搜山虎水提液對(duì)小鼠抗疲勞、耐缺氧作用的實(shí)驗(yàn)研究

劉雪婷 韋秋菊 周小蘇 楊鳳雯 羅彩鳳 黃永毅

【摘要】?目的?研究搜山虎水提液對(duì)小鼠抗疲勞及耐缺氧作用的影響。

方法?將小鼠隨機(jī)分成四組，即正常對(duì)照組和搜山虎水提液低劑量10 g/kg、中劑量20 g/kg、高劑量40 g/kg三個(gè)劑量組，連續(xù)灌胃7天后，采用小鼠負(fù)重游泳力竭實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)抗疲勞功能，通過(guò)小鼠常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)、小鼠急性腦缺血缺氧實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)其耐缺氧功能，測(cè)定小鼠血清的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性及丙二醛（maleic dialdehyde，MDA）含量，探討其發(fā)生機(jī)制，并且檢測(cè)藥液對(duì)小鼠肝臟是否有影響。

結(jié)果?搜山虎水提液低、中、高劑量組的小鼠負(fù)重游泳力竭時(shí)間均長(zhǎng)于正常對(duì)照組 （P<0.05或0.01），而低、中、高三個(gè)劑量組兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。搜山虎中、高劑量組小鼠血清中的SOD活力高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;搜山虎中、高劑量組小鼠血清中的MDA含量均低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或0.01）;搜山虎中、高劑量組的小鼠在常壓條件下耐缺氧存活時(shí)間均長(zhǎng)于正常對(duì)照組（P<0.01）;搜山虎中、高劑量組小鼠斷頭后張口次數(shù)多于正常對(duì)照組，喘息維持時(shí)間均長(zhǎng)于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或0.01）;四組小鼠肝臟指數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

結(jié)論?搜山虎水提液具有抗疲勞、耐缺氧作用，對(duì)小鼠肝臟無(wú)明顯影響。

【關(guān)鍵詞】?搜山虎;抗疲勞;耐缺氧;小鼠

中圖分類號(hào)：R977.2;R589.1?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2019.10.005

Experimental study on the effect of water extract ofZanthoxylum austrosinenseHuang on fatigue resistance and hypoxia tolerance in mice

LIU Xueting1，WEI Qiuju1，ZHOU Xiaosu1，YANG Fengwen1，LUO Caifeng1，HUANG Yongyi2

（1.Class 2，Grade 2015 of Pharmaceutical Undergraduate，2.Functional Experimental Teaching Center，Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，China）

【Abstract】?Objective?To study the effect of the water extract of Zanthoxylum austrosinense Huang on fatigue resistance and hypoxia tolerance in mice.

Methods?Mice were randomly divided into the following four groups：normal control group and three dose groups of water extract of Zanthoxylum austrosinense Huang—low dose group（10 g/kg），medium dose group（20 g/kg） and high dose group（40 g/kg）.After 7 days of continuous intragastric administration，fatigue resistance function in mice was evaluated by weight-bearing swimming exhaustion test，and hypoxia tolerance function in mice was evaluated by hypoxia tolerance test under ordinary pressure and acute cerebral ischemia and anoxia test.The activity of superoxide dismutase（SOD） in serum and the content of maleic dialdehyde（MDA） in serum of mice were measured to explore its mechanism.In addition，the effect of liquid medicine on the liver of mice was also detected.

Results?The exhaustion time of weight-bearing swimming of the low dose group，the medium dose group and the high dose group was longer than that of the control group（P<0.05 or 0.01），while the differences of pairwise comparisonbetween thelow dose group，the medium dose group and the high dose group were not statistically significant（P>0.05）.The activity of SOD in serum of mice in the medium dose group and the high dose group was higher than that of normal control group，difference was statistically significant（P<0.05）;the content of MDA in serum of mice in the medium dose group and high dose group was less than that of normal control group，the difference was statistically significant（P<0.05 or 0.01）.Survival time of hypoxia tolerance in mice under ordinary pressure of the medium dose group and high dose group was longer than that of the normal control group（P<0.01）.Compared with the control group，the medium dose group and the high dose group had more times of mouth opening and longer duration of wheezing，the difference was statistically significant（P<0.05 or 0.01）.There was no statistically significant difference in liver indexes among the four groups（P>0.05）.

Conclusion?The water extract of Zanthoxylum austrosinense Huang has the function of fatigue resistance and hypoxia tolerance，but has no obvious effect on the liver of mice.

