miR-10a-5p敲低通過(guò)靶向THBS2抑制胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移

任玲玲, 王立明, 朱雅碧

任玲玲, 王立明, 朱雅碧, 麗水市人民醫(yī)院消化內(nèi)科 浙江省麗水市323000

核心提要：miR-10a-5p在胃癌中高表達(dá).miR-10a-5p敲低通過(guò)靶向THBS2抑制MGC-803和AGS細(xì)胞的增殖, 集落形成, 遷移和侵襲.

0 引言

胃癌(gastric cancer, GC)是一種常見(jiàn)的消化腫瘤[1].近年來(lái)我國(guó)GC的發(fā)病率呈增高趨勢(shì)[2].探索GC的進(jìn)展機(jī)制對(duì)于開(kāi)發(fā)新的治療方法至關(guān)重要.miRNA是短的(約19-24 nt)非編碼單鏈RNA, 可通過(guò)調(diào)節(jié)其靶基因參與多種生物過(guò)程, 如增殖, 分化, 凋亡, 發(fā)育, 血管生成和免疫應(yīng)答[3,4].目前, miRNA在腫瘤進(jìn)展中的作用也得到了廣泛的研究, 如, miR-10b和miR-126分別通過(guò)調(diào)節(jié)同源盒蛋白b3(Homeobox b3, HOXB3)和sry相關(guān)HMG盒蛋白2(sry-related HMG box 2, Sox2)表達(dá)來(lái)控制子宮內(nèi)膜癌和肝細(xì)胞癌的細(xì)胞凋亡, 增殖, 遷移和侵襲[5,6].據(jù)報(bào)道[7,8], miR-137, miR-421, miR-337-3p和miR-1等許多miRNAs可調(diào)節(jié)GC的發(fā)展.因此, 發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)GC細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移能力的miRNAs是至關(guān)重要的, 這將為治療該疾病提供有價(jià)值的靶標(biāo).有文獻(xiàn)[9,10]發(fā)現(xiàn), 肝癌組織和肝癌細(xì)胞中miR-10a-5p高表達(dá), 在肝癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-10a-5p可影響肝癌細(xì)胞增殖與遷移.而miR-10a-5p在GC中作用報(bào)道尚少.

因此, 本研究旨在探討miR-10a-5p在GC中的表達(dá)以及其對(duì)GC細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的影響及其分子機(jī)制, 期望基于miR-10a-5p功能極其分子機(jī)制能為GC的治療提供有用的線索.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑：胎牛血清(FBS), Opti-MEM培養(yǎng)基(Gibco公司, 美國(guó))； RPMI-1640培養(yǎng)基, Lipofectamine 2000試劑和SYBER綠色探針(Invitrogen公司, 美國(guó))；Trizol試劑(Sigma公司, 美國(guó))； AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa公司, 日本)； 血小板反應(yīng)蛋白2(thrombospondin 2,THBS2)抗體和GAPDH抗體(Santa Cruz公司, 美國(guó))；miR-10a-5p抑制劑(miR-10a-5p inhibitor), miRNA陰性對(duì)照(NC), 人THBS2全長(zhǎng)cDNA序列和對(duì)照亂碼序列(上海吉?jiǎng)P基因公司)； CCK-8試劑盒, RIPA裂解緩沖液,BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒和ECL化學(xué)發(fā)光試劑(上海碧云天生物技術(shù)公司)； 快速點(diǎn)定向突變?cè)噭┖?Agilent公司, 美國(guó))； 雙熒光素酶報(bào)告分析試劑盒(Promega公司, 美國(guó)).

