華夏TM白金PCR擴(kuò)增試劑盒的法醫(yī)學(xué)驗(yàn)證及STR遺傳多態(tài)性調(diào)查

張建中，趙祖亮，李亮亮，李學(xué)博，劉增甲

（1.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，山東 濟(jì)寧272067；2.新疆維吾爾自治區(qū)阿勒泰地區(qū)公安局刑偵支隊(duì)，新疆阿勒泰836500；3.山東政法學(xué)院 證據(jù)鑒識(shí)省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南250014；4.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院司法鑒定中心，山東濟(jì)寧272067）

STR基因座因其具有高多態(tài)性，使法醫(yī)DNA分析實(shí)現(xiàn)了高效、靈敏和快速的目標(biāo)，在過去30年大量被應(yīng)用到各類法醫(yī)學(xué)鑒定中[1]。為便于國際間DNA數(shù)據(jù)的查詢、交換和案件串并，20世紀(jì)90年代開始，美國聯(lián)邦調(diào)查局（FBI）實(shí)施了聯(lián)合檢索系統(tǒng)（combined DNA index system，CODIS）計(jì)劃，挑選出13個(gè)常染色體基因座作為核心基因座，2011年將核心基因座進(jìn)行了調(diào)整補(bǔ)充形成了19個(gè)新的CODIS核心基因座[2]。近幾年新開發(fā)的商品化STR分型試劑盒，大多以圍繞CODIS核心基因座為基礎(chǔ)進(jìn)行研發(fā)構(gòu)建[2-4]。

華夏TM白金PCR擴(kuò)增試劑盒是美國Thermo Fisher Scientific公司推出的新一代6色熒光STR復(fù)合擴(kuò)增試劑盒，除新的CODIS系統(tǒng)常染色體核心基因座外，試劑盒根據(jù)中國人群的群體遺傳特點(diǎn)，又增加了Penta E、Penta D、TPOX、D6S1043和D22S1045常染色體STR基因座，并在性別染色體Amelogenin基因座的基礎(chǔ)上，增加了Yindel（rs2032678）遺傳標(biāo)記，從而使其檢測系統(tǒng)覆蓋到25個(gè)基因座，其中常染色體基因座達(dá)到23個(gè)，其中涵蓋了CODIS系統(tǒng)的全部核心位點(diǎn)和中國公安部國家DNA數(shù)據(jù)庫常見的21個(gè)基因座，提高了檢測效能，使檢測結(jié)果具有更高的非父排除率和個(gè)體識(shí)別能力。

為了測試華夏TM白金PCR擴(kuò)增試劑盒的檢測性能和指標(biāo)，評(píng)估其在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值，本研究按照美國DNA分析方法科學(xué)工作組（scientific working group on DNA analysis methods，SWGDAM）制定的確認(rèn)指南[5]，分別從種屬特異性、靈敏度、適應(yīng)性、穩(wěn)定性、混合樣本、抑制劑和均衡性等方面對進(jìn)行了測試。對山東地區(qū)383名漢族無關(guān)個(gè)體樣本進(jìn)行檢測，并分析了23個(gè)常染色體STR基因座的遺傳多態(tài)性信息，為法醫(yī)學(xué)親權(quán)鑒定和個(gè)人識(shí)別提供了相關(guān)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1樣品

常見生物性檢材，包括FTA卡（長春博坤生物科技公司）、血樣采集卡（蘇州閱微基因技術(shù)有限公司）和普通濾紙血片各10份，唾液斑采集卡（公安部物證鑒定中心研制）10份，以及精斑、肌肉組織、肋軟骨、毛發(fā)（有毛囊）及脫落細(xì)胞樣本各10份，上述樣本均來自日常檢案（山東政法學(xué)院司法鑒定中心提供）。

常見動(dòng)物豬、牛、羊、馬、貓、犬、雞、鴨、兔、鼠和魚DNA（購自中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院），大腸桿菌DNA（購自中國科學(xué)院微生物研究所），均按照說明書稀釋至 1.0ng/μL 后備用。

按照知情同意的原則，血樣采集卡采集山東地區(qū)漢族無關(guān)個(gè)體樣本383份，供群體多態(tài)性調(diào)查使用。

1.2試劑

華夏TM白金PCR擴(kuò)增試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司），AGCU EX22復(fù)合擴(kuò)增試劑盒（無錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司），AGCU 21+1復(fù)合擴(kuò)增試劑盒（無錫中德美聯(lián)生物技術(shù)有限公司）及MR23復(fù)合擴(kuò)增試劑盒（蘇州閱微基因技術(shù)有限公司），實(shí)驗(yàn)測試標(biāo)準(zhǔn)樣品9947A和007（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.3DNA定量及PCR擴(kuò)增

