運(yùn)動訓(xùn)練誘導(dǎo)miR-210和BDNF的表達(dá)對腦缺血缺氧后新生鼠血管再生的機(jī)制研究

范海玲　周露丹　梁國安　王麗珍

[摘要] 目的 探討運(yùn)動訓(xùn)練對新生鼠在缺氧缺血性腦損傷（HIBD）后微小RNA210（miR-210）、腦源性神經(jīng)生長因子（BDNF）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）表達(dá)的影響。 方法 采用Rice-Vannucci法制備新生鼠HIBD模型，分為對照組（C）、假手術(shù)組（S）、模型組（M）和運(yùn)動訓(xùn)練組（T），造模7 d后開始訓(xùn)練1周、2周，取腦組織后采用HE染色觀察腦細(xì)胞的病理改變，免疫組化法檢測腦組織BDNF和VEGF的表達(dá)，實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測腦組織miR-210表達(dá)水平。 結(jié)果 C組和S組大腦組織結(jié)構(gòu)清晰，造模后神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)變性和壞死。T組和M組在各時(shí)間點(diǎn)與S組比較，miR-210、BDNF和VEGF的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。T組和M組中隨著時(shí)間的延長，miR-210、BDNF和VEGF的表達(dá)呈上升趨勢，在14 d和21 d后T組和M組比較，上述指標(biāo)表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。VEGF表達(dá)與miR-210和BDNF呈明顯正相關(guān)（r=0.841，0.818，P均<0.01）。 結(jié)論 運(yùn)動訓(xùn)練干預(yù)新生小鼠缺氧缺血腦損傷可增加miR-210和BDNF的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腦組織VEGF表達(dá)，最終對神經(jīng)損傷起到保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞] 運(yùn)動訓(xùn)練;缺氧缺血性腦損傷;微小RNA210;血管內(nèi)皮生長因子;腦源性神經(jīng)生長因子

[中圖分類號] R722.1? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）28-0035-05

[Abstract] Objective To investigate the influence of exercise training on the expression of microRNA210（miR-210）， brain-derived nerve growth factor （BDNF） and vascular endothelial growth factor （VEGF） in neonatal rats after hypoxic-ischemic brain damage （HIBD）. Methods The newborn rat HIBD models were prepared by Rice-Vannucci method and divided into control group （C）， sham operation group （S）， model group （M） and exercise training group （T）. After 7 days of modeling， training was started for 1 week and 2 weeks. After taking brain tissue， the pathological changes of brain cells were observed by HE staining. The expression of BDNF and VEGF in brain tissue was detected by immunohistochemistry. The expression of miR-210 in brain tissue was detected by real-time quantitative fluorescent PCR. Results The brain tissue structure of group C and group S was clear， and the nerve cells showed degeneration and necrosis after modeling. The expressions of miR-210， BDNF and VEGF were significantly different between group T， group M and group S at each time point （P<0.05）. The expressions of miR-210， BDNF and VEGF increased in the T group and M group over time. There were significant differences in the expression of the above indexes between the T and M groups at 14 d and 21 d（P<0.05）. There was a significant positive correlation between VEGF expression and miR-210， BDNF（r=0.841， 0.818， P<0.01）. Conclusion Exercise training intervention in neonatal mice with hypoxic-ischemic brain damage can increase the expression of miR-210 and BDNF， and then promote the expression of VEGF in brain tissue， and finally protect the nerve injury.

[Key words] Exercise training; Hypoxic ischemic brain damage; MicroRNA210; Vascular endothelial growth factor; Brain-derived nerve growth factor

新生兒缺氧缺血性腦損傷（Hypoxic-ischemic brain damage，HIBD）是指圍產(chǎn)期受各種因素影響而導(dǎo)致的腦損傷，臨床會出現(xiàn)腦病的各種表現(xiàn)，遺留多種后遺癥，如腦性癱瘓、發(fā)育遲緩等。因此尋找各種干預(yù)手段是修復(fù)缺氧缺血后中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）腦損傷的關(guān)鍵基礎(chǔ)之一，目前康復(fù)訓(xùn)練是臨床研究的熱點(diǎn)[1]。既往研究表明運(yùn)動訓(xùn)練可誘導(dǎo)缺氧缺血腦損傷后的腦血管再生，促進(jìn)神經(jīng)元再生[2-3]。本研究探討運(yùn)動訓(xùn)練對HIBD新生鼠腦組織微小RNA210（miR-210）、腦源性神經(jīng)生長因子（brain-derived growth factor，BDNF）和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達(dá)的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 動物來源與分組