1.1.2 人GC組織和細(xì)胞系：在浙江省麗水市人民醫(yī)院隨機(jī)選取10例接受GC切除術(shù)的GC患者, 所有患者均提供書(shū)面同意, 本研究的各個(gè)方面均經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(No.201812006).收集GC組織和癌旁正常組織, 將組織儲(chǔ)存在-80 ℃?zhèn)溆?人正常胃上皮細(xì)胞(GES)和GC細(xì)胞(MGC-803和AGS)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所.將細(xì)胞在補(bǔ)充有10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中在5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

1.2 方法

1.2.1 miR-10a-5p-inhibitor轉(zhuǎn)染：將GC細(xì)胞(MGC-803和AGS)接種在6孔板中, 用補(bǔ)充有10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng), 當(dāng)細(xì)胞約60%-70%匯合時(shí), 更換無(wú)血清Opti-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)6 h, 用Lipofectamine 2000試劑分別將miR-10a-5p inhibitor和NC轉(zhuǎn)染入細(xì)胞.6 h后, 更換為補(bǔ)充有10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基, 繼續(xù)培養(yǎng)48 h后, 收集細(xì)胞.

1.2.2 共轉(zhuǎn)染細(xì)胞系構(gòu)建：將人全長(zhǎng)THBS2 cDNA序列和亂碼序列克隆入pcDNA3.1質(zhì)粒, 并分別構(gòu)建pcDNATHBS2和pcDNA-Con質(zhì)粒.使用Lipofectamine 2000試劑分別將NC+pcDNA-Con, miR-10a-5p inhibitor+pcDNACon和miR-10a-5p inhibitor+pcDNA-THBS2共轉(zhuǎn)染入MGC-803細(xì)胞.

1.2.3 RNA提取和RT-qPCR：使用Trizol試劑分別從GC組織, 癌旁組織, GES細(xì)胞, MGC-803細(xì)胞和AGS細(xì)胞中提取總RNA.使用光度計(jì)(Eppendorf, 德國(guó))測(cè)定總RNA濃度.使用oligo dT和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶在反應(yīng)中將1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA.SYBER綠色探針和miR-10a-5p, THBS2和GAPDH的特異性引物和cDNA使用Applied Biosystems 7300檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, RT-qPCR)反應(yīng).反應(yīng)條件為95 ℃溫育5 min, 然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)：95 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s和72 ℃ 30 s.引物的序列：miR-10a-5p F：5’-CGCTACCCTGTAGATCCGAA-3’,R：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’； THBS2 F：5’-GGGGACACTTTGGACCTCAAC-3’, R：5’-GCAGC CCACATACAGGCTA-3’； GAPDH F：5’-ACAACTTTG GTATCGTGGAAGG-3’, R：5’-GCCATCACGCCACAG TTTC-3’； U6 F：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’, R：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’.使用2-△△CT法計(jì)算miR-10a-5p相對(duì)于內(nèi)部對(duì)照U6的表達(dá)量和THBS2 mRNA的相對(duì)于內(nèi)部對(duì)照GAPDH mRNA的表達(dá)量.實(shí)驗(yàn)一式三份獨(dú)立進(jìn)行.

1.2.4 細(xì)胞增殖測(cè)定：將僅轉(zhuǎn)染miR-10a-inhibitor或NC的MGC-803或AGS細(xì)胞和共轉(zhuǎn)染的 MGC-803細(xì)胞接種到96孔板, 每孔接種5000個(gè)細(xì)胞, 繼續(xù)培養(yǎng)24和48 h.每孔添加10 μL CCK-8檢測(cè)試劑, 孵育2 h后, 用酶標(biāo)儀檢測(cè)(波長(zhǎng)450 nm)吸光度.實(shí)驗(yàn)一式三份獨(dú)立進(jìn)行.

1.2.5 集落形成測(cè)定：將僅轉(zhuǎn)染miR-10a-5p inhibitor或NC的MGC-803或AGS細(xì)胞和共轉(zhuǎn)染的MGC-803細(xì)胞接種到24孔板中并孵育12 d后, 用4%多聚甲醛固定細(xì)胞并用結(jié)晶紫染色, 對(duì)集落進(jìn)行計(jì)數(shù)并拍照.實(shí)驗(yàn)一式三份獨(dú)立進(jìn)行.

