花生生長素響應(yīng)因子基因AhARF3的克隆與表達(dá)分析

唐桂英　崔維佩　徐平麗　李鵬祥　朱潔瓊　單雷

摘要：生長素響應(yīng)因子（auxin response factor， ARF）是調(diào)控生長素響應(yīng)基因表達(dá)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的一類轉(zhuǎn)錄因子，在植物生長發(fā)育的各個階段均起重要的調(diào)節(jié)作用。本研究基于花生種子萌發(fā)前后轉(zhuǎn)錄表達(dá)差異分析，克隆到1個生長素響應(yīng)因子基因AhARF3。序列分析結(jié)果顯示，該基因的ORF區(qū)為2 115 bp，編碼704個氨基酸，推測相對分子量為72.92 kD，等電點(diǎn)6.86。不同器官表達(dá)譜分析結(jié)果顯示，AhARF3為組成性表達(dá)，莖中的表達(dá)量最高，根與花中的表達(dá)量較低且近似，干種子中最低。種子萌發(fā)過程的表達(dá)分析顯示，萌發(fā)10～72 h 的種子中AhARF3表達(dá)量均比干種子中極顯著增加，尤其是萌發(fā)48～72 h，AhARF3的表達(dá)水平不僅比萌發(fā)前期各階段種子中的大幅上調(diào)，與根、莖、葉、花及各發(fā)育階段的種子相比，也具有明顯的表達(dá)優(yōu)勢。

關(guān)鍵詞：花生;生長素響應(yīng)因子;基因表達(dá);萌發(fā)

中圖分類號：S565.2：Q785文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2019）09-0050-06

Cloning and Expression Analysis of AhARF3 Gene in Peanut

Tang GuiyingCui Weipei2， Xu PingliLi Pengxiang2， Zhu Jieqiong2， Shan Lei2

（1. Biotechnology Research Center， Shandong Academy of Agricultural Sciences/Shandong Provincial Key

Laboratory of Crop Genetic Improvement， Ecology and Physiology， Jinan 250100， China; 2. College of Life Sciences，

Shandong Normal University， Jinan 250014， China）

Abstract Auxin response factor （ARF） is a kind of important transcription factor in regulating the expression of auxin response genes and signal transduction， which is involved in various development processes in plant. In this study， the cDNA of AhARF3 gene was cloned and analyzed based on the comparative analysis of transcriptomic data between dry seeds and newly germinated seeds. Sequence analysis results showed that the ORF length of AhARF3 was 2 115 bp， which encoded 704 amino acids， and the relative molecular weight was estimated to be 72.92 kD and the isoelectric point was 6.86. The results of qRT-PCR showed that AhARF3 was expressed by the constitutive type， the expression level was the highest in stems and the lowest in dry seeds. The expression level of AhARF3 in seeds germinated for 10～72 hours was significantly higher than that in dry seeds， especially 48～72 hours after germination， and was not only significantly higher than that in pre-germination stage， but also had obvious expression advantages compared with roots， stems， leaves， flowers and seeds at the other developmental stages.

Keywords Peanut （Arachis hypogaea L.）; Auxin response factor （ARF）; Gene expression; Germination

生長素響應(yīng)因子（auxin response factor， ARF）是一類能夠調(diào)節(jié)生長素響應(yīng)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，它通過特異性識別并結(jié)合生長素應(yīng)答元件，激活或抑制基因的表達(dá)[1]。ARF蛋白一般包含3個結(jié)構(gòu)域：N端的B3類DNA結(jié)合域（DNA binding domain， DBD）、中間的MR結(jié)構(gòu)域-抑制結(jié)構(gòu)域（repression domain， RD）或激活結(jié)構(gòu)域（activation domain， AD）和C端的二聚化作用的結(jié)構(gòu)域（carboxy-terminal dimerization domain， CTD）[2]。ARF的功能與植物細(xì)胞內(nèi)生長素的濃度密切相關(guān)，當(dāng)生長素濃度較低時，生長素響應(yīng)基因Aux/IAA與ARF形成異源二聚體，ARFs的作用被抑制;當(dāng)生長素濃度升高到一定水平，Aux/IAA經(jīng)泛素化途徑快速降解，ARFs被釋放并與生長素響應(yīng)元件TCGTCTC結(jié)合，生長素響應(yīng)基因被激活或抑制，植物體隨之發(fā)生一系列生長素反應(yīng)[3]。