入組C57/BL6新生小鼠160只[許可證號：SYXK（浙）2016-0006]，購自溫州醫(yī)科大學(xué)動物SPF實(shí)驗(yàn)中心，平均體重（3.0±0.5）g，實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)，7日齡時(shí)采用Rice-Vannucci法制備新生鼠HIBD模型，隨機(jī)分為對照組（C，不做任何處理）、假手術(shù)組（S，只做頸總動脈分離手術(shù)，不結(jié)扎，不做缺氧處理）、模型組（M，做缺血缺氧處理）和運(yùn)動訓(xùn)練組（T，缺血缺氧處理后再做運(yùn)動訓(xùn)練），造模7 d后開始訓(xùn)練1周、2周，每組8只。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

Trizol試劑盒、內(nèi)參基因U6（美國Invitrogen公司）;VEGF多克隆抗體（上海研生實(shí)業(yè)有限公司）;BDNF多克隆抗體（武漢博士德生物工程公司），HE染色試劑盒（武漢博士德生物工程公司）;辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗小鼠二抗（武漢博士德生物工程公司）等。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

日本Shandon公司的石蠟切片機(jī);美國ABI公司的實(shí)時(shí)定量PCR儀;日本Olympus公司的BX51光學(xué)顯微鏡，美國Media Cybernetics公司的Image ProPlus 6.0彩色醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)等。

1.4 模型制備

7日齡小鼠HIBD模型參照經(jīng)典Rice-Vannucci法[4]進(jìn)行操作，小鼠仰臥位置于解剖板上，麻醉后在解剖鏡下分離出左側(cè)頸總動脈，結(jié)扎動脈后再縫合傷口，10 min內(nèi)完成操作過程。術(shù)后2 h將小鼠放入37℃的恒溫密閉玻璃瓶內(nèi)，并輸入混合氣體（8%氧氣和92%氮?dú)猓?，持續(xù)1 h后將存活的小鼠送回母鼠身邊。S組：只是分離左頸總動脈，而無缺血缺氧處理。

1.5 模型的評估

對新生小鼠進(jìn)行HIBD處理后，在1 d時(shí)觀察其3種發(fā)育反射：（1）翻正反射：小鼠獨(dú)自從仰臥位翻成俯臥位，最后至四爪放平，記錄整個(gè)過程的時(shí)間;（2）趨地反射：記錄小鼠在斜坡上（傾斜角度為40°）從頭朝下運(yùn)動至扭轉(zhuǎn)身體（90°），同時(shí)頭朝上時(shí)需要的時(shí)間;（3）懸崖逃避反射：將小鼠放在高出水平地面1 m的桌面，同時(shí)前爪懸掛桌面邊緣之外，觀察小鼠離開桌面邊緣需要的時(shí)間（其扭轉(zhuǎn)身體90°）;若后2項(xiàng)反射完成時(shí)間超過20 s就剔除。另外模型組小鼠沒有出現(xiàn)向右轉(zhuǎn)圈也剔除。

1.6 標(biāo)本采集

在造模后7 d，14 d，21 d處死小鼠，取出腦組織，放入4%多聚甲醛液定24 h（4℃），之后脫水、石蠟包埋，最后連續(xù)冠狀切片厚4 μm左右。取腦組織石蠟切片做HE染色，光鏡下觀察腦組織的病理變化。

1.7 免疫組化染色

取腦組織切片先脫蠟，再滅活內(nèi)源性酶，PBS沖洗;微波修復(fù)抗原10 min，降至室溫，再PBS沖洗;滴加VEGF或BDNF多克隆抗體（1：100），4 ℃孵育過夜，復(fù)溫45 min，PBS沖洗;滴加二抗（山羊抗兔IgG抗體-HRP多聚體），在37℃恒溫箱中進(jìn)行20 min孵育，PBS沖洗干凈后使用DAB顯色，蘇木精復(fù)染;陰性對照：用PBS代替一抗。陽性表達(dá)為出現(xiàn)棕黃色或褐色顆粒。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測miR-210的表達(dá)