1.2.6 細(xì)胞遷移與侵襲測(cè)定：使用Transwell法檢測(cè)細(xì)胞的遷移與侵襲.收集僅轉(zhuǎn)染miR-10a-5p inhibitor或NC的MGC-803或AGS細(xì)胞和共轉(zhuǎn)染的MGC-803細(xì)胞, 用無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸浮液.將100 μL細(xì)胞懸浮液以5×105細(xì)胞/mL的密度接種到Transwell的上室(matrigel基質(zhì)膠包被濾膜用于侵襲測(cè)定； 僅濾膜用于遷移測(cè)定)中, 將500 μL含補(bǔ)充有10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基加入底室.孵育24后, 用PBS除去未通過(guò)濾膜的細(xì)胞, 用95%乙醇固定5 min, 結(jié)晶紫染色.在顯微鏡(200×)下對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)并拍照.實(shí)驗(yàn)一式三份獨(dú)立進(jìn)行.

1.2.7 蛋白提取和Western blot：使用RIPA裂解緩沖液從GC組織, 癌旁組織, GES細(xì)胞, MGC-803細(xì)胞, AGS細(xì)胞和已轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中提取總蛋白.通過(guò)10%SDS-PAGE分離蛋白并轉(zhuǎn)至PVDF膜.在室溫下用5%脫脂乳封閉1 h后, 將膜用一抗(THBS2和GAPDH)在4 ℃下免疫反應(yīng)過(guò)夜, 在TBST中洗滌三次, 然后在室溫下與二抗孵育1 h.用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)條帶信號(hào).使用Image J軟件量化每個(gè)條帶的強(qiáng)度.通過(guò)用GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化THBS2蛋白的相對(duì)表達(dá).

1.2.8 熒光素酶活性測(cè)定：TargetScan在線軟件預(yù)測(cè)的與miR-10a-5p具有結(jié)合效應(yīng)的THBS2 3’UTR區(qū)域, 根據(jù)快速點(diǎn)定向突變?cè)噭┖姓f(shuō)明書(shū)步驟, 對(duì)該區(qū)域進(jìn)行進(jìn)行點(diǎn)突變, 并將THBS2 3’UTR點(diǎn)突變后的序列克隆至螢火蟲(chóng)熒光素酶基因的上游, 構(gòu)建pGL3-Mut-THBS2 3’UTR熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒.用同樣的方法, 將野生型THBS2的序列構(gòu)建pGL3-WT-THBS2 3’UTR熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒.用Lipofectamine 2000試劑將miR-10a-5p inhibitor, NC, WTTHBS2 3’UTR, Mut-THBS2 3’UTR和海腎熒光素酶基因(phRL-TK)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到MGC-803細(xì)胞中.轉(zhuǎn)染48 h后,通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告分析試劑盒分析熒光素酶活性.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用mean±SD表示, 采用SPSS 18.0軟件將實(shí)驗(yàn)中所得的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.多組之間比較采用單因素方差分析.以P＜0.05為界定差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 miR-10a-5p在GC組織和GC細(xì)胞中表達(dá)情況 如圖1A顯示, 與癌旁正常組織相比, miR-10a-5p在GC中的表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.05).在細(xì)胞中(圖1B), 與GES細(xì)胞比較,miR-10a-5p在GC細(xì)胞(MGC-803和AGS)中也顯著上調(diào)(P＜0.05).

2.2 miR-10a-5p對(duì)GC細(xì)胞增殖, 集落形成, 遷移和侵襲的影響 將miR-10a-5p-inhibitor轉(zhuǎn)染到GC細(xì)胞(MGC-803和AGS)中, 抑制細(xì)胞中miR-10a-5p的表達(dá)(圖2)后, 檢測(cè)miR-10a-5p敲低后細(xì)胞的增殖, 集落形成, 遷移和侵襲,結(jié)果顯示, 相對(duì)于NC組, 轉(zhuǎn)染 miR-10a-5p-inhibitor組中細(xì)胞的增殖(圖3A、B), 集落數(shù)(圖3C、D), 遷移細(xì)胞數(shù)(圖3E、F)和侵襲細(xì)胞數(shù)(圖3G、H)均顯著降低(P＜0.05或P＜0.01).

