miR-637靶向ERBB3對(duì)胃癌細(xì)胞遷移、侵襲及凋亡的影響及分子機(jī)制研究

何孝明, 王金鑫, 楊 劍

何孝明, 浙江省醫(yī)療健康集團(tuán)杭州醫(yī)院急診科 浙江省杭州市 310022

王金鑫, 浙江省醫(yī)療健康集團(tuán)杭州醫(yī)院消化內(nèi)科 浙江省杭州市310022

楊劍, 浙江省醫(yī)療健康集團(tuán)杭州醫(yī)院腫瘤內(nèi)科 浙江省杭州市 310022

核心提要：miR-637可通過(guò)下調(diào)ERBB3的表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901遷移、侵襲, 并促進(jìn)細(xì)胞凋亡.

0 引言

胃癌(gastric cancer, GC)消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一, 死亡率高, 嚴(yán)重威脅著人民的生命和健康, 其中侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致GC患者死亡的重要原因, 探索GC侵襲、轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制, 對(duì)GC的診斷、治療、預(yù)后評(píng)估具有重大意義[1].隨著在分子水平上對(duì)GC生物學(xué)行為機(jī)制研究, 分子靶向治療已成為治療GC的研究熱點(diǎn)[2].miRNA是一類(lèi)內(nèi)源性非編碼小RNA, 在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá), miRNA通過(guò)與GC相關(guān)的調(diào)控基因或mRNA結(jié)合, 使目的mRNA表達(dá)沉默或增強(qiáng), 導(dǎo)致GC細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[3].有研究利用高通量的miRNA芯片檢測(cè)在GC中差異表達(dá)的miRNA, 發(fā)現(xiàn)miR-637在GC中下調(diào)表達(dá), 是高轉(zhuǎn)移潛能GC細(xì)胞中差異表達(dá)的miRNA分子[4].miR-637過(guò)表達(dá)抑制了甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞侵襲遷移能力[5].miR-637還可以通過(guò)抑制周期素依賴(lài)性激酶4(Cyclindependent kinase 4, CDK4)、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukemia-2, Bcl-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase2, MMP-2)的表達(dá)抑制結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移[6].erb-b2受體酪氨酸激酶3(erb-b2 receptor tyrosine kinase 3, ERBB3)是ERBB家族成員之一, 是一種癌基因, ERBB3蛋白在GC中過(guò)表達(dá),與患者預(yù)后不良相關(guān), 其可能與其參與了GC的低分化病理過(guò)程[7].ERBB3還可以抑制乳腺腫瘤細(xì)胞增殖[8].但目前miR-637對(duì)GC細(xì)胞生物行為的影響及其機(jī)制還不清楚.本實(shí)驗(yàn)旨在研究miR-637對(duì)GC細(xì)胞遷移、侵襲及凋亡的影響及其分子機(jī)制是否與ERBB3有關(guān).

1 材料和方法

1.1 材料 GC細(xì)胞SGC-7901購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)； 癌旁組織和GC組織取自當(dāng)?shù)啬[瘤醫(yī)院； 胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibico公司； Lipofectamine TM 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司； Trizol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司； 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京Solarbio公司； 膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙錠(PI)試劑盒、RIPA蛋白裂解液、SDS-PAGE試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司； 二甲基亞砜(DMSO)、BCA試劑盒、PBS緩沖液購(gòu)自Sigma公司； Transwell小室、Matrigel膠購(gòu)于美國(guó)BD公司； 抗體均購(gòu)自上海煊翎生物科技有限公司.E-cadherin(貨號(hào)12886R)、MMP-2(貨號(hào)20705R)、ERBB3(貨號(hào)1454R)、Bax抗體(貨號(hào)20386R)、Bcl-2(貨號(hào)20352R)購(gòu)自上海彩佑實(shí)業(yè)有限公司； 山羊抗兔IgG-辣根過(guò)氧化物酶(貨號(hào)BHR101)購(gòu)自北京博爾西科技有限公司.

