不同冷凍方式對(duì)調(diào)味魚貯藏期間肌原纖維蛋白的影響

常婭妮 馬儷珍 楊梅 吳晨燕 于斌 李玲

摘 要：為探究不同冷凍方式對(duì)調(diào)味魚凍藏品質(zhì)的影響，提取快速（-80 ℃）、中速（-30 ℃）、慢速（-18 ℃）冷凍調(diào)味魚貯藏期間的肌原纖維蛋白，測(cè)定相關(guān)蛋白變性指標(biāo)，并用電子鼻對(duì)氣味進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明：隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，3 種冷凍處理調(diào)味魚的肌原纖維蛋白均發(fā)生不同程度的氧化，具體表現(xiàn)為羰基含量、表面疏水性不斷上升，活性巰基含量、乳化性及穩(wěn)定性不斷下降;-80 ℃冷凍調(diào)味魚的肌原纖維蛋白變性程度最低，-18 ℃冷凍調(diào)味魚的肌原纖維蛋白變性最嚴(yán)重;-30、-80 ℃冷凍調(diào)味魚貯藏期間氣味變化較小，而-18 ℃冷凍調(diào)味魚貯藏期間氣味變化較大。

關(guān)鍵詞：調(diào)味魚;冷凍方式;貯藏;肌原纖維蛋白;蛋白氧化

Abstract： In an attempt to explore the effects of different freezing methods on the quality of prepared fish products as a function of storage time， myofibrillar proteins from prepared fish products frozen at ?80 （quick）， ?30 （medium） or??18 ℃ （slow） were extracted during storage and parameters related to protein denaturation were measured. Besides， the odor was analyzed by an electronic nose. The results showed that for all three freezing treatments， myofibrillar proteins were oxidized to different extents with the prolongation of storage time， as indicated by increased protein carbonyl content and surface hydrophobicity as well as decreased active sulfhydryl group content， emulsifying capacity and emulsion stability. More serious denaturation of myofibrillar proteins occurred at higher freezing temperature. The odor changed only slightly during storage at ?30 or ?80 ℃， but changed greatly at ?18 ℃.

Keywords： prepared fish; freezing method; storage; myofibrillar protein; protein oxidation

斑點(diǎn)叉尾鮰（Letaurus punetaus），屬鯰形目、鮰科，原產(chǎn)于美國(guó)，是美國(guó)最主要的淡水養(yǎng)殖食用魚類[1]，其肉質(zhì)鮮嫩，富含多種人體必需氨基酸、不飽和脂肪酸和維生素等，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，同時(shí)還具有降血脂、增強(qiáng)免疫力、益智健腦、補(bǔ)腎明目、減肥及抗衰老等保健功效，深受消費(fèi)者喜愛。

目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上的斑點(diǎn)叉尾鮰仍以鮮活銷售為主，加工包裝銷售產(chǎn)品相對(duì)較少，尤其缺少適應(yīng)現(xiàn)代快節(jié)奏城市生活、既營(yíng)養(yǎng)又食用方便的調(diào)理魚產(chǎn)品[2]。

水產(chǎn)品貯藏期間，除了感官品質(zhì)、理化性質(zhì)會(huì)隨著貯藏時(shí)間發(fā)生變化外，同時(shí)也伴隨著肌肉氧化，肌肉氧化包括脂肪氧化和蛋白變性[3]，均會(huì)造成產(chǎn)品品質(zhì)下降。作為魚肉的主要成分，蛋白質(zhì)在微生物和酶的作用下發(fā)生水解、變性等是魚肉腐敗變質(zhì)的主要原因，尤其在低溫凍藏過程中。研究表明，蛋白質(zhì)變性是影響魚肉凍藏品質(zhì)的最主要因素[4]。在冷凍和凍藏時(shí)，魚體中水分形成的冰晶會(huì)破壞肌肉細(xì)胞，導(dǎo)致機(jī)械損傷，加速魚肉蛋白的氧化和變性[5]。蛋白質(zhì)的完整性與魚體肌肉組織的各種功能特性密切相關(guān)，其中最主要的是肌原纖維蛋白，宋麗麗[6]、曾名勇[7]等分別在鮰魚和鱸魚的研究中發(fā)現(xiàn)，降低凍藏溫度能很好地維持魚肉肌原纖維蛋白的完整性，有效保持魚肉的貯藏品質(zhì)。

