硫酸鋅對大鼠壓力性潰瘍TNF-α、NF-κB p65表達的影響

蔣紅 樊慧婷，2 羅園園 魏軍紅 彭祿霞 由淑萍

(1新疆醫(yī)科大學(xué)護理學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830000，2新疆伊寧市伊犁州友誼醫(yī)院)

壓力性潰瘍現(xiàn)已成為全球醫(yī)療費用支出最高的身體衰弱并發(fā)癥之一。在我國，壓力性潰瘍的發(fā)生率為26.2%〔1〕，雖然已把壓力性潰瘍是否出現(xiàn)作為衡量護理質(zhì)量、醫(yī)院等級評審、質(zhì)量年檢查的客觀證據(jù)之一，但由于壓力性潰瘍防治尚缺乏科學(xué)指南，導(dǎo)致不同醫(yī)院、科室或同一科室的不同護士對壓力性潰瘍防治所采取的方法也有所差異。研究表明〔2〕，黃芪注射液可以通過抑制炎癥因子、氧自由基的釋放，對壓力性潰瘍?nèi)毖?再灌注損傷具有保護作用。鋅作為一種微量元素可以促進傷口愈合，且愈合速度與傷口鋅的濃度呈現(xiàn)正相關(guān)，因此，推測硫酸鋅對壓力性潰瘍具有防治作用，其作用機制可能與改善壓力性潰瘍?nèi)毖?再灌注損傷有關(guān)。本實驗選擇與黃芪注射液劑型相同的硫酸鋅注射液，采用缺血-再灌注損傷的原理制備大鼠壓力性潰瘍模型，并給予不同濃度的硫酸鋅進行治療，觀察超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及參與炎癥反應(yīng)的炎癥因子腫瘤壞死因子(TNF)-α、核因子(NF)-κB p65的變化，以證實硫酸鋅對大鼠壓力性潰瘍部位的保護作用及其可能發(fā)生的作用機制，為臨床預(yù)防和治療壓力性潰瘍提供合理、安全、有效的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料及主要儀器 硫酸鋅晶體(7733-02-0，西安泰華醫(yī)藥有限公司)(硫酸鋅晶體0.2 g+200 ml生理鹽水混勻，此時濃度為1 mg/ml，滅菌后備用)；黃芪注射液(相當于原生藥20 g，A03171009，黑龍江珍寶島藥業(yè))；SOD測定試劑盒(001-3，南京建成生物工程研究所)、MDA測定試劑盒(A003-1，南京建成生物工程研究所)；TNF-α測定試劑盒購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；NF-κB p65抗體購自北京博奧森生物公司；二步法(通用型)檢測試劑盒PV-6000、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購自中杉金橋生物公司。低溫離心機；數(shù)顯恒溫水浴鍋；酶標儀。

1.2實驗動物 SPF級SD大鼠，雄性，60只，體重180～220 g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物研究中心提供。動物生產(chǎn)許可證號SCXK(新) 2011-0004。SPF環(huán)境實驗動物使用許可證號：SYXK(新)2011-0004，飼養(yǎng)受控環(huán)境條件(21～23℃，濕度50%～70%)，通風良好，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.3大鼠壓力性潰瘍模型的制備 參考姜麗萍等〔3〕壓力性潰瘍模型制備方法。造模前大鼠禁食12 h，自由飲水，腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，大鼠雙后肢脫毛處理。之后將大鼠仰臥受壓于壓力性潰瘍加壓裝置上，給予3個周期的I/R(I=缺血2.0 h,R=再灌注0.5 h)，合計7.5 h。

1.4分組與用藥 將大鼠隨機分為6組，正常對照組、壓力性潰瘍模型組、黃芪陽性對照組(10 ml/kg)〔4〕、硫酸鋅高、中、 低劑量組(10.0、5.0、2.5 ml/kg)，每組10只，除正常對照組外，其余組均進行大鼠壓力性潰瘍模型的制備。造模成功后次日，黃芪陽性對照組和硫酸鋅高、中、低劑量組分別給予黃芪注射液和硫酸鋅注射液，注射部位選定為大鼠壓力性潰瘍周圍股薄肌朝向腹腔處，腹腔注射，正常對照組不給予任何處理，模型對照組給予生理鹽水10 ml/kg注射，1次/d，持續(xù)15 d。

