of E2F by the retinoblastoma tumor suppressorprotein[J]. Molecular Cell， 1999， 3（2）： 195-205.

[18] Sheu S Y， Fu Y T， Huang W D， et al. Evaluation of xanthineoxidase inhibitory potential and in vivo hypouricemicactivity of Dimocarpus longan Lour. extracts[J].Pharmacognosy Magazine， 2016， 12（46）： S206-S212.

[19] Lai Z， Lin Y. Analysis of the global transcriptome of longan（Dimocarpus longan Lour.） embryogenic callus usingIllumina paired-end sequencing[J]. BMC Genomics， 2013，14（1）： 561.

[20] Lin Y， Min J， Lai R， et al. Genome-wide sequencing oflongan （Dimocarpus longan Lour.） provides insights intomolecular basis of its polyphenol-rich characteristics[J].GigaScience， 2017， 6（5）： 1-14.

[21] Fang Z， Lai C， Zhang Y， et al. Molecular cloning， structuraland expression profiling of DlRan genes during somaticembryogenesis in Dimocarpus longan Lour.[J]. SpringerPlus，2016， 5（1）： 181.

[22]?Chen Y， Li X， Su L，et al. Genome-wide identification and characterization of long non-coding RNAs involved in the early somatic embryogenesis in?Dimocarpus longanLour. [J]. BMC Genomics， 2018， 19（1）： 805.

[23]?陳曉慧， 白 ?玉， 陳 ?旭， 等. 龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中DCL基因的分子特性及表達(dá)分析[J]. 西北植物學(xué)報(bào)， 2017， 37（11）： 2120-2129.

[24]?Chen C， Chen H， He Y，et al. TBtools， a Toolkit for Biologists integrating various biological data handling tools with a user-friendly interface[J]. BioRxiv， 2018： 289660.

[25]?Lin Y?L， Lai Z?X. Reference gene selection for qPCR analysis during somatic embryogenesis in longan tree[J]. Plant Science， 2010， 178（4）： 359-365.

[26]?Winkler D?D， Zhou H， Dar M?A，et al. Yeast CAF-1 assembles histone （H3-H4）₂tetramers prior to DNA deposition[J]. Nucleic Acids Research， 2012， 40（20）： 10139-10149.

[27]?Huang H， Yu Z， Zhang S，et al. Drosophila CAF-1 regulates HP1-mediated epigenetic silencing and pericentric heterochromatin stability[J].?Journal of Cell Science， 2010， 123（16）： 2853-2861.

[28]?Jullien P?E， Mosquna A， Ingouff M，et al. Retinoblastoma and its binding partner MSI1 control imprinting inArabidopsis[J]. PLoS Biology， 2008， 6（8）： e194.

[29]?Dumbliauskas E， Lechner E， Jaciubek?M，et al. TheArabidopsisCUL4–DDB1 complex interacts with MSI1?and is required to maintainMEDEAparental imprinting[J]. The EMBO Journal， 2011， 30（4）： 731-743.

[30]?Tong H， Xiao Y， Liu D，et al. Brassinosteroid regulates cell elongation by modulating gibberellin metabolism in rice[J]. The Plant Cell， 2014， 26（11）： 4376-4393.

[31]?Kim H?J， Hyun Y， Park J?Y，et al. A genetic link between cold responses and flowering time throughFVEinArabidopsis thaliana[J]. Nature Genetics， 2004， 36（2）： 167-171.

[32]?Banerjee A， Roychoudhury A. Epigenetic regulation during salinity and drought stress in plants： Histone modifications and DNA methylation[J]. Plant Gene， 2017， 11： 199-204.