目前，雖然通過冷凍貯藏能有效延長(zhǎng)魚肉貯藏時(shí)間，但是在貯藏過程中，低溫冷凍會(huì)對(duì)魚肉蛋白造成一系列損壞，影響貯藏品質(zhì)。本研究通過提取慢速（-18 ℃）、中速（-30 ℃）、快速（-80 ℃）冷凍斑點(diǎn)叉尾鮰調(diào)味魚不同貯藏時(shí)間的肌原纖維蛋白，對(duì)其氧化相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，分析不同冷凍方式對(duì)調(diào)味魚凍藏期間肌原纖維蛋白變性的影響，并結(jié)合電子鼻測(cè)定3 種冷凍處理調(diào)味魚貯藏期間的氣味變化，進(jìn)一步明確不同冷凍方式對(duì)調(diào)味魚貯藏品質(zhì)的影響，旨在提高斑點(diǎn)叉尾鮰調(diào)味魚的凍藏品質(zhì)，為工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活的斑點(diǎn)叉尾鮰購(gòu)于天津市紅旗農(nóng)貿(mào)水產(chǎn)批發(fā)市場(chǎng)，選擇大小均一、質(zhì)量1 000～1 500 g的無病傷活魚，在20 min內(nèi)運(yùn)回食品加工車間。

溴酚藍(lán)、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl?sulfate，SDS）、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、甘氨酸 天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司;乙二胺四乙酸、尿素、5，5-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）、鹽酸胍、乙酸乙酯 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BZSQ-Ⅱ鹽水注射機(jī)、BVRJ-40真空滾揉機(jī) 杭州艾博機(jī)械工程有限公司;DZ400/2S真空包裝機(jī) 諸城市美川機(jī)械有限公司;Heracles Ⅱ氣相色譜電子鼻?天津埃文森科技有限公司;T6新世紀(jì)紫外分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;ST 40R離心機(jī) 美國(guó)Thermo公司;FA25勻漿機(jī)? ?上海魯克流體機(jī)械制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

將運(yùn)回的鮮活斑點(diǎn)叉尾鮰敲暈后開背，去除內(nèi)臟和鰓部，流動(dòng)自來水快速清洗3 遍，然后將魚放入冰水中，在4 ℃環(huán)境下浸泡降溫，待魚體中心溫度降至10 ℃后，再轉(zhuǎn)移至3 g/100 mL檸檬酸溶液中浸泡20 min進(jìn)行抑菌保鮮處理，然后將預(yù)先配制好的冷卻五香風(fēng)味腌制液（食鹽質(zhì)量濃度10 g/100 mL）用鹽水注射機(jī)注入魚體中，注入量為魚體質(zhì)量的12%，真空滾揉30 min，滾揉時(shí)正轉(zhuǎn)與逆轉(zhuǎn)間歇進(jìn)行，每轉(zhuǎn)動(dòng)5 min靜止30 s，滾揉結(jié)束后真空包裝，即得到開背調(diào)味魚產(chǎn)品。

將包裝好的調(diào)味魚隨機(jī)分成3 份，分別放入-18、-30、-80 ℃進(jìn)行慢速、中速和快速冷凍處理，待魚體中心溫度降至-18 ℃以后，取出統(tǒng)一置于-18 ℃貯藏。在貯藏過程中每4 周進(jìn)行取樣測(cè)定，3 種處理每次均隨機(jī)取出3 條魚，流水解凍后，將魚肉去皮、去骨、絞碎混勻后測(cè)定指標(biāo)，各指標(biāo)均重復(fù)測(cè)定3 次。

1.3.2 肌原纖維蛋白的提取及含量測(cè)定

參考Yang Fang等[8]的方法提取調(diào)味魚肌原纖維蛋白，將提取好的蛋白放置在4 ℃冰箱保存，為了不影響指標(biāo)測(cè)定結(jié)果，提取的蛋白在72 h內(nèi)使用。

蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度測(cè)定參考Bradford[9]的方法，采用雙縮脲法進(jìn)行測(cè)定，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 羰基含量測(cè)定

采用2，4-二硝基苯肼（2，4-dinitrophenylhydrazine，DNPH）法，參考Oliver等[10]的方法，并略作修改。測(cè)量蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度之后，在280 nm波長(zhǎng)處以6 mol/L鹽酸胍調(diào)零，測(cè)定加入鹽酸后樣品的吸光度，代入鹽酸胍標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度;再以加入鹽酸的樣品做空白調(diào)零，在370 nm波長(zhǎng)處測(cè)定加入DNPH后樣品的吸光度。調(diào)味魚肌原纖維蛋白羰基含量按式（1）計(jì)算。