取出腦組織樣本，脫蠟處理，按照RNA抽提試劑盒逐步提取總RNA。miR-210特異引物（上游：5-AAGGGCGGCTATGGAAAGGCAA-3，下游：5-AAT-CCACGATGAAGCGGATGCT-3），加入PCR擴(kuò)增體系中，反應(yīng)條件：15 s預(yù)變性、變性30 s變性，溫度均95℃，40 s延伸，溫度60℃，循環(huán)45次。目的基因表達(dá)量用2-ΔΔCt表示，內(nèi)參基因?yàn)閁6，所有標(biāo)本檢測3次，最后得出miR-210的相對表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊的用Dunnett t3 檢驗(yàn)，相關(guān)性采用Pearson相關(guān)進(jìn)行分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HIBD小鼠短期神經(jīng)功能的改變

在小鼠HIBD后1 d時(shí)間約80%的小鼠出現(xiàn)向右轉(zhuǎn)圈，發(fā)育反射結(jié)果提示S組小鼠無明顯的神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)，與S組（2.90±0.73）s比較，造模組（3.96±0.55）s完成反射的時(shí)間較長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），且有神經(jīng)功能缺損的表現(xiàn)。

2.2 腦組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變

小鼠腦組織缺血缺氧后1 d，C組和S組腦細(xì)胞排列整齊，未見神經(jīng)細(xì)胞變性壞死等明顯病理變化。造模后缺血側(cè)腦組織結(jié)構(gòu)模糊，細(xì)胞和間質(zhì)水腫較嚴(yán)重，出現(xiàn)明顯空泡化。

2.3 大腦皮層miR-210和BDNF表達(dá)

C組和S組小鼠腦組織miR-210和BDNF表達(dá)在HIBD后各時(shí)間點(diǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05）;與HIBD后第1天比較，HIBD后第3天、第7天、第14天、第21天，M組miR-210和BDNF表達(dá)呈上升趨勢;HIBD后各時(shí)間點(diǎn)M組miR-210和BDNF表達(dá)明顯高于C組和S組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。T組在第14天、第21天時(shí)miR-210和BDNF表達(dá)明顯高于M組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05），見表1、2、封三圖9。

2.4 大腦皮層VEGF蛋白的表達(dá)

C組和S組小鼠腦組織VEGF表達(dá)在HIBD后各時(shí)間點(diǎn)比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P>0.05）;與造模后第1天比較，在第3天、第7天、第14天、第21天時(shí)M組VEGF表達(dá)呈上升趨勢;HIBD后各時(shí)間點(diǎn)M組VEGF表達(dá)明顯高于C組和S組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。T組在第14天、第21天時(shí)VEGF表達(dá)明顯高于M組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05），見表3、封三圖10。VEGF的表達(dá)與miR-210和BDNF的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.841，0.818 P均<0.01），見圖1。

3 討論

缺氧缺血性腦損傷的病理生理機(jī)制較為復(fù)雜，HIBD后容易發(fā)生細(xì)胞凋亡，損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)多種功能，尤其是認(rèn)知和運(yùn)動。因此，減輕缺血缺氧性腦損傷的病理學(xué)損害，促進(jìn)腦血管和神經(jīng)元再生是改善早期腦功能的關(guān)鍵。在成人的急性腦缺血中，適當(dāng)?shù)倪\(yùn)動訓(xùn)練可改善腦功能，運(yùn)動訓(xùn)練對HIBD所致的腦癱患兒的作用機(jī)制尚不明確，可能與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性理論有關(guān)，近年來認(rèn)為涉及到腦血管再生、NSCs的增殖、分化以及遷移等[5]。楊麗君等[6]研究顯示在新生鼠進(jìn)行缺血缺氧處理后對腦組織的神經(jīng)元和髓鞘造成了一定的損傷，且本研究顯示新生鼠HIBD后缺血側(cè)腦組織結(jié)構(gòu)模糊，細(xì)胞和間質(zhì)水腫較嚴(yán)重，出現(xiàn)明顯空泡化，所以尋找到阻止未成熟腦的腦損傷進(jìn)程的方法是目前研究的熱點(diǎn)。

