肝硬化及肝硬化合并糖尿病患者腸道微生態(tài)研究

凌海燕　陳凍伢

[摘要] 目的 探討肝硬化及肝硬化合并糖尿病患者腸道微生態(tài)狀況。 方法 選擇2016年1月～2018年6月在醫(yī)院診斷治療的肝硬化患者60例為研究對象，其中肝硬化30例，肝硬化合并糖尿病30例，另選擇健康體檢者30例為對照組。比較三組糞便pH值與細菌比濁度，腸道類桿菌、雙歧桿菌、梭狀芽孢菌、大腸桿菌、腸球菌、真桿菌-球形梭菌水平，比較不同Child-Pugh分級患者類桿菌、雙歧桿菌、梭狀芽孢菌、大腸桿菌、腸球菌、真桿菌-球形梭菌水平。 結(jié)果 肝硬化合并糖尿病組pH值顯著高于肝硬化組與對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;肝硬化組顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。肝硬化合并糖尿病組類桿菌、雙歧桿菌、梭狀芽孢菌、大腸桿菌、腸球菌、真桿菌-球形梭菌水平顯著低于肝硬化組與對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;肝硬化組顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。肝硬化組與肝硬化糖尿病組不同Child-Pugh分級患者6種細菌計數(shù)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。 結(jié)論 肝硬化與肝硬化合并糖尿病患者腸道微生態(tài)異常，尤其以合并糖尿病的患者變化更明顯。

[關(guān)鍵詞] 肝硬化;糖尿病;腸道微生態(tài);肝硬化合并糖尿病

[中圖分類號] R575.2;R587.1? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）28-0012-04

[Abstract] Objective To explore the intestinal microecology of patients with liver cirrhosis and cirrhosis complicated with diabetes. Methods Sixty patients with cirrhosis diagnosed and treated in our hospital from January 2016 to June 2018 were enrolled， including 30 patients with cirrhosis and 30 patients with cirrhosis and diabetes. Another 30 healthy subjects were selected as the control group. The pH values of feces and the turbidity of the bacteria were compared， as well as the levels of Enterobacter， Bifidobacterium， Clostridium， Escherichia coli， Enterococcus， and Eubacterium-Clostridium globi. The levels of Bacteroides， Bifidobacterium， Clostridium， Escherichia coli， Enterococcus， and Eubacterium-Clostridium globi were compared between different Child-Pugh grades. Results The pH value of cirrhosis and diabetes group was significantly higher than those of the cirrhosis group and control group（P<0.05）， and that of the cirrhosis group was significantly higher than that of the control group， the differences were statistically significant（P<0.05）. The levels of Enterobacter， Bifidobacterium， Clostridium， Escherichia coli， Enterococcus， and Eubacterium-Clostridium globi were significantly lower in the cirrhosis and diabetes group than those in the cirrhosis group and control group， and those of the cirrhosis group were significantly lower than that of the control group， the differences were statistically significant（P<0.05）. There was no significant difference in the levels of six bacterial counts between the cirrhosis group and the cirrhosis and diabetes group（P>0.05）. Conclusion The intestinal micro-ecology of patients with cirrhosis and cirrhosis plus diabetes is abnormal， especially in patients combined with diabetes.

[Key words] Cirrhosis; Diabetes; Intestinal microecology; Cirrhosis with diabetes

肝硬化是常見的慢性進行性肝病，由一種或多種病因長期或反復(fù)作用形成的彌漫性肝損害，晚期出現(xiàn)上消化道出血、肝性腦病、繼發(fā)感染等并發(fā)癥。1987年世界衛(wèi)生組織提供的數(shù)字顯示肝硬化人群平均發(fā)病率大約17.1/10萬，在我國肝硬化發(fā)病率占同期住院患者總數(shù)的1%左右，以肝炎病毒感染后肝硬化最多見。有研究顯示肝硬化患者腸道微生態(tài)發(fā)生變化，腸道中6種細菌數(shù)量以及構(gòu)成比發(fā)生變化[1]。腸道微生態(tài)環(huán)境變化可導(dǎo)致腸腔pH值水平升高，增加肝性腦病等嚴重并發(fā)癥的發(fā)生[2]。有研究顯示，腸道微生態(tài)與2型糖尿病的發(fā)生及發(fā)展也有密切關(guān)系[3]。本研究分析肝硬化以及肝硬化合并糖尿病患者腸道微生態(tài)狀況，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2016年1月～2018年6月在醫(yī)院診斷治療的肝硬化患者60例為研究對象，其中肝硬化30例，肝硬化合并糖尿病30例。納入標本[4]：肝硬化診斷明確，合并2型糖尿病或未合并2型糖尿病，年齡≥18周歲，性別不限，依從性好，對本次研究知情同意。排除標準[4]：患有心血管、呼吸等其他系統(tǒng)器質(zhì)性病變，惡性腫瘤，2周內(nèi)應(yīng)用抗生素、益生菌、激素等影響腸道微生態(tài)藥物。肝硬化組30例，其中男18例，女12例，年齡39～77歲，平均（53.1±6.2）歲;慢性乙型肝炎肝硬化21例，酒精性肝硬化6例，自身免疫性肝硬化2例，慢性丙型肝炎肝硬化1例。肝硬化并糖尿病者30例，其中男16例，女14例，年齡40～77歲，平均（52.8±6.8）歲;慢性乙型肝炎20例，酒精性肝硬化5例，自身免疫性肝硬化3例，慢性丙型肝炎肝硬化2例。另選擇健康體檢者30例為對照組，其中男15例，女15例，年齡35～75歲，平均（53.0±5.9）歲。三組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