1.3.4 活性巰基含量測(cè)定

采用Benjakul等[11]的方法。

1.3.5 表面疏水性測(cè)定

參考Chelh等[12]的方法，取1 mL質(zhì)量濃度為5 mg/mL的調(diào)味魚肌原纖維蛋白溶液，與200 μL 1 mg/mL的溴酚藍(lán)溶液混合，在室溫下攪拌10 min后于4 ℃、10 000×g條件下離心15 min，取上清液稀釋10 倍，在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以磷酸鹽緩沖液為空白對(duì)照，表面疏水性以肌原纖維蛋白結(jié)合溴酚藍(lán)的量來表示。調(diào)味魚肌原纖維蛋白表面疏水性按式（2）計(jì)算。

1.3.6 乳化性及乳化穩(wěn)定性測(cè)定

參考樊雪靜[13]的方法。

1.3.7 濁度測(cè)定

取5 mL 1 mg/mL的調(diào)味魚肌原纖維蛋白溶液，在不同溫度（40、50、60、70、80 ℃）條件下水浴加熱30 min，取出冷卻至室溫后測(cè)定其在600 nm波長(zhǎng)處的吸光度。濁度用吸光度表示。

1.3.8 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）測(cè)定采用Laemmli[14]的方法。

1.3.9 電子鼻測(cè)定

參考宋敏[15]的方法，并略作修改，準(zhǔn)確稱取5 g絞碎的調(diào)味魚肉樣，放入20 mL進(jìn)樣瓶中，密封40 ℃水浴加熱10 min后立即測(cè)定。Heraclese Ⅱ?qū)嶒?yàn)條件：載氣（H2）流量30 mL/min，進(jìn)樣量5 000 μL，進(jìn)樣速率125 μL/s，進(jìn)樣口溫度200 ℃;捕集阱溫度40 ℃，解析溫度240 ℃;柱溫50 ℃，先以1 ℃/s升至80 ℃，再以3 ℃/s升至250 ℃;檢測(cè)器溫度260 ℃，采集時(shí)間110 s。每組樣品重復(fù)測(cè)定5 次，舍棄差異較大值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用Statistix 8.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性分析，采用Sigmaplot 10.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 調(diào)味魚貯藏過程中肌原纖維蛋白羰基含量的變化

研究表明，鯰魚貯藏過程中，肽鍵斷裂和氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)氧化是羰基及其衍生物產(chǎn)生的主要原因[16]，羰基的產(chǎn)生是魚肉蛋白質(zhì)分子被氧化修飾的重要標(biāo)志，因此通過測(cè)定魚肉中蛋白質(zhì)的羰基含量可以反映出蛋白質(zhì)的氧化程度[17]。

由圖1可知：-18 ℃冷凍調(diào)味魚整個(gè)貯藏期間的肌原纖維蛋白羰基含量明顯高于其他2 組，且增長(zhǎng)較快，由貯藏初期的1.59 nmol/L上升到貯藏末期的5.19 nmol/L;-30、-80 ℃冷凍調(diào)味魚貯藏前12 周的肌原纖維蛋白羰基含量變化不明顯，直至貯藏后期，-30 ℃冷凍調(diào)味魚肌原纖維蛋白羰基含量上升較快，貯藏末期其羰基含量為4.35 nmol/L，明顯高于-80 ℃冷凍處理組;-80 ℃冷凍處理調(diào)味魚的肌原纖維蛋白羰基含量在整個(gè)貯藏期間上升趨勢(shì)較平緩，僅由初始值1.90 nmol/L增長(zhǎng)到貯藏末期的3.34 nmol/L，表明-30、-80 ℃冷凍處理可以有效延緩調(diào)味魚肌原纖維蛋白的氧化，且冷凍溫度越低，效果越明顯。李學(xué)鵬等[18]在大黃魚-18、-80 ℃凍藏過程中也有類似發(fā)現(xiàn)。

2.2 調(diào)味魚貯藏過程中肌原纖維蛋白活性巰基含量的變化

蛋白質(zhì)分子中的總巰基包括其表面的活性巰基和深埋于分子內(nèi)部的巰基，巰基氧化會(huì)造成多肽間形成二硫鍵和磺酸類等氧化產(chǎn)物，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子間產(chǎn)生交聯(lián)、聚合，同時(shí)巰基含量的變化也會(huì)引起蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的改變及蛋白質(zhì)溶解性的降低[19]，巰基含量越低，說明蛋白質(zhì)變性程度越高，活性巰基含量的變化可以很好地表征蛋白質(zhì)的氧化情況。