植物基因組中ARF家族成員眾多，隨著大量物種基因組測序的完成和基因功能分析的深入，越來越多的ARF基因家族成員被鑒定和研究，如擬南芥[4]、水稻[5]、番茄[6]、楊樹[7]、葡萄[8]等。ARF參與植物生長發(fā)育的各個生物學(xué)過程。在營養(yǎng)生長期，它影響葉片的生長發(fā)育[9]、側(cè)根的發(fā)生[10]、維管組織的形成[11]等;在生殖生長期，對花器官的形成、雌蕊的生長模式、胚珠的發(fā)育等方面具有重要作用[12-14]。另有研究表明，擬南芥中ARF10、ARF16和ARF17的表達(dá)水平與種子休眠性呈正相關(guān)[15]。

本研究基于豐花1號花生干種子與萌發(fā)露白期種子轉(zhuǎn)錄組的差異表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)AhARF3在萌發(fā)露白期種子中的表達(dá)水平顯著高于干種子，推測該基因在花生種子萌發(fā)過程中起重要作用，繼之對該基因進(jìn)行克隆與表達(dá)譜分析，以期為AhARF3的生物學(xué)功能研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

花生品種：豐花1號由本實(shí)驗(yàn)室保存，種植于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院飲馬泉試驗(yàn)田。出苗20 d左右取根、莖、葉;盛花期間取盛開花朵，并把細(xì)塑料繩綁系于即將入土的果針基部，分別于入土10、20、30、40、50、60、70 d取不同發(fā)育時期的種子;待成熟飽滿種子吸漲后，置于25℃培養(yǎng)，取萌發(fā)4、10、16、24、32、48、72 h的種子。所取樣品均經(jīng)液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 菌株及質(zhì)粒

大腸桿菌DH5α（Escherichia coli）和pEASY-T1[JP] Simple克隆載體，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要試劑

Quick RNA isolation Kit，購自北京華越洋生物科技有限公司;PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit，購自寶生物工程（大連）有限公司;2×[JP]TransTaq High Fidelity（HiFi）PCR SuperMixⅡ（-dye）和TransStart Tip Green qPCR SuperMix，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;瓊脂糖凝膠回收試劑盒和DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，購自上海捷瑞生物技術(shù)有限公司;PCR擴(kuò)增引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成;DNA序列測定由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院測序中心完成;其余生化試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.4 AhARF3基因的cDNA克隆

以萌發(fā)露白的種子為材料，利用Quick RNA isolation Kit提取總RNA，參照PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit說明方法反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈。依據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中ESTs參考序列設(shè)計ORF（open reading frame）區(qū)擴(kuò)增引物AhARF3-F（5′-TTCTCATGGCGGGTTTGATTG-3′）、AhARF3-R：（5′-CCAGTGATCATCGCTAACATGC-3′）。參照PCR SuperMixⅡ說明書進(jìn)行相關(guān)PCR反應(yīng)，將產(chǎn)物經(jīng)0.9%瓊脂糖凝膠電泳分析、膠回收試劑盒回收后， 25℃條件下連接到克隆載體pEASY-T1 Simple上，轉(zhuǎn)化并經(jīng)菌落PCR檢測，再送至本單位測序中心測序。

1.5 AhARF3基因的序列分析

利用http：//web.expasy.org/protparam/ 在線分析AhARF3基因編碼蛋白的氨基酸組成、理論分子量和等電點(diǎn);蛋白序列的跨膜區(qū)分析和信號肽分析分別利用TMHMM 2.0軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）和SignalP 5.0軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進(jìn)行。AhARF3蛋白的亞細(xì)胞定位利用CELLO （http：//cello.life.nctu.edu.tw） 進(jìn)行預(yù)測。系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建利用MEGA 6.0完成，采用Neighbor-Joining法進(jìn)行1 000次Boot-strap分析。

1.6 AhARF3基因的表達(dá)模式分析

以花生根、莖、葉、花、不同發(fā)育時期種子以及不同萌發(fā)時期種子為材料，提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，利用實(shí)時熒光定量PCR方法，以qRT-PCR-ARF3-F（5′-GGGAAAGCTCAGGAAGGAAAA-3′）和qRT-PCR-ARF3-R（5′-CTCTCGGCTCTGATCTTGAATC-3′）為引物，[JP3]以UBI2（qRT-PCR-UBI-F：5′-AAGCCGAAGAAGATCAAGCAC-3′和qRT-PCR-UBI-R：5′-GGTTAGCCATGAAGGTTCCAG-3′）為內(nèi)參基因。[JP]反應(yīng)體系、PCR程序和相對表達(dá)量計算方法參照唐桂英等[16]的方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 AhARF3基因cDNA克隆

