夏枯草通過HMGB1誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響及其作用機(jī)制

段莎，王宗艷

胃癌是一種常見的惡性腫瘤，在2018年有超過100萬例新增病例，死亡約78.3萬人(相當(dāng)于全球每12例死亡中有1例)，已成為嚴(yán)重威脅人類健康的第五大癌癥，和由癌癥引起死亡的第三大原因[1]。預(yù)測到2020年，我國胃癌發(fā)病率將達(dá)到24.30/10萬左右，新增病例將達(dá)到34.6萬左右，其中男性約占23.7萬，女性約占10.9萬[2]。目前，手術(shù)、化療、放療等是臨床治療胃癌的主要措施。但由于胃癌細(xì)胞的高侵襲性和遷移性，化療藥物的毒副作用，以及患者可能產(chǎn)生的耐藥性，導(dǎo)致臨床治療效果欠佳，患者預(yù)后不良[3-5]。因此，尋找更加安全有效的治療方法具有極其重要的現(xiàn)實意義。夏枯草(PrunellavulgarisL.)是唇形科夏枯草屬多年生草本植物，以干燥果穗入藥，具清肝瀉火，明目，散結(jié)消腫之功，用于目赤腫痛，目珠夜痛，頭痛眩暈，瘰疬，癭瘤，乳癰，乳癖，乳房脹痛[6]。研究發(fā)現(xiàn)，夏枯草注射液可以改善中晚期胃癌患者臨床癥狀[7]，抑制人胃腺癌細(xì)胞SGC-7901增殖，并促進(jìn)其凋亡[8]。但夏枯草對胃癌細(xì)胞增殖、遷移等生物行為的影響及其機(jī)制尚未闡明。因此，本研究以胃癌細(xì)胞BGC-823為研究對象，評價夏枯草在胃癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和凋亡中的作用，同時觀察高遷移率族蛋白B1(High mobility group protein B1, HMGB1)對其治療作用的影響，旨在闡明相關(guān)的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 夏枯草提取物的制備

夏枯草提取物的制備參照杜宏道等[9]的方法，即用水煮方式提取夏枯草藥材，藥液過濾后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，配置成生藥質(zhì)量濃度為1 g/mL夏枯草提取物。之后經(jīng)滅菌和微孔濾膜過濾，冷藏保存。使用時，用DMEM培養(yǎng)液分別稀釋成30 mg/mL、60 mg/mL、90 mg/mL濃度備用。

1.2 實驗主要試劑和儀器

胃癌細(xì)胞BGC-823購自美國ATCC細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；胰酶、RIPA裂解液購自北京索萊寶公司；Lipofectamine 2000購自美國賽默飛世爾有限公司；噻唑藍(lán)(Methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)購自美國Sigma-Aldrich公司；pcDNA3.1-HMGB1載體購自廣州銳博生物有限公司；細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)、P21、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2, Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 Associated X Protein, Bax)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(Matrix metalloproteinase 2，MMP-2)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、HMGB1蛋白抗體購自美國Cellular Signaling Technology公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit)購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；Transwell小室購自美國Corning公司；Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司，酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司，BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀購自美國BD公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

BGC-823細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，待細(xì)胞密度達(dá)80%，加入胰酶消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

選取處于生長對數(shù)期的BGC-823細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個/mL，加入6孔板。根據(jù)Lipofectamine 2000試劑說明書的指示，將pcDNA3.1-HMGB1及相應(yīng)的陰性對照轉(zhuǎn)染入BGC-823細(xì)胞，并用60 mg/mL夏枯草進(jìn)行處理。培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.5 噻唑藍(lán)(MTT)比色法檢測細(xì)胞增殖

收集生長對數(shù)期的BGC-823細(xì)胞，將細(xì)胞以5×103個/孔的密度接種于96孔細(xì)胞板，細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度(30 mg/mL、60 mg/mL、90 mg/mL)的夏枯草藥物，同時以不加夏枯草藥物的BGC-823細(xì)胞為對照，每組設(shè)置6個復(fù)孔，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中分別連續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，棄去原有的培養(yǎng)基，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，37 ℃孵育4 h。棄去MTT溶液，加入150 μL DMSO，37 ℃搖床震蕩孵育10 min，在酶標(biāo)儀上測定BGC-823細(xì)胞在波長490 nm處吸光值，計算細(xì)胞增殖率抑制率，細(xì)胞增殖率抑制率(%)=(1-實驗組平均吸光值/對照組平均吸光值)×100%。