1.5指標的觀察 ①壓力性潰瘍面積測定：三個循環(huán)結(jié)束時與每天給藥前，肉眼觀察受壓部位皮膚的完整性(破損面積)和皮膚顏色變化。②血清SOD、MDA、TNF-α含量測定：心臟取血后，分離血清于-70℃冰箱凍存待測，按照試劑盒說明書步驟操作，在酶標儀波長450 nm處測定SOD、MDA吸光度，在630 nm處測定TNF-α吸光度。③蘇木素-伊紅(HE)染色觀察壓力性潰瘍組織病理變化：在4%多聚甲醛中固定7 d后，進入脫水、透明、浸蠟程序后，進行石蠟包埋、切片(3～4 μm厚)、60℃恒溫箱烤片、脫蠟、HE染色、乙醇梯度脫水、透明、封膠、觀察。壓力性潰瘍分為3級：1級肌纖維排列緊密，橫紋清晰，少量炎癥細胞浸潤，無水腫；2級可見較多炎癥細胞浸潤，肌纖維輕度水腫，橫紋欠清晰；3級肌纖維亦見明顯炎癥細胞浸潤，水腫明顯，間質(zhì)增寬，橫紋模糊。④免疫組化法測定壓力性潰瘍組織中NF-κB p65因子的變化：采用SP法進行免疫組化染色，將切片按脫臘，3%過氧化氫(H2O2)消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，微波中低火3 min、中火7 min、中高火2 min進行抗原熱修復(fù)，山羊血清封閉液封閉30 min，滴加Ⅰ抗(1∶500) 4℃過夜，20%～30%蛋清液50 μl消除內(nèi)源性生物素，滴加Ⅱ抗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，乙醇梯度脫水，透明，膠封的方法進行NF-κB p65因子的免疫組化分析。采用Nikon DIGITAL SIGHTDS-Fi2型生物顯微鏡進行觀察、K12320型顯微攝像系統(tǒng)選取清晰視野拍照。結(jié)果判定：陽性表達為細胞核與核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。每張切片隨機選取3個視野(高倍鏡×400)，每個視野隨機選取5個2 cm×3 cm大小的范圍，參照Fromowitz評分法〔5〕，綜合光密度值(MOD,即：細胞核陽性的細胞染色深度)和染色范圍兩種測定結(jié)果進行統(tǒng)計：①0分=無著色，1分=淡黃色，2分=棕黃色，3分=棕褐色；②0分即染色范圍<5%，1分即染色范圍5%～25%，2分即染色范圍26%～50%，3分即染色范圍51%～75%，4分即染色范圍>75%。測定結(jié)果中①+②：<2分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～5分為中度陽性()，6～7分為強陽性()。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1大鼠壓力性潰瘍模型的制備 通過3個周期、歷時7.5 h對大鼠股薄肌的壓迫，可以成功復(fù)制大鼠壓力性潰瘍模型?？梢妷毫π詽儾课怀霈F(xiàn)明顯的紅腫破潰，皮膚完整性受損甚至有小水泡形成。造模后大鼠皮膚呈現(xiàn)紅紫狀，可見皮膚已游離于皮下組織，水泡若隱若現(xiàn)，造模次日，即可見水泡破潰，皮膚防御防線受損。見圖1。

2.2硫酸鋅對壓力性潰瘍大鼠瘡面的愈合作用 造模后14 d，模型組可見瘡面組織明顯且深，部分部位可見感染，與模型組比較，黃芪陽性對照組及硫酸鋅不同劑量組的瘡面均明顯好轉(zhuǎn)，其中，硫酸鋅高劑量組皮膚顏色已經(jīng)接近正常對照組，與黃芪陽性對照組效果相當，硫酸鋅中、低劑量組仍有少量皮膚破損，但大部分皮損已經(jīng)處于結(jié)痂階段，表明，硫酸鋅具有一定的促進瘡面愈合、促進生肌的作用。見圖2。