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：GC細(xì)胞SGC-7901用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng), 隔天換液一次, 待細(xì)胞融和至80%左右時(shí), 加入胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代, 選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的GC細(xì)胞SGC-7901用0.25%胰蛋白酶消化后接種于96孔板中, 待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合, 更換為無(wú)血清培養(yǎng)基同步化12 h, 隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)染.將miR-NC、miR-637、anti-miR-NC、antimiR-637、si-NC、si-ERBB3分別轉(zhuǎn)染至SGC-7901細(xì)胞中, 記為miR-NC組、miR-637組、anti-miR-NC組、antimiR-637組、si-NC組、si-ERBB3組； 將miR-637分別與pcDNA3.1和 pcDNA3.1-ERBB3共同轉(zhuǎn)染至SGC-7901細(xì)胞中, 記為miR-637+pcDNA3.1組和miR-637+pcDNA3.1-ERBB3組, 轉(zhuǎn)染均按照LipofectamineTM 2000試劑盒進(jìn)行操作.

1.2.3 qRT-PCR檢測(cè)miR-637表達(dá)水平：收集以上各組細(xì)胞, 研磨充分后加入Trizol試劑提取總RNA, 微量核酸測(cè)定儀檢測(cè)RNA純度和濃度.使用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA, 按照TaKaRa熒光定量試劑盒使用說(shuō)明配制反應(yīng)體系, 以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 每個(gè)樣品重復(fù)3次, 循環(huán)條件為95 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s； 72 ℃30 s, 共40個(gè)循環(huán)； 72 ℃延長(zhǎng)5 min.相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法計(jì)算.

1.2.4 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)：收集各組細(xì)胞, 加入RIPA裂解液裂解, 4 ℃, 12000 g離心15 min, 收集蛋白上清液, BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度.將蛋白樣品進(jìn)行SDSPAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜上, 5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h.分別加入一抗(1：800), 4 ℃孵育過(guò)夜, TBST洗膜； 加入二抗(1：1000)室溫孵育2 h, TBST洗滌3次, 每次10 min, 后在暗室中曝光顯影, 再浸入定影, 最后洗去殘液晾干, 將膠片用Quantity One凝膠分析軟件處理, 測(cè)定各組蛋白條帶的吸光度, 以目的條帶和GAPDH條帶的比值作為蛋白表達(dá)水平.

1.2.5 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲：在各組細(xì)胞, 胰酶消化后使用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞, 調(diào)整濃度為2×104個(gè)/mL.以1：5比例加入RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋Matrigel后,鋪于Transwell小室的上室, 室溫下干燥后, 取200 μL細(xì)胞懸液接種于Transwell小室上室中, 并置于含完全培養(yǎng)基的下室中, 37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h, 取出小室,去除培養(yǎng)基后用棉簽輕輕擦去上層細(xì)胞, PBS洗滌, 加入4%多聚甲醛固定30 min, 0.1%結(jié)晶紫染色10 min, 顯微鏡觀(guān)察并隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照.最后顯微鏡下觀(guān)察結(jié)晶紫染色細(xì)胞數(shù)即為侵襲細(xì)胞數(shù).

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：用不含EDTA的胰酶消化各組細(xì)胞, 離心收集各組細(xì)胞, PBS漂洗2次, 加結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞.依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū), 先后加入Annexin V-FITC和PI避光孵育.流式細(xì)胞儀檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)488 nm和發(fā)射波長(zhǎng)530 nm處的熒光強(qiáng)度.實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