分 別 梯 度 稀 釋 配 制 2.0、1.0、0.5、0.25、0.125、0.062 5 ng/μL 的 9947A 樣品，1.0 ng/μL 的 007 樣品以及1.0 ng/μL的常見動(dòng)物 DNA樣品和大腸桿菌DNA樣品進(jìn)行定量后檢測。

按照華夏TM白金PCR擴(kuò)增試劑盒說明書，對血痕及唾液斑樣本以BSD600自動(dòng)打孔機(jī)（澳大利亞BSD公司）采集1.2mm直徑大小樣本直擴(kuò)，其余樣本采用磁珠法提取上述樣品的DNA，以NanoDrop2000型核酸蛋白檢測儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）對DNA進(jìn)行定量后待測，擴(kuò)增以9700型PCR擴(kuò)增儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）進(jìn)行直接擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)體系為25μL，其中PCR Mix 10μL，Primer 10μL，Prep-n-GOTM 緩沖液 5μL。其中 383份山東地區(qū)漢族無關(guān)個(gè)體樣本

PCR 擴(kuò)增參數(shù):95℃ 1min；94℃ 3s，59℃ 16s，65℃ 29s，共 26個(gè)循環(huán)；60℃ 5min；4℃保持。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)3500型遺傳分析儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）檢測，以GeneMapper ID-X軟件進(jìn)行分析數(shù)據(jù)。

1.4 測試指標(biāo)

（1）種屬特異性:常見動(dòng)物豬、牛、羊、馬、貓、犬、雞、鴨、兔、鼠、魚及大腸桿菌的 DNA，各取1 μL進(jìn)行檢測。

（2）靈敏度:標(biāo)準(zhǔn)樣品9947A和007定量后，按上述濃度梯度分別進(jìn)行擴(kuò)增檢測。

（3）適應(yīng)性:提取上述血痕、唾液斑、精斑、肌肉組織、肋軟骨、毛發(fā)（有毛囊）及脫落細(xì)胞樣本的DNA，定量至 1.0 ng/μL 后各取 1 μL，按照說明書分別以華夏TM白金PCR擴(kuò)增試劑盒和AGCU EX22復(fù)合擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行檢測，同時(shí)以AGCU EX22、AGCU 21+1及MR23復(fù)合擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行DNA分型后結(jié)果比對。

（4）穩(wěn)定性:將受試試劑盒中的復(fù)合擴(kuò)增及檢測試劑分裝后，分別反復(fù)凍融20次，測試其有效性。

（5）均衡性:復(fù)合擴(kuò)增樣品 9947A，電泳分型后，按照基因型純合子峰高除以2記錄峰高，雜合子基因座的兩等位基因，分別記錄高峰與低峰峰高，并計(jì)算比值和均值。分別計(jì)算不同熒光中相同熒光所有基因座的峰高平均值，并與其他熒光組比較以確定不同熒光組間均衡性。

（6）混合樣本:將質(zhì)量濃度 1.0 ng/μL 的 9947A和 007 按 19∶1、9∶1、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶9、1∶19的體積比例混合，分別取樣品1μL進(jìn)行測試。

（7）抑制劑:①靛藍(lán)測試。取240mmol/L的靛藍(lán)與 1.0 ng/μL 的 9947A 等體積混合，取 1 μL 進(jìn)行 3次檢測。②鈣離子測試。 取 0.5、1.0 和 2.0mmol/L 的鈣離子，等體積加入到1.0 ng的9947A標(biāo)準(zhǔn) PCR反應(yīng)體系中，取1 μL進(jìn)行3次檢測。③血紅素測試。 取 10、20、40、80 μmol/L 的血紅素，等體積加入到 1.0 ng的 9947A標(biāo)準(zhǔn) PCR 反應(yīng)體系中，取 1 μL進(jìn)行檢測。

上述生物性檢材、常見動(dòng)物、大腸桿菌樣品及試劑盒技術(shù)性能指標(biāo)的檢測分別由經(jīng)專業(yè)培訓(xùn)的專業(yè)人員平行測試，共計(jì)重復(fù)3次。遺傳多態(tài)性調(diào)查的山東地區(qū)漢族無關(guān)個(gè)體血樣直接按照說明書進(jìn)行DNA分型檢測。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