2.3 mi-10a-5p與THBS2基因的靶點(diǎn)驗(yàn)證 在組織中, 相對(duì)于癌旁正常組織, GC組織中THBS2的蛋白和mRNA的表達(dá)水平均顯著降低(P＜0.05)(圖4A、B).在細(xì)胞中,相對(duì)于GES細(xì)胞, MGC-803細(xì)胞和AGS細(xì)胞中THBS2的蛋白和mRNA的表達(dá)水平也降低(P＜0.05)(圖4C、D).TargetScan在線軟件結(jié)果顯示, THBS2 3’UTR預(yù)測(cè)存在miR-10a-5p的結(jié)合序列(圖4E)； 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示(圖4F), 在WT組中, miR-10a-5p inhibitor組的THBS2相對(duì)熒光素酶活性較NC組顯著增加(P＜0.05)； 而Mut組中, 兩組的THBS2相對(duì)熒光素酶活性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, 證明 THBS2是miR-10a-5p的靶基因.結(jié)果顯示, 相對(duì)于NC組, miR-10a-5p inhibitor組THBS2蛋白和mRNA水平均顯著增加(P＜0.05)(圖4G、H).綜上所述, 在人GC細(xì)胞系中, THBS2是miR-10a-5p的靶基因.

2.4 miR-10a-5p通過(guò)靶向THBS2影響MGC-803細(xì)胞的增殖, 集落形成, 遷移和侵襲 將miRNA-10a-5p inhibitor和pcDNA-THBS2共轉(zhuǎn)入MGC-803細(xì)胞, 檢測(cè)過(guò)表達(dá)THBS2(圖5A、B)對(duì)已轉(zhuǎn)染miR-10a-5p inhibitor細(xì)胞的增殖, 集落形成, 遷移和侵襲的影響, 結(jié)果顯示, 相對(duì)于轉(zhuǎn)染miR-10a-5p inhibitor+pcDNA-Con組, 轉(zhuǎn)染miR-10a-5p inhibitor+pcDNA-THBS2組中細(xì)胞的增殖(圖5C), 集落數(shù)(圖5D、E), 遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)(圖5F-H)均顯著增加(P＜0.05或P＜0.01), 說(shuō)明miR-10a-5p敲低通過(guò)靶向THBS2抑制人GC細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移.

3 討論

GC是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因, 由于缺乏特異性和敏感性的生物標(biāo)志物, 總體5年生存率低于20%[11,12].因此, 對(duì)GC患者迫切需要一種可靠有效的治療方法.

文獻(xiàn)[13]報(bào)道, 在人體中約30%的基因表達(dá)受miRNAs控制, 廣泛地參與細(xì)胞發(fā)育和生理過(guò)程.miRNAs的表達(dá)經(jīng)常在腫瘤中失調(diào)[14,15].此外, miRNAs在腫瘤的診斷和治療中均發(fā)揮了舉足輕重的作用[16,17].其中, miR-10a-5p可影響肝癌[9]和乳頭狀甲狀腺癌[18]等癌癥的進(jìn)展.miR-10a-5p可通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶8相互作用蛋白1(mitogen-activated protein kinase 8 interacting protein 1, MAPK8IP1)促進(jìn)GC轉(zhuǎn)移[19].而miRNA的作用是多樣的, 機(jī)制也是復(fù)雜的, 因此, miR-10a-5p在GC中的具體作用和機(jī)制仍需進(jìn)一步鑒定.在本研究中, 我們采用RT-qPCR檢測(cè)了GC組織和GC細(xì)胞中miR-10a-5p的表達(dá)情況, 結(jié)果顯示, miR-10a-5p在GC組織和GC細(xì)胞系中表達(dá)均顯著上調(diào).接下來(lái), 我們將miR-10a-5p-inhibitor轉(zhuǎn)染入GC細(xì)胞MGC-803和AGS中, 結(jié)果顯示, 敲低miR-10a-5p能抑制 MGC-803和AGS細(xì)胞的增殖, 集落形成,遷移與侵襲.