由圖2可知，3 種處理調(diào)味魚貯藏期間肌原纖維蛋白活性巰基含量的變化均為下降趨勢(shì)。貯藏初期，魚肉較新鮮，蛋白質(zhì)變性程度低，活性巰基含量高;隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，位于蛋白質(zhì)分子外側(cè)的活性巰基先被氧化形成二硫鍵，造成活性巰基含量明顯下降。-18 ℃冷凍調(diào)味魚貯藏期間肌原纖維蛋白活性巰基含量由初始值169.4 nmol/mg降至86.8 nmol/mg，下降幅度較大;-30 ℃冷凍調(diào)味魚的肌原纖維蛋白活性巰基含量雖然在整個(gè)貯藏期間均高于-18 ℃冷凍調(diào)味魚，但是貯藏期間其肌原纖維蛋白活性巰基含量的下降幅度稍大于-18 ℃冷凍處理組，從貯藏初期到末期下降84 nmol/mg;-80 ℃冷凍處理調(diào)味魚貯藏期間肌原纖維蛋白活性巰基含量下降幅度最小，僅下降54 nmol/mg，變化趨勢(shì)平緩，這可能是由于-80 ℃冷凍調(diào)味魚凍結(jié)時(shí)魚體內(nèi)水分形成的冰晶較小，不易刺破細(xì)胞，防止細(xì)胞汁液外流，從而減緩了蛋白質(zhì)的變性。

2.3 調(diào)味魚貯藏過程中肌原纖維蛋白表面疏水性的變化

蛋白質(zhì)的降解和變性會(huì)使埋藏在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露出來[20]，疏水集團(tuán)暴露的越多，蛋白質(zhì)表面疏水性越高。由圖3可知：隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，調(diào)味魚肌原纖維蛋白表面疏水性均不斷增加，-18、-30 ℃冷凍調(diào)味魚貯藏前4 周的肌原纖維蛋白表面疏水性增長(zhǎng)趨勢(shì)均不明顯，貯藏4 周以后增長(zhǎng)變快，且-18 ℃冷凍調(diào)味魚比-30 ℃冷凍調(diào)味魚增長(zhǎng)幅度更大;與-18、-30 ℃冷凍調(diào)味魚相比，-80 ℃冷凍調(diào)味魚肌原纖維蛋白表面疏水性一直維持在較低水平，貯藏前16 周增長(zhǎng)趨勢(shì)較平緩，貯藏末期增長(zhǎng)速率明顯加快，這可能是由于-80 ℃冷凍處理對(duì)調(diào)味魚的細(xì)胞破壞較小，疏水性氨基酸保存在細(xì)胞內(nèi)，暴露較少，減少了促氧化因子對(duì)蛋白質(zhì)的修飾作用，隨著凍藏時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞破壞較多，疏水基團(tuán)也暴露較多。

2.4 調(diào)味魚貯藏過程中肌原纖維蛋白乳化性及乳化穩(wěn)定性的變化

乳化性和乳化穩(wěn)定性主要反映蛋白質(zhì)與油脂間的作用力[21]，蛋白質(zhì)具有良好的溶解性、表面活性和抗凝聚能力，常作為乳化劑應(yīng)用在食品中[22]。由圖4A可知，3 種冷凍處理調(diào)味魚貯藏期間肌原纖維蛋白的乳化性均隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)不斷下降，這是由于魚肉肌原纖維蛋白分子不斷發(fā)生氧化、交聯(lián)、變性以及分子內(nèi)側(cè)疏水基團(tuán)的暴露，降低了蛋白質(zhì)的溶解性，使得其在乳化過程中乳化粒子減少，從而乳化性隨之降低[23]。乳化性的降低與羰基、活性巰基、表面疏水性的變化具有相關(guān)性，-80 ℃冷凍處理調(diào)味魚肌原纖維蛋白的乳化性在貯藏前4 周低于-30 ℃冷凍處理組，之后均高于其他2 組，-30 ℃冷凍處理組調(diào)味魚肌原纖維蛋白乳化性波動(dòng)較大，但整體大于-18 ℃冷凍處理組，小于-80 ℃冷凍處理組，可以看出速凍處理確實(shí)能有效減緩調(diào)味魚的肌原纖維蛋白變性，從而減緩肌原纖維蛋白乳化性的下降。

乳化穩(wěn)定性是指蛋白質(zhì)維持乳狀液穩(wěn)定狀態(tài)的一種能力，可以與乳化性一起反映蛋白質(zhì)的氧化程度。由圖4B可知，3 種冷凍處理調(diào)味魚貯藏期間肌原纖維蛋白的乳化穩(wěn)定性均明顯下降，-80、-30 ℃冷凍處理組之間差異不明顯，均高于-18 ℃冷凍處理組，與乳化性的變化趨勢(shì)相似。