1.2檢測方法

收集新鮮糞便，置于無菌盒，-80℃凍存待測。采用精密度酸度計（北京新骉儀器）測定糞便的pH值。取糞便0.5 g，加入4.5 mL等滲鹽水中，震蕩混勻5 min，1000轉(zhuǎn)/min離心2 min，取上清0.2 mL，加入等滲鹽水至2 mL，采用比濁儀測定比濁度。取糞便0.5 g，加過濾處理過的磷酸鹽緩沖液（普諾賽生物）4.5 mL。漩渦震蕩混勻，1000轉(zhuǎn)/min離心2 min，取上清1 mL，加入4%多聚甲醛溶液（北京雷根生物技術(shù)有限公司）3 mL中固定，4℃過夜，分裝，固定處理，溶菌酶稀釋緩沖液消化10 min，0.1%焦炭酸二乙酯水溶液清洗3次，自然干燥，將濃度為1.0 μg/mL的探針100 μL均勻加之涂片表面，50℃恒溫箱雜交12 h，漂洗緩沖液50℃漂洗30 min，超純水快速漂凈，自然干燥。LCSM觀察，計數(shù)每個視野中細菌熒光信號，計數(shù)細菌數(shù)。

1.3 觀察指標

比較三組糞便pH值及細菌比濁度、腸道類桿菌、雙歧桿菌、梭狀芽孢菌、大腸桿菌、腸球菌、真桿菌-球形梭菌水平;肝硬化合并糖尿病組以及肝硬化組不同Child-Pugh分級患者6種細菌計數(shù)水平。Child-Pugh分級[5]：將患者一般狀況、腹水、血清膽紅素、血清白蛋白濃度及凝血酶原時間的不同狀態(tài)分為三個層次，分別計1、2和3分，并將5個指標計分進行相加，總和最低分為5分，最高分為15分;A級：5～6分;B級：7～9分;C級：≥10分。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS15.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，計量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用t檢驗或F檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組糞便pH值與細菌比濁度比較

見表1。肝硬化合并糖尿病組pH值顯著高于肝硬化組與對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;肝硬化組顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。三組細菌比濁度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 三組腸道6種細菌計數(shù)比較

見表2。肝硬化合并糖尿病組類桿菌、雙歧桿菌、梭狀芽孢菌、大腸桿菌、腸球菌、真桿菌-球形梭菌水平顯著低于肝硬化組與對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;肝硬化組類桿菌、雙歧桿菌、梭狀芽孢菌、大腸桿菌、腸球菌、真桿菌-球形梭菌水平顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.3 肝硬化合并糖尿病組不同Child-Pugh分級患者6種細菌計數(shù)水平

見表3。肝硬化合并糖尿病組不同Child-Pugh分級患者6種細菌計數(shù)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.4 肝硬化組不同 Child-Pugh分級患者6種細菌計數(shù)水平

見表4。肝硬化組不同Child-Pugh分級患者6種細菌計數(shù)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