以基因座峰值在200RFU以上，雜合子基因座兩等位基因比≤2為有效分型，根據(jù)國際法醫(yī)遺傳學(xué)會(huì)（international society for forensic genetics,ISFG）進(jìn)行等位基因命名[6-7]，標(biāo)準(zhǔn)樣品9947A和007按照說明書提供的分型結(jié)果進(jìn)行一致性比對，并對分型結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。同時(shí)利用Power Stats分析軟件[8]統(tǒng)計(jì)山東地區(qū)漢族無關(guān)個(gè)體的群體數(shù)據(jù)，獲得23個(gè)STR基因座各等位基因頻率、雜合度（H）、匹配概率（Pm）、個(gè)人識(shí)別能力（DP）、非父排除率（PE）、多態(tài)信息含量（PIC）、累積個(gè)人識(shí)別能力（CDP）和累積非父排除率（CPE）等群體遺傳學(xué)參數(shù)，采用Genepop version 4.2 軟 件 （http://genepop.curtin.edu.au/）分析各基因座的基因型是否符合 Hardy-Weinberg平衡分布及各基因座之間是否存在連鎖不平衡。

表1 華夏TM白金PCR擴(kuò)增試劑盒及標(biāo)準(zhǔn)樣品基因型信息

續(xù)表1

2 結(jié)果

2.1 技術(shù)指標(biāo)驗(yàn)證

（1）種屬特異性:常見動(dòng)物豬、牛、羊、馬、貓、犬、雞、鴨、兔、鼠、魚及大腸桿菌的DNA分型，均未獲得特異性擴(kuò)增產(chǎn)物和DNA分型。

（2）靈敏度:分別以 1.0、0.5、0.25、0.125、0.062 5ng/μL 梯度稀釋的模板量擴(kuò)增 9947A，0.062 5ng/μL樣品的DNA分型不完整，部分基因座峰值不能獲得有效基因分型，0.125 ng及以上均可獲得完整分型結(jié)果。

（3）適應(yīng)性:對上述血痕、唾液斑、精斑、肌肉組織、肋軟骨、毛發(fā)及脫落細(xì)胞樣本均獲得完整分型，且與對照試劑盒的檢測分型結(jié)果完全一致。383份血卡和唾液斑樣本亦均獲得了有效基因分型。

（4）穩(wěn)定性:受試試劑盒中的復(fù)合擴(kuò)增及檢測試劑分裝反復(fù)凍融20次后，檢測結(jié)果無差異。

（5）混合樣本:007和9947A樣品按上述比例混合后，9∶1及1∶9混合模式出現(xiàn)部分位點(diǎn)等位基因丟失現(xiàn)象（基因座峰值低于200RFU），其余混合均可獲得完整DNA分型，不影響判讀。

（6）抑制劑:按照上述濃度混合添加至PCR擴(kuò)增體系的靛藍(lán)、鈣離子和血紅素未影響DNA分型結(jié)果的正確判讀。

（7）均衡性:樣品9947A獲得了有效基因分型，雜合子等位基因峰高比例均≥70%，各基因座峰高均衡性良好，同一熒光不同基因座間的峰高均衡性及不同熒光組之間峰高均衡性均≥50%。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)樣品007DNA的STR分型圖譜

2.2 遺傳多態(tài)性數(shù)據(jù)

經(jīng)對383名山東地區(qū)漢族無關(guān)個(gè)體23個(gè)STR基因座檢測，共發(fā)現(xiàn)276個(gè)等位基因，其中Penta E基因座最高，檢出24個(gè)等位基因，D16S539基因座最低，檢出7個(gè)等位基因，各基因座的等位基因及其頻率見表2。經(jīng)2檢驗(yàn)，23個(gè)常染色體STR基因座基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。 雜合度（H）在 0.627～0.930，個(gè)體識(shí)別能力（DP）在 0.783～0.986，非父排除率（PE）在0.324～0.856，多態(tài)性信息含量（PIC）在 0.551～0.916，累積個(gè)體識(shí)別能力（CDP）和累積非父排除率（CPE）分別為 0.999999999999999999999999998319和 0.999999999596233。相關(guān)等位基因頻率分布及23個(gè)STR基因座群體遺傳學(xué)參數(shù)詳見表2～3。

表2 山東地區(qū)漢族人群23個(gè)STR基因座等位基因頻率分布（n=383）

表3 山東地區(qū)漢族人群23個(gè)STR基因座群體遺傳學(xué)參數(shù)