1.2.7 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-637對(duì)ERBB3的靶向調(diào)控：TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)顯示ERBB3 3′UTR區(qū)域有miR-637結(jié)合位點(diǎn).構(gòu)建野生型和突變型基因靶點(diǎn)ERBB3的3′UTR-熒光素酶表達(dá)載體(WT-ERBB3和MUT-ERBB3), 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期GC細(xì)胞SGC-7901接種于24孔板(5×104個(gè)/孔), 待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí), 用Lipofectamine TM 2000將WT-ERBB3和MUT-ERBB3分別與miR-NC和miR-637共轉(zhuǎn)染至GC細(xì)胞SGC-7901中.依據(jù)說(shuō)明書(shū)要求, 使用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)儀進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)測(cè)定.實(shí)驗(yàn)結(jié)果以熒光素酶活性和Renilla活性的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 20.00進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.計(jì)量資料以mean±SD表示, 兩組比較行t檢驗(yàn), 多組間比較采用單因素方差分析, 以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 miR-637在GC組織和癌旁組織中的表達(dá) qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果(圖1)顯示, 與癌旁組織相比, GC組織中miR-637的表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05).可見(jiàn), miR-637在GC組織中低表達(dá).

2.2 過(guò)表達(dá)miR-637對(duì)GC細(xì)胞SGC-7901遷移、侵襲的影響 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果(圖2A)顯示, 與miR-NC組相比,miR-637組細(xì)胞SGC-7901中miR-637表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05).Transwell法檢測(cè)結(jié)果(圖2B、C)顯示, 與miRNC組相比, miR-637組細(xì)胞SGC-7901遷移、侵襲數(shù)量顯著降低(P＜0.05).Western blot檢測(cè)結(jié)果(圖2D、E)顯示, 與miR-NC組相比, miR-637組細(xì)胞SGC-7901中上皮鈣黏蛋白(epithelial cadherin, E-cadherin)表達(dá)水平顯著升高, MMP-2表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05).可見(jiàn), 過(guò)表達(dá)miR-637抑制GC細(xì)胞SGC-7901遷移、侵襲.

2.3 過(guò)表達(dá)miR-637對(duì)GC細(xì)胞SGC-7901凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果(圖3A、B)顯示, 與miR-NC組相比,miR-637組細(xì)胞SGC-7901的凋亡率顯著升高(P＜0.05).Western blot檢測(cè)結(jié)果(圖3C、D)顯示, 與miR-NC組相比, miR-637組細(xì)胞SGC-7901中Bax表達(dá)水平顯著升高,Bcl-2表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05).可見(jiàn), 過(guò)表達(dá)miR-637促進(jìn)GC細(xì)胞SGC-7901凋亡.

以電力系統(tǒng)、天然氣系統(tǒng)以及可再生能源系統(tǒng)等多種能源網(wǎng)絡(luò)耦合互聯(lián)形成的多能互補(bǔ)綜合能源系統(tǒng)集結(jié)整合了不同能源網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)滿(mǎn)足了區(qū)域內(nèi)用戶(hù)電、熱、冷、氣等多種能源需求，使用戶(hù)能源需求與各種能源系統(tǒng)的關(guān)聯(lián)度都大大增強(qiáng)，具有更高的能源利用率和供能可靠性。如何協(xié)調(diào)不同的能源系統(tǒng)，充分發(fā)揮綜合能源的多能協(xié)同特性來(lái)提高系統(tǒng)運(yùn)行的經(jīng)濟(jì)性、環(huán)保性、節(jié)能性等性能是一個(gè)重要的研究方向。

2.4 miR-637靶向、調(diào)控ERBB3的表達(dá) 通過(guò)starbase網(wǎng)站預(yù)測(cè)到ERBB3與miR-637存在結(jié)合位點(diǎn)(圖4A).熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖4B)顯示, 相較于miRNC組, miR-637組WT-ERBB3GC細(xì)胞SGC-7901的熒光素酶活性顯著降低(P＜0.05)； 而MUT-ERBB3GC細(xì)胞SGC-7901的熒光素酶活性差異不顯著.Western blot檢測(cè)結(jié)果(圖4C、D)顯示, 相較于miR-NC組, miR-637組GC細(xì)胞SGC-7901中ERBB3表達(dá)水平顯著降低； 相較于antimiR-NC組, anti- miR-637GC細(xì)胞SGC-7901中ERBB3表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05).可見(jiàn), miR-637可靶向調(diào)控ERBB3的表達(dá).