2.5 調(diào)味魚貯藏過程中肌原纖維蛋白濁度的變化

A. -18 ℃冷凍;B. -30 ℃冷凍;C. -80 ℃冷凍。圖6～7同。

濁度是指光透過物質(zhì)后被散射或吸收成為不透射光的一種變化程度[24]。由圖5可知，總體來看，3 種冷凍處理調(diào)味魚肌原纖維蛋白的濁度均隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)先上升后下降。貯藏前期，肌原纖維蛋白不斷氧化變性，分子間疏水性相互作用變大，導(dǎo)致肌原纖維蛋白溶解度降低，光透過時(shí)發(fā)生散射，從而濁度不斷上升[25];貯藏后期濁度下降可能是由于隨著肌原纖維蛋白溶解度的繼續(xù)降低，在懸濁液中形成較大的聚集體而發(fā)生沉淀，引起濁度下降。3 種冷凍處理調(diào)味魚肌原纖維蛋白的濁度均在加熱溫度40 ℃時(shí)較小，加熱溫度50～80 ℃時(shí)濁度明顯升高，說明調(diào)味魚肌原纖維蛋白在50 ℃及以上溫度時(shí)可以形成良好的懸濁液體系。-18 ℃冷凍調(diào)味魚貯藏期間肌原纖維蛋白濁度平均值為1.21，-30 ℃冷凍處理組為1.10，-80 ℃冷凍處理組為1.07，綜合來看，速凍處理可以提高調(diào)味魚貯藏期間肌原纖維蛋白的溶解度，從而降低其濁度。

2.6 調(diào)味魚貯藏過程中肌原纖維蛋白的SDS-PAGE分析

由圖6可知，調(diào)味魚貯藏過程中肌原纖維蛋白SDS-PAGE

圖譜中從上到下的條帶分別表示肌球蛋白重鏈、肌動(dòng)蛋白、原肌球蛋白和肌鈣蛋白，與Jiang等[26]研究報(bào)道一致，其中主要的蛋白條帶是肌球蛋白重鏈和肌動(dòng)蛋白[27]。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，3 種處理調(diào)味魚的肌原纖維蛋白條帶均發(fā)生不同程度的變淡、變細(xì)，說明貯藏期間肌原纖維蛋白發(fā)生降解。-18 ℃冷凍處理調(diào)味魚肌原纖維蛋白條帶在整個(gè)貯藏期間明顯比-80、-30 ℃冷凍處理組條帶細(xì)且顏色較淺;-30 ℃冷凍處理調(diào)味魚的肌球蛋白重鏈和肌動(dòng)蛋白條帶隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)明顯變淺，但整體優(yōu)于-18 ℃冷凍處理組;-80 ℃冷凍處理組調(diào)味魚的肌原纖維蛋白條帶在整個(gè)貯藏期間都清晰可辨，顏色較深，直至貯藏末期（第20周），肌球蛋白重鏈條帶才明顯變淺，說明-80 ℃冷凍處理能有效延緩調(diào)味魚肌原纖維蛋白的氧化。

2.7 調(diào)味魚貯藏過程中電子鼻響應(yīng)值的主成分分析

-18 ℃、-30 ℃、-80 ℃冷凍處理調(diào)味魚貯藏期間的電子鼻識(shí)別指數(shù)分別為87、86、86，置信度較好，能很好地區(qū)分出不同冷凍方式調(diào)味魚貯藏期間的氣味變化情況[28]。由圖7可知，-18 ℃冷凍調(diào)味魚貯藏期間的氣味變化較大，分布較分散，而-30、-80 ℃冷凍處理調(diào)味魚除貯藏0周外，其余貯藏時(shí)間的氣味變化均較小，分布集中，說明-30、-80 ℃冷凍能很好地延緩調(diào)味魚貯藏期間的風(fēng)味變化。

3 結(jié) 論

魚肉貯藏過程中肌原纖維蛋白容易發(fā)生氧化，這種氧化隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)加劇，具體表現(xiàn)為肌原纖維蛋白羰基含量上升，活性巰基含量下降，表面疏水性上升，乳化性及乳化穩(wěn)定性下降，濁度上升，且隨著肌原纖維蛋白的氧化降解，其SDS-PAGE條帶也逐漸變細(xì)、變模糊。不同冷凍方式對(duì)調(diào)味魚肌原纖維蛋白變性的抑制效果為-80 ℃（快速冷凍）>-30 ℃（中速冷

凍）>-18 ℃（慢速冷凍）。不同冷凍方式對(duì)調(diào)味魚貯藏期間的氣味也會(huì)產(chǎn)生影響，-18 ℃冷凍處理組氣味變化較大，-30、-80 ℃冷凍處理組除貯藏初期外氣味變化均較小，很好維持了魚肉原有的氣味。

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