【Key words】?Zanthoxylum austrosinense Huang;fatigue resistance;hypoxia tolerance;mouse

搜山虎（Zanthoxylum austrosinense Huang）是蕓香科植物花椒屬的根，主要產(chǎn)于浙江、江西、湖南、廣東、廣西，其成分有阿托品堿、天仙子堿。在《中華本草》中也有關(guān)于搜山虎的相關(guān)記載，當(dāng)代多用于祛風(fēng)解表，行氣活血，消腫止痛，主要適用于感冒風(fēng)寒，風(fēng)濕痹痛，跌打腫痛等。在《素問(wèn)·宣明五氣》中提到“久視傷血，久臥傷氣，久行傷筋，久立傷骨”，說(shuō)明過(guò)度疲勞會(huì)損害人的氣血，傷及筋骨，疲勞是屬于氣血耗損而引起的虛癥[1]。研究顯示[2]，活血行氣藥佛手能夠明顯延長(zhǎng)小鼠的負(fù)重游泳力竭的時(shí)間，表明其可增強(qiáng)小鼠抗運(yùn)動(dòng)性疲勞的能力。具有舒筋活絡(luò)、活血祛瘀功效的紅花牡丹膏方可明顯減少小鼠從棒上跌落的次數(shù)，有很好的抗疲勞功效[3]。因此我們推測(cè)具有活血行氣的藥物可能具有抗疲勞的功效。本課題組通過(guò)對(duì)小鼠負(fù)重游泳力竭實(shí)驗(yàn)、小鼠常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)以及小鼠急性腦缺血缺氧實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)小鼠負(fù)重游泳力竭后血清中超氧化物歧化酶（super oxid dismutase，SOD）活性和丙二醛（maleic dialdehyde，MDA）含量及測(cè)定小鼠肝臟指數(shù)來(lái)對(duì)搜山虎作用進(jìn)行初步探討，旨在為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?試劑

SOD試劑盒（批號(hào)：20180104）和MDA測(cè)試盒（批號(hào)：20180103）購(gòu)于南京建成生物工程研究所;白凡士林（批號(hào)：180101，南昌華鑫醫(yī)藥化工有限公司）;鈉石灰（批號(hào)：180429，西隴化工股份有限公司）。

1.2?儀器

游泳箱（長(zhǎng)60 cm，寬60 cm，深40 cm）;鉛條，手術(shù)器械，250 mL廣口玻璃瓶，722N型可見分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司），電子天平（型號(hào)：JM-B1003，余姚市紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司）;電熱恒溫水溫箱（型號(hào)：H.SWX-600BS，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）;離心機(jī)（型號(hào)：TGL-16G，上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.3?動(dòng)物

清潔級(jí)昆明種小鼠120只，雌雄各半，體重18～22 g，由右江民族醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為：SYXK桂2017-0004。

1.4?藥品

中藥搜山虎采購(gòu)于廣西百色市市區(qū)回春藥店，經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院民族醫(yī)藥教研室覃道光副教授鑒定為蕓香科植物花椒屬的干燥根莖。

1.5?實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1?搜山虎水提物的制備[4]

將搜山虎粉碎，稱取250 g藥材，加入10倍體積的蒸餾水浸泡1 h，武火煮沸后文火煎煮0.5 h，用紗布過(guò)濾得到第一次濾液，再加入適量的蒸餾水進(jìn)行煎煮0.5 h后，過(guò)濾得到第二次濾液，合并兩次濾液，濃縮至100 mL。最后將濃縮好的藥液放入冰箱中保存，用時(shí)恢復(fù)至室溫，用原液2.5 g/mL分別用蒸餾水稀釋至2.0 g/mL和1.0 g/mL。

1.5.2?動(dòng)物分組及處理

120只小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為3批，每批40只。第一批，取40只小鼠，按體重隨機(jī)分成正常對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組10只，用于小鼠負(fù)重游泳力竭實(shí)驗(yàn)和小鼠游泳力竭后血清中SOD活力以及MDA含量的測(cè)定。第二批，取40只小鼠，按體重隨機(jī)分成正常對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組10只，用于小鼠常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)。第三批，取40只小鼠，按體重隨機(jī)分成正常對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組10只，用于小鼠急性腦缺血缺氧實(shí)驗(yàn)和小鼠肝臟指數(shù)的測(cè)定。每批實(shí)驗(yàn)小鼠均分為正常對(duì)照組和搜山虎水提液低、中、高（10 g/kg、20 g/kg、40 g/kg）三個(gè)劑量組，采用小鼠灌胃法，正常對(duì)照組按體重給0.1 mL/10 g蒸餾水灌胃;低、中、高劑量組分別給予小鼠不同劑量的受試物，并按給藥容積0.1 mL/10 g，1次/d，連續(xù)灌胃給藥7 d，然后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.5.3?小鼠負(fù)重游泳力竭實(shí)驗(yàn)[5]

