結(jié)直腸癌細(xì)胞多腺苷酸化元件結(jié)合蛋白1 mRNA的臨床價(jià)值研究

邢慧，楊珍妮，胡小翠，劉丹

胞漿多聚腺苷序列結(jié)合蛋白1 (cytoplasmic polyadenylation element binding protein 1，CPEB 1)與位于胞漿內(nèi)mRNA 3′非翻譯區(qū)的多聚腺苷序列結(jié)合，參與多聚腺苷酸化并調(diào)控多種蛋白的翻譯活化和抑制[1-3]。2006年發(fā)現(xiàn)鼠胚胎成纖維細(xì)胞缺失CPEB1即發(fā)生永生化，Burn等人證實(shí)了CPEB敲低后會(huì)出現(xiàn)轉(zhuǎn)化細(xì)胞的特征，如長(zhǎng)端粒保留，線粒體數(shù)量減少，呼吸減少以及糖酵解率增加；此外，CPEB下調(diào)導(dǎo)致p53表達(dá)降低約50%，p53 mRNA的polyA尾縮短且翻譯效率下降[4]。盡管CPEB1的抑癌作用在多個(gè)組織及動(dòng)物模型中有所研究，但目前為止，尚無(wú)充分、完整的數(shù)據(jù)闡述結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中CPEB1的作用。本研究采用實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測(cè)CPEB1 mRNA的表達(dá)情況，探討其與結(jié)直腸癌臨床病理特征以及預(yù)后的關(guān)系，獲得CPEB1表達(dá)的初步數(shù)據(jù)，以期為CPEB1作為結(jié)直腸癌的潛在治療靶點(diǎn)的研究提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究得到哈爾濱醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),收集2005至2008年哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院接受外科手術(shù)的221例結(jié)直腸癌患者的癌組織及30例癌旁正常組織。排除術(shù)前新輔助放化療、復(fù)發(fā)性結(jié)直腸癌或其他已知惡性腫瘤者。收集納入患者的一般資料，腫瘤部位、大小、病理及臨床分析，并進(jìn)行術(shù)后隨訪，評(píng)估是否出現(xiàn)復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。

1.2 方法

1.2.1 RNA分離和定量實(shí)時(shí)PCR 采用Trizol(TIANGEN，Beijing，China)一步法提取癌組織和癌旁正常組織(距腫瘤10 cm以上的上皮組織)總RNA。使用ImProm-Ⅱ TM逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(Promega)合成cDNA，應(yīng)用熒光定量PCR檢測(cè)CPEB1 mRNA。 擴(kuò)增應(yīng)用SYBRH mRNA(TaKaRa)試劑盒，GAPDH mRNA作為對(duì)照。 CPEB1上游和下游引物序列(5′-3′)分別為：GGAAGAAGAAGCAGGAAGGAT和GCATCCTGCTTGTAA-CTGTT。以GAPDH為內(nèi)對(duì)照，計(jì)算各組CPEB1 mRNA的表達(dá)水平。 最終，與配對(duì)正常組織中CPEB1 mRNA相比， 結(jié)直腸癌組織CPEB1 mRNA的表達(dá)水平分為：表達(dá)降低(比值≤1)或表達(dá)增加(比值>1)兩組[5]。

1.2.2 免疫組織化學(xué)分析 應(yīng)用CPEB1抗體(1∶100稀釋；GTX122410，GeneTex)進(jìn)行石蠟包埋的組織樣品的免疫組織化學(xué)染色，應(yīng)用二抗(PV-6001，ZSGB-BIO)和3， 3-氨基聯(lián)苯胺(PA109；TIANGEN，北京，中國(guó))顯色。使用蘇木素進(jìn)行復(fù)染。免疫組化結(jié)果分別由兩名不知道熒光定量PCR結(jié)果的病理專家進(jìn)行閱片和評(píng)分。 根據(jù)McCarty等人報(bào)道的免疫組化染色結(jié)果評(píng)分方法進(jìn)行評(píng)分，該方法綜合染色強(qiáng)度和百分比[6]。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0(SPSS，Chicago，IL)軟件進(jìn)行。計(jì)量資料以mean±SD表示，組間差異采用t檢驗(yàn)； 計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，組間差異采用2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用spearman相關(guān)性分析進(jìn)行檢驗(yàn)；根據(jù)Cox回歸分析進(jìn)行單變量和多變量生存分析，Kaplan-Meier法分析采用Log Rank檢驗(yàn)。P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CPEB1 mRNA表達(dá)

本研究共納入221例結(jié)直腸癌患者。 腫瘤組織中CPEB1 mRNA水平表達(dá)各異，其中CPEB1 mRNA表達(dá)升高(腫瘤/瘤旁比值 > 1)的中位數(shù)為1.57(n=159;范圍為1.01～3.45)，CPEB1 mRNA水平降低(腫瘤/瘤旁比值 ≤ 1)的中位數(shù)為0.53(n=62;范圍為0.23-1.00)。