3討論

腸道微生態(tài)包括腸道固有菌群、腸上皮細胞、腸道黏膜免疫系統(tǒng)。人體腸道內(nèi)寄生著10萬億個細菌，它們能影響體重和消化能力、抵御感染和自體免疫疾病的患病風(fēng)險，還能控制人體對癌癥治療藥物的反應(yīng)。腸道正常菌群能合成多種人體生長發(fā)育必需的維生素，如B族維生素（維生素B1、B2、B6、B12）、維生素K、煙酸、泛酸等，還能利用蛋白質(zhì)殘渣合成必需氨基酸，如天冬門氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸和蘇氨酸等，并參與糖類和蛋白質(zhì)的代謝，同時還能促進鐵、鎂、鋅等礦物元素的吸收。這些營養(yǎng)物質(zhì)對人類的健康有著重要作用，一旦缺少會引起多種疾病。完整的腸上皮細胞與細胞間緊密連接是腸道第一道防線。腸道黏膜免疫系統(tǒng)包括Peyers斑、黏膜固有層和上皮內(nèi)的免疫位點。人類與微生物之間的動態(tài)平衡稱為微生態(tài)平衡，影響其微生態(tài)平衡的因素有外環(huán)境因素，也有宿主因素。外環(huán)境主要是通過改變宿主的生理功能產(chǎn)生的，如有益菌菌群，通過產(chǎn)生細菌素、抗生素和其代謝產(chǎn)物及爭奪營養(yǎng)、爭奪空間以阻止過路菌群入侵，保持自身的穩(wěn)定性。腸道微生態(tài)平衡時，可以保持宿主的正常生理功能，如營養(yǎng)、免疫、消化等。生態(tài)失調(diào)可因慢性病、癌癥、手術(shù)、輻射感染、抗生素不合理應(yīng)用等引起。腸道有龐大、復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，也是人體最大的貯菌庫與內(nèi)毒素池。

肝臟與腸道菌群通過門靜脈及淋巴管在解剖上有密切的聯(lián)系，同時在生理功能上建立不可分割的相互關(guān)聯(lián)[6，7]。腸道菌群提供VitK等促進肝凝血因子合成、提高肝臟枯否氏細胞數(shù)量及功能，肝臟通過分泌sIgA、膽汁酸等維持腸道菌群生態(tài)平衡[8，9]。肝硬化時腸道微生態(tài)失衡，腸桿菌、葡萄球菌以及梭菌顯著增加，雙歧桿菌、乳酸桿菌等有益厭氧菌減少，導(dǎo)致腸道微生態(tài)失衡，與肝硬化的病因無關(guān)[10，11]。有學(xué)者認為這些變化與肝硬化Child-Pugh分級的嚴重程度有關(guān)。在本次研究中，不同的Child-Pugh分級患者類桿菌、雙歧桿菌、梭狀芽孢菌、大腸桿菌、腸球菌、真桿菌-球形梭菌水平?jīng)]有顯著差異，可能與納入樣本量少有關(guān)，期待今后的研究中加大樣本量，進一步研究。肝硬化患者膽汁分泌減少或成分改變，低蛋白血癥，門脈高壓，免疫力下降，加上抗生素、制酸劑的不合理應(yīng)用，這些均會對患者的腸道微生態(tài)產(chǎn)生嚴重影響[12，13]。腸道菌群失調(diào)在肝硬化并發(fā)癥例如細菌感染、肝性腦病、內(nèi)毒素血癥的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用[14]。70%～80%為革蘭陰性桿菌以大腸埃希菌為主，是自發(fā)性腹膜炎、尿路感染、肺炎的主要病原菌。細菌易位是細菌與細菌產(chǎn)物從腸腔進入腸系膜淋巴結(jié)和其他腸外器官與部位，是肝硬化患者發(fā)生自發(fā)性細菌性腹膜炎與內(nèi)毒素血癥的關(guān)鍵步驟。宿主免疫功能下降，革蘭陰性菌過度生長，腸黏膜屏障受損宿主免疫防御機制受損占主導(dǎo)地位，大量研究表明腸道細菌易位與自發(fā)性腹膜炎的發(fā)生發(fā)展密切關(guān)系[15]。對自發(fā)性腹膜炎的流行病學(xué)調(diào)查顯示，有超過23%的肝硬化腹水患者發(fā)生自發(fā)性腹膜炎，社區(qū)獲得性自發(fā)性腹膜炎以革蘭陰性菌為主，醫(yī)院獲得性以革蘭陽性菌為主，70%發(fā)生在Child C級患者。

氨中毒學(xué)說和假神經(jīng)遞質(zhì)學(xué)說是目前公認的肝性腦病的發(fā)病機制。腸道菌群失調(diào)導(dǎo)致有益菌產(chǎn)生的短鏈脂肪酸減少，pH值升高，當腸道處于堿性環(huán)境時，腸道吸收氨增加，同時有害菌過度生長，胺、氨等腸源性毒物濃度升高，均可誘發(fā)肝性腦病的發(fā)生[16-18]。在本次研究中，肝硬化患者以及肝硬化合并糖尿病患者腸道pH值顯著高于對照組，并且肝硬化合并糖尿病患者升高更為明顯，這也提示患者存在腸道微生態(tài)平衡紊亂，并且增加發(fā)生肝性腦病的風(fēng)險。腸道是機體最大的內(nèi)毒素池，正常情況下到達肝臟低水平的內(nèi)毒素對于提高機體的免疫功能是有益的。肝臟枯否細胞數(shù)量與肝功能下降，內(nèi)毒素清除能力下降，腸道細菌過度生長，通常為革蘭陰性腸桿菌，腸壁屏障功能受損，通透性增加，這些均可增加腸源性內(nèi)毒素血癥。肝硬化與內(nèi)毒素血癥形成惡性循環(huán)，菌群失調(diào)，大量內(nèi)毒素入血導(dǎo)致內(nèi)毒素血癥，而后者誘導(dǎo)一系列細胞因子并產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致肝功能持續(xù)性損害，導(dǎo)致肝功能進一步惡化。