2.5 抑制ERBB3對(duì)GC細(xì)胞SGC-7901遷移、侵襲及凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果(圖5A)顯示, 與si-NC組相比, si-ERBB3組細(xì)胞SGC-7901的凋亡率顯著升高(P＜0.05).Transwell法檢測(cè)結(jié)果(圖5B)顯示, 與si-NC組相比, si-ERBB3組細(xì)胞SGC-7901遷移、侵襲數(shù)量顯著降低(P＜0.05).Western blot檢測(cè)結(jié)果(圖5C、D)顯示, 與si-NC組相比, si-ERBB3組細(xì)胞SGC-7901中E-cadherin、Bax表達(dá)水平顯著升高, ERBB3、MMP-2、Bcl-2表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05).可見(jiàn), 抑制ERBB3抑制細(xì)胞SGC-7901遷移、侵襲, 促進(jìn)細(xì)胞凋亡.

2.6 過(guò)表達(dá)ERBB3能逆轉(zhuǎn)miR-637對(duì)GC細(xì)胞SGC-7901遷移、侵襲及凋亡的作用 qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果(圖6A)顯示, 與miR-NC組相比, miR-637組細(xì)胞SGC-7901中miR-637表達(dá)水平顯著升高； 與miR-637+pcDNA3.1組相比,miR-637+pcDNA3.1-ERBB3組miR-637表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05).流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果(圖6B)顯示, 與miRNC組相比, miR-637組細(xì)胞SGC-7901的凋亡率顯著升高； 與miR-NC組相比, miR-637組細(xì)胞SGC-7901的凋亡率顯著降低(P＜0.05).Transwell法檢測(cè)結(jié)果(圖6C)顯示,與miR-NC組相比, miR-637組細(xì)胞SGC-7901遷移、侵襲數(shù)量顯著降低； 與miR-637+pcDNA3.1組相比, miR-637+pcDNA3.1-ERBB3組細(xì)胞SGC-7901遷移、侵襲數(shù)量顯著升高(P＜0.05).Western blot檢測(cè)結(jié)果(圖6D、E)顯示, 與miR-NC組相比, miR-637組細(xì)胞SGC-7901中E-cadherin、Bax表達(dá)水平顯著升高, ERBB3、MMP-2、Bcl-2表達(dá)水平顯著降低； 與miR-637+pcDNA3.1組相比, miR-637+pcDNA3.1-ERBB3組細(xì)胞SGC-7901中E-cadherin、Bax表達(dá)水平顯著降低, ERBB3、MMP-2、Bcl-2表達(dá)水平顯著升高(P＜0.05).可見(jiàn), 過(guò)表達(dá)ERBB3能逆轉(zhuǎn)miR-637對(duì)細(xì)胞SGC-7901遷移、侵襲抑制及凋亡促進(jìn)的作用.

3 討論

GC是發(fā)病率和死亡率較高的的惡性腫瘤, 其異質(zhì)性高,易轉(zhuǎn)移, 治療預(yù)后效果差[9].研究其發(fā)病的分子機(jī)制對(duì)于治療GC具有重要意義.miRNA雖不編碼蛋白, 但廣泛參與細(xì)胞的各個(gè)生理過(guò)程, 與腫瘤的發(fā)生發(fā)展也密切相關(guān), 大量研究證實(shí)miRNA通過(guò)參與腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移、侵襲以及凋亡等過(guò)程從而調(diào)控GC進(jìn)程[10].miR-637通過(guò)靶向調(diào)控CTSB從而顯著降低了膽管癌QBC939細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲能力, 并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[11].上調(diào)miR-637抑制乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞的增殖, 侵襲和遷移[12].強(qiáng)制過(guò)表達(dá)miR-637顯著抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13].抑制miR-637轉(zhuǎn)錄還促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移[14].在本研究中也發(fā)現(xiàn)了相一致的研究結(jié)果, 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示GC組織中miR-637的表達(dá)水平顯著降低, 過(guò)表達(dá)miR-637可抑制GC細(xì)胞SGC-7901遷移、侵襲, 促進(jìn)細(xì)胞凋亡.