各組小鼠連續(xù)灌胃7 d后，于末次給藥前進(jìn)行稱重后再灌胃給藥，給藥1 h后，給小鼠尾部系其體重5%的鉛絲，然后放在游泳箱中游泳（游泳箱水深大約放到30 cm，水溫調(diào)為25℃），每個(gè)游泳池箱只放入10只小鼠，以小鼠頭部全部進(jìn)入水中并持續(xù)8 s沒(méi)有浮出水面作為判定終點(diǎn)，該時(shí)間則記為小鼠負(fù)重游泳力竭時(shí)間。

1.5.4?小鼠力竭后血清SOD活力、MDA含量的測(cè)定

從負(fù)重游泳力竭實(shí)驗(yàn)的小鼠游泳結(jié)束后，休息0.5 h，摘取小鼠眼球，取血，進(jìn)行離心，靜置后抽取血清，并按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，測(cè)定力竭后小鼠血清中的SOD活力和MDA含量。

1.5.5?小鼠常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)[6]

各組小鼠連續(xù)灌胃7 d后，于末次給藥前進(jìn)行稱重后再灌胃給藥，給藥1 h后，將小鼠分別放入盛有10 g鈉石灰的250 mL的廣口玻璃瓶?jī)?nèi)，采用白凡士林將瓶口涂抹并蓋嚴(yán)，保證玻璃瓶密封性良好，蓋上瓶蓋立即計(jì)時(shí)，以呼吸停止（小鼠掙扎抽搐后突然癱瘓，胸部沒(méi)有任何波動(dòng)）為觀察截點(diǎn)，記錄小鼠在密閉廣口玻璃瓶?jī)?nèi)的存活時(shí)間，該時(shí)間記為小鼠常壓耐缺氧的存活時(shí)間。

1.5.6?小鼠急性腦缺血缺氧實(shí)驗(yàn)[7～8]

各組小鼠連續(xù)灌胃7 d，于末次灌胃前稱重后再灌胃給藥，給藥1 h后，手抓穩(wěn)老鼠，迅速?gòu)男∈蠖? mm逐只斷頸，立即計(jì)時(shí)，觀察并記錄小鼠張口喘息的次數(shù)和喘息維持的時(shí)間。

1.5.7?測(cè)定小鼠肝臟指數(shù)[9]

于小鼠急性腦缺血缺氧實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，立即解剖小鼠，取出小鼠肝臟，稱取每只小鼠肝臟重量，并仔細(xì)記錄下來(lái)。肝臟指數(shù)=肝濕重（g）/體重（g）×100%。

1.6?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料服從正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組之間的比較，采用單因素方差分析，組間進(jìn)一步兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2?結(jié)果

2.1?搜山虎水提液對(duì)小鼠負(fù)重游泳力竭時(shí)間的影響

四組小鼠負(fù)重游泳力竭時(shí)間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），其中搜山虎水提液低、中、高劑量組的小鼠負(fù)重游泳力竭時(shí)間均高于正常對(duì)照組 （P<0.05或0.01），而低、中、高三個(gè)劑量組兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。提示搜山虎水提液能夠延長(zhǎng)小鼠負(fù)重游泳力竭時(shí)間，但無(wú)量效相關(guān)性。見表1。

2.2?搜山虎水提液對(duì)游泳力竭小鼠血清SOD和MDA的影響

四組小鼠游泳力竭小鼠血清SOD活力和MDA含量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或0.01）。其中搜山虎中、高劑量組小鼠血清中的SOD活力高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;搜山虎低劑量組的SOD活力也高于正常對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;搜山虎中、高劑量組小鼠血清中的MDA含量均低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或0.01）;搜山虎低劑量組的MDA含量也低于正常對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。提示中、高劑量的搜山虎水提液能明顯提高負(fù)重游泳力竭后小鼠血清中的SOD活力，降低小鼠血清中MDA含量。見表2。

2.3?搜山虎水提液對(duì)小鼠常壓耐缺氧能力的影響

四組小鼠常壓耐缺氧能力比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），其中搜山虎中、高劑量組的小鼠在常壓條件下耐缺氧存活時(shí)間均長(zhǎng)于正常對(duì)照組（P<0.01）;搜山虎低劑量組存活時(shí)間也長(zhǎng)于正常對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。提示中、高劑量搜山虎水提液能明顯延長(zhǎng)小鼠常壓耐缺氧的存活時(shí)間。見表3。

2.4?搜山虎水提液對(duì)小鼠斷頭喘息的影響

四組小鼠斷頭后喘息次數(shù)及喘息維持時(shí)間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或0.01）。其中搜山虎中、高劑量組小鼠斷頭后張口次數(shù)多于正常對(duì)照組，喘息維持時(shí)間長(zhǎng)于正常對(duì)照組（P<0.05或0.01）;搜山虎低劑量組小鼠的張口次數(shù)多于正常對(duì)照組，喘息時(shí)間也長(zhǎng)于正常對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。提示中、高劑量搜山虎水提液能明顯增加小鼠斷頭后的張口喘息次數(shù)，并且能延長(zhǎng)小鼠斷頭后的喘息維持時(shí)間，有耐缺氧作用。見表4。