1.6 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡

在對數(shù)生長期的BGC-823細(xì)胞中加入60 mg/mL夏枯草藥物，同時以不加藥物的BGC-823細(xì)胞為對照。收集轉(zhuǎn)染后的BGC-823細(xì)胞，以轉(zhuǎn)染pcDNA3.1的細(xì)胞為對照。調(diào)整各組細(xì)胞密度為1×106個/mL，根據(jù)細(xì)胞凋亡試劑盒的說明，使用195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC，10 μL PI，輕輕混勻，于室溫避光孵育20 min，上流式細(xì)胞儀評估細(xì)胞凋亡率。

1.7 Transwell小室法檢測細(xì)胞侵襲和遷移

(1)侵襲實驗：收集各組細(xì)胞，胰酶消化后制成為5×105個/mL的細(xì)胞懸液，吸取100 μL接種于預(yù)先用Matrigel膠包被的上室。下室加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，用無菌棉簽擦去未穿膜細(xì)胞和Matrigel膠，甲醛固定15 min，結(jié)晶紫染色20 min，在顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取10個視野，記錄侵襲細(xì)胞數(shù)目。

(2)遷移實驗：Transwell上室不鋪Matrigel膠，其余步驟同侵襲實驗。

1.8 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)

為檢測目的蛋白表達(dá)，在各組BGC-823細(xì)胞中加入RIPA裂解液，提取總蛋白，后經(jīng)10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis, SDS-PAGE)，將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，用5%脫脂奶粉于常溫下封閉1 h，加入一抗，在4℃孵育過夜，隨后用Tris-HCl-Tween緩沖鹽溶液(Tris buffered saline with Tween, TBST)洗膜10 min，漂洗3次，加入二抗，室溫下孵育1 h，TBST洗膜10 min，漂洗3次，加入化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行顯色、顯影，以β-actin作為內(nèi)參蛋白，分析蛋白相對表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 夏枯草對胃癌細(xì)胞BGC-823增殖、凋亡的影響

MTT法檢測夏枯草對胃癌細(xì)胞BGC-823增殖的影響(表1)，與對照組相比，不同濃度夏枯草分別處理BGC-823細(xì)胞24 h、48 h、72 h后，細(xì)胞增殖抑制率隨時間增長、劑量增加呈升高趨勢，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與夏枯草30 mg/mL組相比，夏枯草60 mg/mL組和90 mg/mL組細(xì)胞增殖抑制率在24 h、48 h、72 h逐漸上升，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與夏枯草60 mg/mL組相比，夏枯草90 mg/mL組細(xì)胞增殖抑制率在24 h、48 h、72 h明顯提高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。48 h時，夏枯草60 mg/mL組的BGC-823細(xì)胞增殖抑制率約為50%，因此選擇60 mg/mL夏枯草濃度用作后續(xù)實驗。

不同濃度夏枯草作用于胃癌細(xì)胞BGC-823后，與對照組相比，Cyclin D1蛋白表達(dá)明顯下降，P21蛋白表達(dá)顯著升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與夏枯草30 mg/mL組相比，夏枯草60 mg/mL組和90 mg/mL組BGC-823細(xì)胞中Cyclin D1蛋白表達(dá)量顯著減少，P21蛋白表達(dá)量明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與夏枯草60 mg/mL組相比，夏枯草90 mg/mL組BGC-823細(xì)胞中Cyclin D1蛋白表達(dá)水平顯著降低，P21蛋白表達(dá)明顯上升，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1A、表1。

圖1夏枯草對胃癌細(xì)胞BGC-823增殖、凋亡蛋白表達(dá)的影響 A：夏枯草對胃癌細(xì)胞BGC-823增殖蛋白表達(dá)的影響；B：夏枯草對胃癌細(xì)胞BGC-823凋亡的影響；C：夏枯草對胃癌細(xì)胞BGC-823凋亡蛋白表達(dá)的影響