只有不到20%的創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目和創(chuàng)業(yè)實(shí)踐項(xiàng)目質(zhì)量高，僅僅有20%的學(xué)生和29%的老師認(rèn)為目前創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目能夠落地。創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目轉(zhuǎn)化和落地率偏低目前高校創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)教育中存在的突出問(wèn)題。從總體上來(lái)看，目前高校許多創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目多為傳統(tǒng)項(xiàng)目，科技含量不高，即使能夠落地，也難以持續(xù)經(jīng)營(yíng)。少數(shù)科技含量較高的創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目，存在科技成果對(duì)接能力不足的問(wèn)題，難以將技術(shù)轉(zhuǎn)化成落地的創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目(周瓊瓊，2015)。

ERBB3是一種促增殖基因, 可形成二聚體, 激活下游信號(hào)傳導(dǎo)通路, 從而調(diào)控腫瘤的增殖、遷移、粘附、凋亡和血管生成等過(guò)程[15].miR-148a-3p可以直接調(diào)控ERBB3基因的表達(dá), 下調(diào)ERBB3能顯著抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖、體外克隆形成、促進(jìn)G1期周期阻滯,抑制遷移和侵襲能力[16].下調(diào)ERBB3通過(guò)抑制MTK-1的表達(dá)來(lái)抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲, 從而抑制腫瘤的發(fā)展[17].miR-143/145負(fù)調(diào)控ERBB3基因表達(dá)水平從而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖及遷移能力[18].本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 抑制ERBB3表達(dá)可抑制GC細(xì)胞SGC-7901遷移、侵襲, 促進(jìn)細(xì)胞凋亡.且ERBB3受miR-637靶向調(diào)控, 過(guò)表達(dá)ERBB3能逆轉(zhuǎn)miR-637對(duì)GC細(xì)胞SGC-7901遷移、侵襲抑制和凋亡促進(jìn)的作用.過(guò)表達(dá)miR-637和E-cadherin是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程中一種主要的蛋白標(biāo)志物, E-cadherin表達(dá)減少或缺失是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的重要因素[19].MMP-2是腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲過(guò)程中重要的調(diào)控分子, MMP-2通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)、促進(jìn)新生血管形成、調(diào)節(jié)細(xì)胞間的粘附等機(jī)制,促使腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移[20].過(guò)表達(dá)miR-637和ERBB3抑制表達(dá)均抑制MMP-2的表達(dá), 促進(jìn)E-cadherin的表達(dá),說(shuō)明其抑制了細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移.而B(niǎo)cl-2和Bax是細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白, Bcl-2是抑凋亡因子, Bax是促凋亡因子, 過(guò)表達(dá)miR-637和抑制ERBB3表達(dá)均抑制了Bcl-2的表達(dá),促進(jìn)Bax的表達(dá)； 說(shuō)明其促進(jìn)了細(xì)胞凋亡.且進(jìn)一步的研究也發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-637和抑制ERBB3表達(dá)細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量顯著降低, 細(xì)胞凋亡率顯著升高.且miR-637靶向調(diào)控ERBB3, 提示miR-637對(duì)GC細(xì)胞遷移、侵襲及凋亡的影響是通過(guò)調(diào)控ERBB3的表達(dá)進(jìn)而影響遷移、侵襲及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的.

圖1 miR-637的表達(dá).與癌旁組織組比較, aP＜0.05.