在本次研究中，檢測腸道類桿菌、雙歧桿菌、梭狀芽孢菌、大腸桿菌、腸球菌、真桿菌-球形梭菌六種細菌。類桿菌是革蘭陰性多形性桿菌，專性厭氧，正常寄居于人和動物的腸道、口腔、上呼吸道和生殖道，比腸內(nèi)的大腸桿菌多100～1000倍，在臨床標本中，為闌尾炎和敗血癥的常見菌。雙歧桿菌是一種革蘭陽性、不運動、細胞呈桿狀、一端有時呈分叉狀、嚴格厭氧的細菌屬，廣泛存在于人和動物的消化道、陰道和口腔等環(huán)境中。雙歧桿菌作為一種生理性有益菌，對人體健康具有生物屏障、營養(yǎng)作用、抗腫瘤作用、免疫增強作用、改善胃腸道功能、抗衰老等多種重要的生理功能。雙歧桿菌和乳酸菌等有益細菌則能抑制人體有害細菌的生長，抵抗病原菌的感染，合成人體需要的維生素，促進人體對礦物質(zhì)的吸收，產(chǎn)生醋酸、丙酸、丁酸和乳酸等有機酸刺激腸道蠕動，促進排便，防止便秘以及抑制腸道腐敗作用、凈化腸道環(huán)境、分解致癌物質(zhì)、刺激人體免疫系統(tǒng)，從而提高抗病能力等方面有著重要作用。雙歧桿菌具有調(diào)節(jié)腸道菌群的作用。梭狀芽孢菌也是腸道常見菌，大多的梭狀芽孢菌能夠與機體保持共生關(guān)系，產(chǎn)生各種酶降解不能被機體消化的多糖和寡糖，這些化合物被降解所產(chǎn)生的終產(chǎn)物包括乙酸、丙酸以及丁酸，能調(diào)節(jié)腸道pH值。大腸桿菌是革蘭陰性短桿菌，是人和動物腸道中的正常棲居菌。在正常情況下大腸桿菌能競爭性抵御致病菌的進攻，同時還能幫助合成維生素K2，與人體是互利共生的關(guān)系。腸球菌為革蘭陽性（G+）球菌，廣泛分布于自然環(huán)境及人和動物消化道內(nèi)。在本次研究中，肝硬化患者腸道類桿菌、雙歧桿菌、梭狀芽孢菌、大腸桿菌、腸球菌、真桿菌-球形梭菌均顯著下降，提示患者存在明顯的腸道菌群失調(diào)，尤其是合并糖尿病的患者，下降更顯著。糖尿病是肝硬化的常見并發(fā)癥之一，是體內(nèi)胰島素活性絕對或者相對不足，或者人體組織對胰島素敏感性下降所引起的代謝性疾病，兩者均為慢性疾病，肝病導(dǎo)致糖代謝紊亂，糖尿病使肝糖原減少，兩者互相影響。既往研究顯示[19]，2型糖尿病患者腸道中會出現(xiàn)一定的菌群失調(diào)，而腸道菌群失調(diào)也可能是2型糖尿病的發(fā)病機制之一。在劉保文[20]的研究中，肝硬化患者與肝硬化合并糖尿病患者的腸道菌群結(jié)構(gòu)有很大的相似性，表現(xiàn)在菌群門綱目科屬五大水平中的組成成分大致相同，同時也存在各自的差異性，差異性表現(xiàn)在門綱目科屬五大水平中菌群所占比例，其中發(fā)現(xiàn)肝硬化合并糖尿病患者腸道中的致病菌所占比例更多，菌群失調(diào)情況嚴重，不同病因患者菌群不存在差異，肝硬化患者腸道菌群中紫單胞菌科與Child-Puch評分呈負相關(guān)，韋榮氏球菌呈正相關(guān)。在本次研究中，肝硬化患者Child-Puch分級與所檢測的幾種菌均無顯著相關(guān)性。

綜上所述，腸道是人體最大的貯菌庫與內(nèi)毒素池，肝硬化患者出現(xiàn)明顯的腸道微生態(tài)失衡，尤其是合并糖尿病的肝硬化患者，這可能增加肝硬化相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生。

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（收稿日期：2018-12-27）