表1夏枯草對胃癌細(xì)胞BGC-823增殖及其相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

注：與對照組比較，aP<0.05；與夏枯草30 mg/mL組比較，bP<0.05；與夏枯草60 mg/mL組比較，cP<0.05

與對照組比較，夏枯草60 mg/mL組明顯提高細(xì)胞凋亡率和Bax蛋白表達(dá)量，顯著減少Bcl-2蛋白表達(dá)量，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1B、表2。

表2夏枯草對胃癌細(xì)胞BGC-823凋亡及其相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.2 夏枯草對胃癌細(xì)胞BGC-823遷移、侵襲的影響

Transwell小室法對胃癌細(xì)胞BGC-823遷移、侵襲的檢測結(jié)果顯示，夏枯草60 mg/mL組遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)較對照組大幅減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Western blot檢測BGC-823細(xì)胞中E-cadherin和MMP-2蛋白表達(dá)情況(圖2和表3)，發(fā)現(xiàn)相比于對照組，夏枯草60 mg/mL組E-cadherin蛋白表達(dá)量增加，MMP-2蛋白表達(dá)量降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖2夏枯草對胃癌細(xì)胞BGC-823遷移、侵襲蛋白表達(dá)的影響 A：夏枯草對胃癌細(xì)胞BGC-823遷移、侵襲的影響；B：夏枯草對胃癌細(xì)胞BGC-823遷移、侵襲蛋白表達(dá)的影響

表3夏枯草對胃癌細(xì)胞BGC-823遷移、侵襲的影響

注：與對照組比較，aP<0.05

2.3 夏枯草對胃癌細(xì)胞BGC-823中HMGB1表達(dá)的影響

Western blot檢測結(jié)果(圖3)顯示，夏枯草60 mg/mL組BGC-823細(xì)胞中HMGB1蛋白表達(dá)水平為0.37±0.03，低于對照組的0.82±0.08，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=12.901，P<0.001)。

圖3Western blot檢測HMGB1蛋白表達(dá)

2.4 過表達(dá)HMGB1能逆轉(zhuǎn)夏枯草對胃癌細(xì)胞BGC-823增殖、凋亡的作用

在BGC-823細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HMGB1載體，并加入夏枯草60 mg/mL進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)HMGB1蛋白表達(dá)量顯著高于夏枯草60 mg/mL+pcDNA3.1組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表6，表明轉(zhuǎn)染成功。MTT法檢測結(jié)果表明，與夏枯草60 mg/mL+pcDNA3.1組相比，過表達(dá)HMGB1明顯降低60 mg/mL夏枯草處理BGC-823細(xì)胞后24 h、48 h和72 h時的細(xì)胞增殖抑制率，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表5。此外，過表達(dá)HMGB1還減少了BGC-823細(xì)胞凋亡率和P21、Bax蛋白表達(dá)量，促進(jìn)P21、Bax蛋白表達(dá)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4、表4、表5。

2.5 過表達(dá)HMGB1能逆轉(zhuǎn)夏枯草對胃癌細(xì)胞BGC-823遷移、侵襲的作用

與夏枯草60 mg/mL+pcDNA3.1組比較，過表達(dá)HMGB1顯著增加夏枯草處理BGC-823細(xì)胞后的遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)，減少E-cadherin蛋白表達(dá)量，提升MMP-2蛋白表達(dá)水平，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖5、表6。

3 討論

夏枯草始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，作為我國傳統(tǒng)中藥，距今已有2000多年的藥用歷史?！按瞬菹闹梁蠹纯荨?，故名曰夏枯草[10]。夏枯草的活性成分主要有迷迭香酸和咖啡酸等酚酸類成分，蘆丁、蕓香苷和金絲桃苷等黃酮類成分，熊果酸和齊墩果酸等三萜類成分，以及多糖類成分[11-12]。藥理研究表明，夏枯草具有抗腫瘤作用，廣泛應(yīng)用于甲狀腺癌、乳腺癌、淋巴癌等的治療[13-14]。本實驗對夏枯草對胃癌中的作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)夏枯草可以抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并促進(jìn)其凋亡，作用機(jī)制可能與調(diào)控HMGB1基因有關(guān)。