圖2 過(guò)表達(dá)miR-637對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901遷移、侵襲的影響.A：miR-637的表達(dá)； B、C：Transwell法檢測(cè)結(jié)果； D、E：Western blot檢測(cè)結(jié)果.與miR-NC組比較, aP＜0.05.E-cadherin：上皮鈣黏蛋白； MMP-2：基質(zhì)金屬蛋白酶2.

圖3 過(guò)表達(dá)miR-637對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901凋亡的影響.A、B：流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果； C、D：Western blot檢測(cè)結(jié)果.與miR-NC組比較,aP＜0.05.Bcl-2：B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2； Bax：Bcl-2相關(guān)X蛋白.

圖4 miR-637靶向、調(diào)控ERBB3.A：ERBB3的3’UTR含有miR-637的互補(bǔ)序列； B：雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)； C, D：miR-637調(diào)控ERBB3的表達(dá).與miR-NC組比較, aP＜0.05； 與anti-miR-NC組比較, cP＜0.05.ERBB3：人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體3.

圖5 抑制ERBB3對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901遷移、侵襲及凋亡的影響.A：抑制ERBB3對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901凋亡的影響； B：抑制ERBB3對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901遷移、侵襲的影響； C、D：抑制ERBB3對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901遷移、侵襲及凋亡蛋白表達(dá)的影響.與si-NC組比較, aP＜0.05.ERBB3：人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體3； E-cadherin：上皮鈣黏蛋白； MMP-2：基質(zhì)金屬蛋白酶2； Bcl-2：B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2； Bax：Bcl-2相關(guān)X蛋白.

圖6 過(guò)表達(dá)ERBB3能逆轉(zhuǎn)miR-637對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901遷移、侵襲及凋亡的影響.A：miR-637的表達(dá)； B：過(guò)表達(dá)ERBB3能逆轉(zhuǎn)miR-637對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901凋亡的影響； C：過(guò)表達(dá)ERBB3能逆轉(zhuǎn)miR-637對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901遷移、侵襲的影響； D、E：過(guò)表達(dá)ERBB3能逆轉(zhuǎn)miR-637對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901遷移、侵襲及凋亡蛋白表達(dá)的影響.與miR-NC組比較, aP＜0.05； 與miR-637+pcDNA3.1組比較, cP＜0.05.ERBB3：人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體3； E-cadherin：上皮鈣黏蛋白； MMP-2：基質(zhì)金屬蛋白酶2； Bcl-2：B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2； Bax：Bcl-2相關(guān)X蛋白.

綜上所述, miR-637可抑制GC細(xì)胞SGC-7901遷移、侵襲, 促進(jìn)細(xì)胞凋亡, 其機(jī)制可能與靶向下調(diào)ERBB3及遷移、侵襲及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān), 將可為GC的預(yù)防和治療提供新靶點(diǎn).本實(shí)驗(yàn)?zāi)壳皟H在體外細(xì)胞層面進(jìn)行實(shí)驗(yàn), 下一步需要在類(lèi)似體內(nèi)環(huán)境的動(dòng)物模型中進(jìn)行研究驗(yàn)證, 為以后可能的臨床應(yīng)用提供理論參考依據(jù).

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

胃癌(gastric cancer, GC)是全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率、死亡率較高, 手術(shù)、放化療是其主要治療手段, 但術(shù)后易復(fù)發(fā), 放化療副作用高且易產(chǎn)生耐藥性使得治療效果不佳, 靶向治療的出現(xiàn)給GC治療提供了新方向.miR-637參與了結(jié)腸癌、膽管癌、甲狀腺癌、卵巢癌等多種癌癥的進(jìn)展, 具有抑癌作用, 但miR-637對(duì)GC是的發(fā)生發(fā)展的影響和機(jī)制尚不清楚.