2.5?搜山虎水提液對(duì)小鼠肝臟指數(shù)的影響

四組小鼠肝臟指數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。提示試藥劑量對(duì)小鼠肝臟無(wú)明顯影響。見表5。

3?討論

疲勞是一種普遍生理現(xiàn)象和心理現(xiàn)象，是指腦力和體力到達(dá)一定程度后出現(xiàn)人體功能暫時(shí)性下降的現(xiàn)象。運(yùn)動(dòng)耐力的提高是機(jī)體抗疲勞能力加強(qiáng)的最直接表現(xiàn)，檢測(cè)機(jī)體的生化指標(biāo)和耐力實(shí)驗(yàn)是目前評(píng)價(jià)疲勞的常用方法[10]。

SOD屬于重要的抗氧化酶，是存在于機(jī)體內(nèi)的清除氧自由基因子，在減少氧自由基對(duì)機(jī)體造成損傷及抗疲勞等方面發(fā)揮著很重要的作用。其活力水平可反映機(jī)體清除自由基、抗氧化的能力。MDA是氧自由基脂質(zhì)過(guò)氧化分解產(chǎn)物，促使蛋白質(zhì)變性，具有細(xì)胞毒性，其含量可反映機(jī)體內(nèi)抗氧化能力和清除氧化產(chǎn)物的能力[11～12]。唐華偉等[13]研究報(bào)道，機(jī)體運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生疲勞的重大原因是自由基及活性氧的增加，導(dǎo)致機(jī)體受到損害。

本實(shí)驗(yàn)中，測(cè)定小鼠負(fù)重游泳力竭時(shí)間，并檢測(cè)負(fù)重游泳力竭小鼠血清中SOD活力和MDA含量。結(jié)果顯示，搜山虎中、高劑量組小鼠可明顯延長(zhǎng)小鼠的負(fù)重游泳力竭時(shí)間，說(shuō)明搜山虎水提液可以提高小鼠的運(yùn)動(dòng)耐力，具有抗疲勞作用。在小鼠游泳力竭后檢測(cè)其血清SOD活力及MDA含量，結(jié)果顯示，小鼠血清SOD活性增加，這說(shuō)明搜山虎有助于減少自由基和提高抗氧化能力，減輕有害物質(zhì)對(duì)小鼠機(jī)體的侵害;小鼠血清MDA含量降低，表明搜山虎有助于提高清除機(jī)體運(yùn)動(dòng)后產(chǎn)生自由基的能力，達(dá)到抗疲勞效果。

缺氧是機(jī)體所產(chǎn)生的一種緊張性刺激，在現(xiàn)實(shí)生活中經(jīng)常會(huì)出現(xiàn)缺氧的現(xiàn)象，運(yùn)動(dòng)對(duì)機(jī)體耗氧量增加，體內(nèi)相對(duì)供氧不足就會(huì)造成缺氧，輕度缺氧會(huì)影響機(jī)體新陳代謝，重度缺氧會(huì)使心腦受損，甚至?xí)蜓豕?yīng)不足而死亡[14]，因此，研究缺氧是有重要意義的。評(píng)價(jià)缺氧能力常用的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪切∈蟪耗腿毖跄Ｐ蚚15]。在本次常壓耐缺氧實(shí)驗(yàn)中，搜山虎水提液中、高劑量組小鼠耐缺氧時(shí)間明顯延長(zhǎng)，說(shuō)明搜山虎具有抗常壓缺氧的作用;在小鼠急性腦缺血缺氧實(shí)驗(yàn)中，搜山虎水提液中、高劑量組小鼠斷頭后張口次數(shù)多于正常對(duì)照組，喘息維持時(shí)間長(zhǎng)于正常對(duì)照組，說(shuō)明中、高劑量搜山虎水提液能增加小鼠斷頭后的張口喘息次數(shù)，并且能延長(zhǎng)小鼠斷頭后的喘息維持時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明搜山虎具有抗常壓缺氧的作用;同時(shí)在檢測(cè)其肝臟指數(shù)結(jié)果顯示，搜山虎在本實(shí)驗(yàn)劑量下對(duì)小鼠肝臟無(wú)明顯影響。

綜上，搜山虎具有抗疲勞及耐缺氧作用，其發(fā)生機(jī)制可能與提高機(jī)體血清中SOD活力和降低MDA含量有關(guān)。是否還有其他的作用機(jī)制，有待于進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2019-08-06?修回日期：2019-09-16）