miRNAs可通過(guò)靶基因發(fā)揮后續(xù)生物學(xué)作用[20].我們采用TargetScan在線軟件篩選出THBS2為miR-10a-5p的潛在靶點(diǎn)之一.THBS2是基質(zhì)細(xì)胞Ca2+結(jié)合糖蛋白家族的成員之一, 發(fā)現(xiàn)其與多種細(xì)胞受體, 生長(zhǎng)因子和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)蛋白相互作用, 從而導(dǎo)致其在細(xì)胞粘附, 增殖和細(xì)胞凋亡中發(fā)揮功能[21].THBS2在腫瘤中的表達(dá)與血管分布, 進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的減少有關(guān)[22].有研究[23]發(fā)現(xiàn), THBS2水平較高的GC患者預(yù)后較好, 而THBS2表達(dá)減少與較差的GC組織學(xué)分級(jí)和預(yù)后不良相關(guān).然而, 很少有研究探討GC中miR-10a-5p與THBS2的關(guān)系.我們采用雙熒光素酶基因證明了THBS2是miR-10a-5p的靶基因.THBS2高表達(dá)有助于GC的進(jìn)展[23].在本實(shí)驗(yàn)中, 敲低miR-10a-5p能促進(jìn)THBS2表達(dá)；我們進(jìn)一步將miR-10a-5p inhibitor和THBS2共轉(zhuǎn)染入MGC-803細(xì)胞, 結(jié)果顯示, 轉(zhuǎn)染THBS2后逆轉(zhuǎn)了miR-10a-5p敲低對(duì)MGC-803細(xì)胞的增殖, 集落形成, 遷移與侵襲的抑制作用.總之, 我們的數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明在GC中THBS2是miR-10a-5p的功能靶標(biāo).

本研究依然存在不足之處：比如收集的臨床樣本量相對(duì)少, 造成無(wú)法分析miR-10a-5p與GC臨床特征(臨床分期、腫瘤分化、腫瘤大小、腫瘤位置和是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)的關(guān)系； THBS2下游與GC細(xì)胞生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移相關(guān)的具體信號(hào)通路尚未明了.這些未知的研究方向值得我們后期持續(xù)研究.

圖1 miR-10a-5p在GC組織和GC細(xì)胞中表達(dá)增加.A：miR-10a-5p在癌旁正常組織和GC組織中表達(dá)水平, 與癌旁正常組織相比, aP＜0.05, n =10； B：miR-10a-5p在正常胃上皮細(xì)胞GES和GC細(xì)胞MGC-803和AGS中表達(dá)水平, 與GES細(xì)胞相比, cP＜0.05, n = 3.GN：癌旁正常組織； GC：胃癌.

圖2 在胃癌細(xì)胞MGC-803和AGS中, miR-10a-5p inhibitor的轉(zhuǎn)染效率鑒定.A：MGC-803細(xì)胞中； B：AGS細(xì)胞中.與NC組相比, aP＜0.05, n = 3.

圖3 miR-10a-5p敲低抑制胃癌細(xì)胞增殖, 集落形成, 侵襲和侵襲.A, B：CCK-8法檢測(cè)MGC-803細(xì)胞(A)和AGS細(xì)胞(B)的細(xì)胞活性, 與NC組相比, aP＜0.05, bP＜0.01, n = 3； C, D：集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MGC-803細(xì)胞和AGS細(xì)胞的集落形成, 與NC組相比, cP＜0.05, n = 3； E、F：Transwell法檢測(cè)MGC-803細(xì)胞和AGS細(xì)胞的遷移能力, 與NC組相比, eP＜0.05, n = 3； G、H：Transwell法檢測(cè)MGC-803細(xì)胞和AGS細(xì)胞的侵襲能力, 與NC組相比, gP＜0.05, n = 3.

圖4 THBS2是miR-10a-5p的靶基因.A：Western blot法檢測(cè)GN和GC組織中THBS2蛋白表達(dá)； B：RT-qPCR法檢測(cè)GN和GC組織中THBS2 mRNA表達(dá), 與癌旁正常組織相比, aP＜0.05, n = 10； C：Western blot法檢測(cè)GES, MGC-803和AGS細(xì)胞中THBS2蛋白表達(dá)； D：RT-qPCR法檢測(cè)GES, MGC-803和AGS細(xì)胞中THBS2 mRNA表達(dá), 與GES細(xì)胞相比, cP＜0.05, n = 3； E：TargetScan軟件預(yù)測(cè)的THBS2 3’UTR與miR-10a-5p結(jié)合序列(紅色)和點(diǎn)突變序列(下)； F：雙熒光素酶基因法THBS2相對(duì)熒光酶活性, 與NC組相比, eP＜0.05, n = 3； G：Western blot法檢測(cè)敲低miR-10a-5p的MGC-803細(xì)胞中THBS2蛋白表達(dá)； H：RT-qPCR法檢測(cè)敲低miR-10a-5p的MGC-803細(xì)胞中THBS2 mRNA表達(dá), 與NC組相比, gP＜0.05, n = 3.RT-qPCR：實(shí)時(shí)熒光定量PCR； GC：胃癌.