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

本文主要研究miR-637對(duì)GC細(xì)胞SGC-7901遷移、侵襲和凋亡的影響, 并研究其作用機(jī)制是否與人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體3(human epidermal growth factor receptor 3,HER3/ERBB3)有關(guān), 為GC的分子靶向治療及預(yù)后等提供可能的靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物.

闡明miR-637對(duì)GC細(xì)胞SGC-7901遷移、侵襲和凋亡的影響及其分子機(jī)制, 旨在為miR-637在GC靶向治療及分子靶點(diǎn)藥物研發(fā)中提供理論基礎(chǔ).

實(shí)驗(yàn)方法

體外培養(yǎng)人GC細(xì)胞SGC-7901, 分別采用qRT-PCR檢測(cè)miR-637的表達(dá)水平； Western blot檢測(cè)遷移、侵襲和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)； 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡； 過(guò)表達(dá)miR-637和抑制ERBB3表達(dá)后, 觀(guān)察其對(duì)GC細(xì)胞遷移、侵襲和凋亡的影響, 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-637和ERBB3的靶向關(guān)系.同時(shí)過(guò)表達(dá)miR-637和ERBB3, 觀(guān)察ERBB3對(duì)過(guò)表達(dá)miR-637的GC細(xì)胞遷移、侵襲和凋亡的影響.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

miR-637可抑制GC細(xì)胞SGC-7901遷移、侵襲, 促進(jìn)細(xì)胞凋亡, 且miR-637靶向負(fù)調(diào)控ERBB3, 過(guò)表達(dá)ERBB3逆轉(zhuǎn)了miR-637對(duì)GC細(xì)胞遷移、侵襲抑制和凋亡促進(jìn)作用.達(dá)到了本實(shí)驗(yàn)的目的, 對(duì)該領(lǐng)域GC的發(fā)病進(jìn)展機(jī)制又增加了相關(guān)的理論依據(jù), 以后可以進(jìn)一步在臨床方面進(jìn)行研究應(yīng)用.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

新發(fā)現(xiàn)：miR-637靶向負(fù)調(diào)控ERBB3； 過(guò)表達(dá)miR-637和抑制ERBB3表達(dá)均可抑制GC細(xì)胞遷移和侵襲、促進(jìn)細(xì)胞凋亡； 新的理論：miR-637可以通過(guò)調(diào)控ERBB3影響GC遷移、侵襲和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)進(jìn)而影響GC的進(jìn)展.從miRNA和其靶基因角度去研究其對(duì)GC惡性生物學(xué)行為的影響, 拓寬了研究的范圍, 不同miRNA影響急性胰腺炎的進(jìn)展的機(jī)制不同, 增加了其治療的靶點(diǎn).不同的miRNA在miR-637中的表達(dá)及其作用機(jī)制不同,可通過(guò)研究不同的miRNA及其靶基因?qū)C的影響可拓展研究思路.miR-637通過(guò)靶向負(fù)調(diào)控ERBB3影響GC細(xì)胞遷移、侵襲和凋亡.通過(guò)上調(diào)或下調(diào)miRNA進(jìn)而影響其靶基因的表達(dá)可以影響GC的進(jìn)展.對(duì)未來(lái)臨床診斷和治療提供了新的標(biāo)志物和新靶點(diǎn).

展望前景

僅在體外細(xì)胞的理論層面上進(jìn)行研究, 需要進(jìn)一步在臨床上進(jìn)行相關(guān)研究和應(yīng)用.未來(lái)進(jìn)一步深入研究miR-637和ERBB3對(duì)治療GC的影響及其可能會(huì)產(chǎn)生的其他現(xiàn)象及是否會(huì)有副作用； 以及進(jìn)一步向臨床方向的研究靠攏.用更接近于真實(shí)GC的小鼠或其他受體為模型, 在其基礎(chǔ)上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)治療, 對(duì)其反應(yīng)狀況進(jìn)行觀(guān)察研究.