2.3硫酸鋅對壓力性潰瘍大鼠血清中SOD、MDA含量的影響 與正常對照組比較，模型組SOD值明顯下降、MDA值明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，黃芪陽性對照組、硫酸鋅高、中、低劑量組SOD值均明顯上升、MDA值明顯下降(P<0.05)，其中硫酸鋅不同劑量組中，以高劑量組的SOD、MDA含量與正常對照組最為接近，提示：硫酸鋅具有一定的清除壓力性潰瘍瘡面氧自由基、修復(fù)瘡面損傷細胞的功能。見表1。

2.4硫酸鋅對壓力性潰瘍大鼠血清中TNF-α含量的影響 與正常對照組比較，模型組TNF-α含量明顯上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，黃芪陽性對照組、硫酸鋅不同劑量組TNF-α含量均顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，提示TNF-α可能參與了壓力性潰瘍的病理過程，硫酸鋅可以促進壓力性潰瘍瘡面的愈合。見表1。

2.5硫酸鋅對大鼠壓力性潰瘍組織治療效果的病理學(xué)觀察 病理HE染色顯示，正常對照組結(jié)締組織疏松，無炎細胞浸潤、血管擴張及充血等，模型組可見大量炎癥細胞浸潤，血管擴張、充血明顯；與模型組比較，黃芪陽性對照組可見有少量的炎細胞，硫酸鋅高劑量組可見少量的炎細胞、血管擴張充血減輕、并有新生血管出現(xiàn)，中、低劑量組炎性細胞浸潤較少，血管擴張也有所減輕。見圖3。

圖1 大鼠壓力性潰瘍模型的制備

圖2 造模結(jié)束后14 d各組壓力性潰瘍瘡面的形態(tài)學(xué)變化

組別TNF-α(pg/ml)SOD(U/ml)MDA(nmol/ml)正常對照組708.84±54.75131.56±4.972.64±0.74模型組1382.04±174.002)83.16±3.071)13.13±1.681)黃芪陽性對照組801.24±21.734)121.41±2.423)5.72±0.673)硫酸鋅高劑量組809.77±12.964)111.99±2.343)4.70±0.883)中劑量組902.55±26.094)105.11±2.103)7.13±0.803)低劑量組1101.30±54.174)94.08±3.413)10.08±0.793)

與正常對照組比較:1)P<0.01，2)P<0.05；與模型組比較:3)P<0.01，4)P<0.05

2.6硫酸鋅對大鼠組織中NF-κB p65蛋白表達的影響 免疫組化結(jié)果表明，正常對照組大鼠肌肉組織中細胞核及核內(nèi)基本無著色，呈陰性；模型組中可見細胞核與核內(nèi)出現(xiàn)大量的彌漫型、灶型、片簇型棕黃色顆粒，表達呈現(xiàn)強陽性；與模型組比較，硫酸鋅不同劑量組的細胞核及核內(nèi)表達較模型組明顯減少且著色淺，其中高劑量組的效果與黃芪陽性對照組相當，呈現(xiàn)弱陽性。見圖4。

圖3 硫酸鋅對大鼠壓力性潰瘍組織治療效果的病理學(xué)觀察(×100)

圖4 硫酸鋅對SD大鼠組織中NF-κB p65蛋白表達的影響(×400)