為了確定CPEB1 mRNA水平是否與CPEB1蛋白表達(dá)一致，我們應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法(圖1A和1B)檢測(cè)了CPEB1 mRNA比值增高(n=20)或降低(n=10)的 30個(gè)結(jié)直腸癌樣本。 結(jié)果顯示，免疫組織化學(xué)染色得分與CPEB1 mRNA比值水平一致(P= 1.43×10-4)。

圖1結(jié)腸癌組織CPEB1免疫組化染色(SP,×200) A：CPEM1染色陽(yáng)性; B：CPEB1染色陰性

2.2 CPEB1 mRNA比值與臨床病理資料分析

患者的臨床和病理特征見(jiàn)表1。結(jié)直腸癌患者的中位年齡為63.5歲(范圍28～92歲)，大部分為良好/中度分化的Ⅱ期和Ⅲ期腫瘤。 較低的CPEB1 mRNA比值與淋巴結(jié)受累顯著相關(guān)。單因素分析顯示CPEB1 mRNA與腫瘤大小，部位，病理類型及分化均無(wú)顯著相關(guān)(見(jiàn)表2)。

中位隨訪時(shí)間為48.4個(gè)月(范圍為0～95個(gè)月)，70.6%的患者生存，其中65.6%的患者無(wú)進(jìn)展生存。 186例非IV期患者的中位隨訪時(shí)間53.7個(gè)月(范圍為9～95)，其中42例(22.6%)術(shù)后出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。與CPEB1 mRNA比值較高患者相比，較低CPEB1 mRNA比值的患者中位總生存時(shí)間顯著降低(P=2×10-5, 圖2A)。低CPEB1 mRNA比值是無(wú)進(jìn)展生存期短的顯著預(yù)測(cè)因素(PFS;P= 0.001，圖2B)多變量分析顯示，在調(diào)整性別、部位、病理類型、分化和腫瘤分期后，總生存期和無(wú)進(jìn)展生存期與CPEB1 mRNA比值顯著相關(guān)(P=2.31×10-4和P=0.002)。

表1結(jié)直腸癌患者的臨床病理特征

表2CPEB1信使RNA(mRNA)水平與結(jié)直腸癌臨床病理特征的相關(guān)性研究

圖2Kaplan-Meier生存曲線 A：Cpeb1 mRNA的表達(dá)與納入患者的總體生存期; B: Cpeb1 mRNA的表達(dá)與納入患者的無(wú)進(jìn)展生存期

3 討論

多項(xiàng)研究表明，CPEB1通過(guò)特異性調(diào)控胞質(zhì)多聚腺苷酸化參與靶基因的翻譯調(diào)控[7-9]。CPEB1在細(xì)胞分裂中的M期進(jìn)入和腫瘤細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用，研究表明CPEB及其家族成員在腫瘤組織中表達(dá)下降，可能參與腫瘤細(xì)胞的衰老逃逸以及永生化，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等[10-11]。以往的研究結(jié)果提示CPEB1是一個(gè)潛在抑癌因子，CPEB1的缺失增加了腫瘤易感性。 此外，CPEB1也參與促進(jìn)惡性細(xì)胞進(jìn)展[12-15]。在CPEB1表達(dá)缺陷的乳腺上皮細(xì)胞由于β-連環(huán)蛋白和E-鈣粘蛋白定位變化進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞失去極性，這可能導(dǎo)致上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，最終腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)[11]。綜上所述，CPEB1參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。

表3Cpeb1 mRNA水平與結(jié)直腸癌患者無(wú)進(jìn)展生存期的多因素分析

本研究中，我們發(fā)現(xiàn)CPEB1 mRNA比值在結(jié)直腸癌組織標(biāo)本中表達(dá)不同，CPEB1 mRNA比值降低與患者總體生存和無(wú)進(jìn)展生存期短相關(guān)。這為CPEB1在結(jié)直腸癌中起到一定的抑癌作用的佐證，也與之前的研究結(jié)果報(bào)道是一致的。我們的研究結(jié)果還顯示，CPEB1 mRNA比值可以作為結(jié)直腸癌患者生存的良好獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)。這與其他一些研究結(jié)果一致，例如Yin J、Yin XY等[16-17]的研究顯示CPEB1表達(dá)低的膠質(zhì)瘤患者的總體生存期顯著縮短。

綜上，我們的結(jié)果證明CPEB1 mRNA比值降低是結(jié)直腸癌患者預(yù)后差的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子；CPEB1可能參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。 然而，本實(shí)驗(yàn)僅為初步試驗(yàn)，CPEB1的表達(dá)機(jī)制、調(diào)控機(jī)制以及更深入的數(shù)據(jù)，CPEB1在結(jié)直腸癌中的作用機(jī)制和臨床意義還需要更大規(guī)模的研究去證實(shí)。