熊燚等[15-16]的報道指出，夏枯草分別作用于人甲狀腺髓樣癌TT細(xì)胞、人甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞24 h后，顯著減少細(xì)胞凋亡率。Yin等[17]的實驗顯示，夏枯草促進(jìn)人甲狀腺濾泡癌細(xì)胞系(FTC-133)凋亡與Bcl-2，Bax和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cysteinyl aspartate specific proteinase 3, Caspase-3)信號通路有關(guān)。Zhu等[18]的研究表明，夏枯草可能通過激活促凋亡蛋白Caspase-3，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡通路，來抑制肺癌細(xì)胞A549生長。夏枯草乙醇提取物具有顯著的抗肺癌A549細(xì)胞、人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231遷移的活性[19-20]。本研究中，不同濃度夏枯草處理BGC-823細(xì)胞后，顯著提高細(xì)胞增殖抑制率和P21蛋白表達(dá)水平，抑制Cyclin D1蛋白表達(dá)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。而60 mg/mL夏枯草明顯提高細(xì)胞凋亡率和Bax、E-cadherin蛋白表達(dá)量，顯著減少遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)和Bcl-2、MMP-2蛋白表達(dá)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。說明夏枯草具有一定的抗胃癌作用，可以抑制胃癌細(xì)胞增殖和遷移，并促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡，這與前述報道相符。另外，夏枯草還顯示出了一定的抗侵襲能力。

圖4過表達(dá)HMGB1能逆轉(zhuǎn)夏枯草對胃癌細(xì)胞BGC-823增殖、凋亡蛋白的表達(dá)

表4過表達(dá)HMGB1能逆轉(zhuǎn)夏枯草對胃癌細(xì)胞BGC-823增殖的抑制作用

注：與對照組比較，aP<0.05；與夏枯草60 mg/mL+pcDNA3.1組比較，bP<0.05

表5過表達(dá)HMGB1能逆轉(zhuǎn)夏枯草對胃癌細(xì)胞BGC-823凋亡的促進(jìn)作用

注：與對照組比較，aP<0.05；與夏枯草60 mg/mL+pcDNA3.1組比較，bP<0.05

圖5過表達(dá)HMGB1能逆轉(zhuǎn)夏枯草對胃癌細(xì)胞BGC-823遷移、侵襲蛋白表達(dá)的影響

表6過表達(dá)HMGB1能逆轉(zhuǎn)夏枯草對胃癌細(xì)胞BGC-823遷移、侵襲的抑制作用

注：與對照組比較，aP<0.05；與夏枯草60 mg/mL+pcDNA3.1組比較，bP<0.05

本實驗中，60 mg/mL夏枯草處理胃癌細(xì)胞BGC-823后，HMGB1蛋白表達(dá)水平降低，推測調(diào)控HMGB1表達(dá)可能是夏枯草抗胃癌作用的重要機(jī)制。HMGB1屬于高遷移率族蛋白(High mobility group protein, HMG)家族，是一種高度保守的核蛋白[21]。在細(xì)胞核中，HMGB1維持核內(nèi)平衡，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄，幾乎在所有真核細(xì)胞中都有表達(dá)[22]。資料顯示，HMGB1在肺癌細(xì)胞[23]、胰腺癌[24]、宮頸癌[25]、前列腺癌[26]等癌癥進(jìn)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。miR-505通過調(diào)控HMGB1抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[27]。沉默HMGB1表達(dá)抑制膀胱癌細(xì)胞增殖，而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[28]。為了進(jìn)一步探索夏枯草對胃癌細(xì)胞的影響是否通過HMGB1介導(dǎo)，用夏枯草60 mg/mL處理轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HMGB1載體的BGC-823細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與夏枯草60 mg/mL+pcDNA3.1組相比，過表達(dá)HMGB1逆轉(zhuǎn)了夏枯草對胃癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和Cyclin D1、HMGB1、Bcl-2、MMP-2蛋白表達(dá)的抑制作用，以及逆轉(zhuǎn)了夏枯草對胃癌細(xì)胞凋亡和P21蛋白、Bax蛋白、E-cadherin蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用。由此可見夏枯草通過調(diào)控HMGB1表達(dá)來抑制胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，夏枯草能夠抑制胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制與調(diào)控HMGB1表達(dá)有關(guān)，這將為夏枯草在胃癌中的應(yīng)用提供實驗依據(jù)和參考。