VEGF與缺氧缺血性腦損傷的修復(fù)機(jī)制密不可分，對腦血管的新生有強(qiáng)烈的誘導(dǎo)作用。新生鼠腦組織的可塑性要高于成年鼠，新生鼠在正常生理機(jī)制下，血管新生在生后2～3周達(dá)到高峰，而在HIBD新生鼠，血管新生持續(xù)時(shí)間可延遲1周左右[7-8]，因此本研究選取的時(shí)間點(diǎn)是造模后1周、2周和3周，結(jié)果顯示新生鼠HIBD后VEGF的表達(dá)在各時(shí)間點(diǎn)呈上升趨勢，提示腦組織缺血缺氧可以刺激局部血管再生。也有研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血再灌注大鼠中，1周的運(yùn)動訓(xùn)練通過上調(diào)內(nèi)皮型NOS增加了VEGF的表達(dá)，4周的運(yùn)動訓(xùn)練改善了腦功能，可能與上調(diào)缺血半暗區(qū)腦血管密度的表達(dá)有關(guān)[9-12];在新生鼠HIBD后2周，早期的環(huán)境刺激可減少HIBD所致的認(rèn)知缺陷，從青春期開始的運(yùn)動訓(xùn)練直到成年，減少了損傷側(cè)的腦梗死體積，最終改善HIBD所致的學(xué)習(xí)記憶障礙[13]。本研究結(jié)果中運(yùn)動訓(xùn)練促進(jìn)了VEGF表達(dá)，在血管再生的高峰期，隨著時(shí)間的延長，表達(dá)逐漸上升，尤其在生后1～2周的上升幅度較大，提示早期的康復(fù)運(yùn)動訓(xùn)練在神經(jīng)損傷修復(fù)中占有重要角色。

miR-210為缺氧特異性微小RNA，采集腦卒中患者血漿，研究結(jié)果顯示血中miR-210表達(dá)水平低者提示其預(yù)后不佳[14]，對人牙周膜干細(xì)胞進(jìn)行缺氧處理，細(xì)胞miR-210表達(dá)增加，誘導(dǎo) VEGF的表達(dá)增加[15]，本研究結(jié)果顯示新生鼠HIBD后miR-210表達(dá)呈不斷上升趨勢，各時(shí)間點(diǎn)均高于假手術(shù)組，運(yùn)動訓(xùn)練后miR-210表達(dá)更高，miR-210與VEGF表達(dá)呈正相關(guān)，說明上調(diào)且miR-210與血管新生有不可分割的聯(lián)系。BDNF是一個(gè)內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)因子，BDNF與VEGF關(guān)系密切[16-17]，既往研究發(fā)現(xiàn)在腦缺血再灌注大鼠中可影響B(tài)DNF和VEGF的表達(dá)，跑臺運(yùn)動可增加BDNF表達(dá)水平，促進(jìn)VEGF誘導(dǎo)的血管再生[18-19]。另外，對青少年進(jìn)行為期2周的運(yùn)動訓(xùn)練，可引起腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的增加和工作記憶的改善，這可能是通過改善腦組織氧合、營養(yǎng)輸送和增加BDNF的mRNA表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的[20]。本研究提示BDNF在新生兒HIBD表達(dá)與miR-210、VEGF呈同步性，運(yùn)動訓(xùn)練后明顯增加了VEGF、miR-210和BDNF的表達(dá)，相關(guān)性分析提示VEGF與miR-210和BDNF的表達(dá)呈正相關(guān)，提示運(yùn)動訓(xùn)練干預(yù)新生小鼠缺氧缺血腦損傷可增加miR-210和BDNF的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腦組織VEGF表達(dá)，誘導(dǎo)腦血管再生。

綜上所述，在新生鼠HIBD后，我們推測運(yùn)動訓(xùn)練可能通過調(diào)節(jié)miR-210/BDNF起到神經(jīng)損傷的內(nèi)源性保護(hù)作用，為缺血缺氧腦損傷患兒早期開展運(yùn)動訓(xùn)練為中心的綜合康復(fù)提供理論依據(jù)，最終提高HIBD患兒的生活質(zhì)量。

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（收稿日期：2019-02-25）