3 討論

本研究結(jié)果顯示，華夏TM白金PCR擴(kuò)增試劑盒具有較好的種屬特異性，檢測靈敏度高（0.125 ng），對常見生物檢材及混合樣品具有很好的檢測能力，相同檢材不同試劑盒的DNA分型結(jié)果一致，抑制劑對PCR反應(yīng)的影響小，試劑盒的穩(wěn)定性及各熒光組的基因座間的均衡性都較高，具有較高的應(yīng)用潛力。PCR復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)是實(shí)驗(yàn)的核心環(huán)節(jié)，常規(guī)PCR反應(yīng)一般需耗時(shí)3 h，高效快速檢測一直是法醫(yī)工作者追求的目標(biāo)[5]，華夏TM白金PCR擴(kuò)增試劑盒在保證各項(xiàng)性能指標(biāo)的前提下，將PCR復(fù)合擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間縮短到45 min，較大降低了檢測時(shí)間，并可對血斑和唾液斑等生物檢材直擴(kuò)檢測，在法醫(yī)學(xué)檢案中具有重要價(jià)值。

華夏TM白金PCR擴(kuò)增試劑盒利用了六色熒光6-dyeTM技術(shù)，調(diào)整了各熒光范圍內(nèi)的基因位點(diǎn)布局，使得復(fù)合擴(kuò)增體系可以同時(shí)檢測25個(gè)基因座，是目前檢測能力較高的試劑盒之一[3-4]，且涵蓋19個(gè)CODIS核心基因座及國家數(shù)據(jù)庫的21個(gè)STR位點(diǎn)，具有較高的數(shù)據(jù)庫兼容性[10]。試劑盒設(shè)有12個(gè)Mini-STR基因座，擴(kuò)增片段小于220 bp，可以對降解生物檢材進(jìn)行檢測，提高了試劑盒的適用性。試劑盒同時(shí)具有Yindel和Amelogenin2個(gè)性別基因座，增強(qiáng)了男性個(gè)體因Y片段缺失、引物結(jié)合區(qū)突變而導(dǎo)致的性別誤判情況[11]，與同類試劑盒相比Yindel性別基因座可以予以補(bǔ)充驗(yàn)證，可避免性別錯(cuò)判。試劑盒以中國人群為檢測對象研發(fā)，并擴(kuò)展了部分稀有等位基因Ladder和虛擬bins，方便檢測樣本DNA的分型判讀，使檢測結(jié)果更為明確。

用于個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定的復(fù)合擴(kuò)增試劑盒的系統(tǒng)效能需經(jīng)過群體調(diào)查驗(yàn)證后方可使用，且群體數(shù)據(jù)的建立有助于法醫(yī)學(xué)的應(yīng)用[12]。因此，本研究還對山東地區(qū)漢族無關(guān)個(gè)體的群體數(shù)據(jù)進(jìn)行了調(diào)查，23個(gè)常染色體STR基因座基因型頻率均分布符合Hardy-Weinberg平衡定律。通常情況下，同一染色體上物理距離超過10Mb的基因座沒有連鎖關(guān)系[13]，通過對23個(gè)基因座兩兩之間的連鎖不平衡檢驗(yàn)，顯示所有基因座之間均不存在連鎖不平衡現(xiàn)象。該群體遺傳數(shù)據(jù)調(diào)查還發(fā)現(xiàn)，Penta E基因座檢出的等位基因數(shù)量最多，其DP值最高（0.986），而TPOX基因座 DP值最低（0.783），與相關(guān)研究類似[14-16]。山東地區(qū)漢族383名無關(guān)個(gè)體23個(gè)STR基因座 H 值分布在 0.627～0.930，DP在 0.783～0.986，PE 在 0.324～0.856，PIC 在 0.551～0.916。 群體遺傳數(shù)據(jù)的DP和PE反映了該遺傳標(biāo)記在法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值，當(dāng) DP＞0.7、PE＞0.5 時(shí)，可認(rèn)為系高度多態(tài)性遺傳標(biāo)記[17]，經(jīng)對該群體數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，其所有基因座的 DP值均＞0.7，83%的基因座（19個(gè)）PE 值＞0.5，顯示了較高的群體多態(tài)性。本檢測系統(tǒng)在山東地區(qū)漢族群體中平均雜合度大于0.790，平均多態(tài)信息量高于 0.761，而平均 DP在 0.920以上，PE也都超過了0.588。聯(lián)合應(yīng)用時(shí)其累積個(gè)體識(shí)別能力（CDP）為 0.999999999999999999999999998319，累積非父排除率（CPE）為 0.999999999596233。