3 討 論

研究表明，壓力和營養(yǎng)因素是壓力性潰瘍發(fā)生最為關(guān)鍵的兩大因素，同時，壓力性潰瘍相對于其他潰瘍而言，有難愈合的特點，一直是護理領(lǐng)域的重要難題之一。鋅作為與傷口恢復(fù)最為密切的元素之一，硫酸鋅對于傷口恢復(fù)及骨折修復(fù)有著不俗的療效。鋅具有多種重要的生理功能，是人體必需的微量元素之一〔6〕。本研究通過成功制備大鼠壓力性潰瘍模型，研究不同劑量的硫酸鋅劑量組對于大鼠壓力性潰瘍部位的保護作用，并與黃芪注射液的療效進行比較，以探索硫酸鋅對于壓力性潰瘍的治愈效果及其可能機制。本研究結(jié)果證明，硫酸鋅對于大鼠壓力性潰瘍部位有一定的保護作用，其中硫酸鋅高劑量組壓力性潰瘍愈合最好，與黃芪陽性對照組效果相當；硫酸鋅中劑量組次之。推測是由于硫酸鋅中的鋅離子，可以參與體內(nèi)清除氧自由基、免疫調(diào)節(jié)等過程，增加了機體抵抗力、從而促進壓力性潰瘍部位的愈合。

SOD作為自由基清除劑的關(guān)鍵酶對機體的氧化和抗氧化平衡起著重要作用。SOD能夠清除超氧陰離子自由基，保護細胞免受損傷，其活性在一定程度上間接反映了機體清除氧自由基的能力。MDA是氧自由基作用于生物膜多聚不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物。氧自由基不僅通過多聚不飽和脂肪酸過氧化引起細胞損傷，還可以通過脂質(zhì)過氧化物的分解產(chǎn)物引起細胞損傷。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：隨著硫酸鋅劑量的增加，SOD的活性逐漸增加，MDA的含量逐漸減少，表明，在壓力性潰瘍發(fā)生時，可產(chǎn)生成大量的超氧陰離子自由基，導(dǎo)致細胞膜及細胞相關(guān)成分出現(xiàn)氧化損傷，硫酸鋅可減輕氧化應(yīng)激的組織損傷過程，從而達到了對于受損皮膚的修復(fù)作用。

TNF-α作為一種促炎癥細胞因子，在壓力性潰瘍組織中的作用是使炎性細胞聚集到局部炎癥組織，引起血管炎性反應(yīng)；NF-κB p65作為一類核內(nèi)的炎性轉(zhuǎn)錄因子家族，精密的調(diào)控著炎性反應(yīng)和凋亡信號，參與了壓力性潰瘍組織損傷的病理改變過程〔7〕。本研究結(jié)果顯示，持續(xù)的壓力可以啟動炎癥級聯(lián)反應(yīng)，使模型組TNF-α表達增高，同時，NF-κB在凋亡過程中屬于下游調(diào)節(jié)因素，TNF-α可以通過NF-κB發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，故模型組NF-κB p65蛋白表達呈現(xiàn)強陽性。本研究結(jié)果還顯示，硫酸鋅可以使血清中TNF-α表達含量降低，使NF-κB p65蛋白表達強度下降，推測，硫酸鋅可以對壓力和氧化應(yīng)激等外界刺激產(chǎn)生強大的調(diào)節(jié)作用，使TNF-α表達降低，繼而抑制NF-κB調(diào)控樞紐，減少細胞凋亡，共同阻止組織向不可逆損傷方向發(fā)展、促進壓力性潰瘍瘡面的愈合過程。

其作用機制可能與增加SOD活性、降低MDA含量，進而增加了機體清除氧自由基的能力及抑制TNF-α、NF-κB p65的表達，通過TNF-α與相關(guān)受體結(jié)合進一步抑制了NF-κB介導(dǎo)的凋亡通路，阻止組織中細胞凋亡的發(fā)展，促進肉芽組織的增生，從而起到促進壓力性潰瘍瘡面愈合的作用。

本研究的局限性在于僅在動物層面探討了硫酸鋅對促進壓力性潰瘍瘡面的愈合作用，如果能在臨床上進行運用，加以一些傳統(tǒng)的壓力性潰瘍治療方法，如翻身、按摩、擦洗、熱敷及加強營養(yǎng)等，效果可能更好，在以后的研究和工作中將進一步進行研究和探討。