綜上所述, 我們目前的結(jié)果顯示, 敲低miR-10a-5p通過(guò)上調(diào)靶基因THBS2表達(dá)來(lái)發(fā)揮抑制GC細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的能力, miR-10a-5p可能是治療GC的潛在靶點(diǎn).

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

我國(guó)胃癌(gastric cancer, GC)的發(fā)病率呈逐年增加趨勢(shì)和低齡化趨勢(shì).而篩選影響GC進(jìn)展的生物學(xué)靶點(diǎn), 有助于對(duì)GC治療方法開(kāi)發(fā)提供線索.miRNAs在GC的發(fā)病和進(jìn)展中發(fā)揮重要作用.

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

miR-10a-5p在肝癌組織高表達(dá), 且其可促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移, 而miR-10a-5p對(duì)GC細(xì)胞增殖, 克隆集落形成,遷移與侵襲的作用尚不清楚.

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

本研究旨在檢測(cè)miR-10a-5p在GC組織和GC細(xì)胞的表達(dá), 并探索miR-10a-5p對(duì)GC細(xì)胞增殖, 克隆集落形成, 遷移與侵襲的影響, 并分析其中的機(jī)制.

圖5 過(guò)表達(dá)THBS2逆轉(zhuǎn)miR-10a-5p敲低對(duì)MGC-803細(xì)胞增殖, 集落形成, 遷移與侵襲的抑制作用.miR-10a-5p inhibitor和pcDNA-THBS2共轉(zhuǎn)染入MGC-803后, A：Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中THBS2蛋白表達(dá)； B：RT-qPCR法檢測(cè)細(xì)胞中THBS2 mRNA表達(dá), 與NC+pcDNA-Con組相比,aP＜0.05； 與miR-10a-5p inhibitor+pcDNA-Con組相比, cP＜0.05, n = 3； C：CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性, 與NC+pcDNA-Con組相比, aP＜0.05, bP＜0.01；與miR-10a-5p inhibitor+pcDNA-Con組相比, cP＜0.05, dP＜0.01, n = 3； D、E：集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的集落形成, 與NC+pcDNA-Con組相比,aP＜0.05； 與miR-10a-5p inhibitor+pcDNA-Con組相比, cP＜0.05, n = 3； F-H：Transwell法檢測(cè)細(xì)胞的遷移與侵襲能力； 與NC+pcDNA-Con組相比,aP＜0.05； 與miR-10a-5p inhibitor+pcDNA-Con組相比, cP＜0.05, n = 3.RT-qPCR：實(shí)時(shí)熒光定量PCR.

實(shí)驗(yàn)方法

用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, RT-qPCR)檢測(cè)miR-10a-5p在GC組織和細(xì)胞中表達(dá).用CCK-8法, 集落形成法和Transwell法評(píng)估m(xù)iR-10a-5p敲低對(duì)GC細(xì)胞增殖, 集落形成, 遷移和侵襲的影響.預(yù)測(cè)miR-10a-5p的靶基因, 并驗(yàn)證.最后, 檢測(cè)miR-10a-5p是否通過(guò)此靶基因在GC細(xì)胞上發(fā)揮作用.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

miR-10a-5p在GC組織和細(xì)胞中高表達(dá)； miR-10a-5p敲低能通過(guò)其靶基因THBS2發(fā)揮抑制GC細(xì)胞增殖.克隆形成, 遷移與侵襲的作用.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

抑制miR-10a-5p表達(dá)能通過(guò)靶基因THBS2發(fā)揮抑制GC細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用.

展望前景

本研究為GC的治療提供了參考靶點(diǎn).