以豐花1號萌發(fā)露白種子第一鏈cDNA為模板，利用特異引物AhARF3-F和AhARF3-R擴(kuò)增到2 100 bp左右的條帶（圖1）。經(jīng)克隆測序分析，獲得一條包含ORF為2 115 bp的cDNA序列，命名為AhARF3。將該基因序列在花生基因組數(shù)據(jù)庫（https：//www.peanutbase.org/blast）中在線比對，發(fā)現(xiàn)該基因定位于栽培種花生B染色體組中。

2.2 AhARF3基因及編碼氨基酸序列分析

基因序列分析表明：AhARF3編碼704個氨基酸，推測相對分子量為72.92 kD，等電點(diǎn)6.86。利用NCBI網(wǎng)站中CDD（Conserved Domain Database）數(shù)據(jù)庫對AhARF3蛋白進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果（圖2）顯示，AhARF3蛋白含有B3 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DBD）和ARF結(jié)構(gòu)域Auxin_resp，符合ARF的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。非保守區(qū)（MR）含量豐富的氨基酸為Ser 13.9%、Gly 9.4%、Pro 6.2%。以TMHMM 2.0、CELLO與SignalP 5.0軟件分析，顯示AhARF3沒有跨膜區(qū)，為核內(nèi)蛋白。

2.3 AhARF3氨基酸比對與系統(tǒng)分析

設(shè)苔蘚類植物地錢（Marchantia polymorpha）為外類群，利用MEGA 6.0軟件，對本研究克隆得到的AhARF3和GenBank數(shù)據(jù)庫中33種高等植物（表1）ARF3的氨基酸序列構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3）。結(jié)果顯示，系統(tǒng)樹中高等植物聚成單子葉植物和雙子葉植物兩大分支。花生AhARF3與大豆、菜豆、蒺藜苜蓿等豆科植物聚在一個亞分支，同源性較高，其中與相思豆和大豆氨基酸序列相似率分別為75%、72%;而與蘋果、擬南芥、煙草等所在分支親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與擬南芥ArathARF3序列一致性為57%。該基因編碼的氨基酸序列與單子葉植物水稻OrysaARF3的相似性僅為49%（圖3）。

將花生AhARF3氨基酸序列與大豆、擬南芥和水稻等直系同源基因編碼的GlymaARF3、ArathARF3和OrysaARF3等氨基酸序列進(jìn)行比對，結(jié)果（圖4）顯示，B3 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域在不同物種間的保守性很強(qiáng)，一致性達(dá)96.73%;Auxin_resp結(jié)構(gòu)域的保守性則較弱。

2.4 花生AhARF3基因表達(dá)分析

以UBI2為內(nèi)參基因，對AhARF3基因在根、莖、葉、花、不同發(fā)育時期種子以及不同萌發(fā)時段的種子進(jìn)行qRT-PCR分析。結(jié)果（圖5）顯示，AhARF3在花生根、莖、葉、花和干種子中均有表達(dá)，但表達(dá)水平存在差異。莖中的表達(dá)量最高，根與花中的表達(dá)量較低且近似，干種子中最低。

由圖6可知，AhARF3在花生種子發(fā)育早中期表達(dá)量較高，隨著種胚發(fā)育成熟度的提高，表達(dá)水平呈下降趨勢;在收獲晾干的種子中表達(dá)量最低。

萌發(fā)4 h的種子AhARF3基因表達(dá)水平與干種子相當(dāng)，隨著萌發(fā)時間的延長，其表達(dá)水平呈增長趨勢，萌發(fā)10 h后即極顯著高于干種子;萌發(fā)72 h時其表達(dá)量是所研究萌發(fā)過程中的最高水平，比干種子提高約100倍（圖7）。另外，通過比較不同組織、不同發(fā)育時期種子與吸水萌發(fā)種子的相對表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)AhARF3基因在萌發(fā)48～72 h種子中的表達(dá)量明顯高于根、莖、葉、花及不同發(fā)育時期的種子。

3 討論與結(jié)論

ARF作為參與生長信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育過程中起重要作用。隨著測序技術(shù)與分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，許多植物中ARF被鑒定與研究?；ㄉ鳛橹匾慕?jīng)濟(jì)作物與油料作物，基因組測序開展相對較晚，關(guān)于花生ARF的研究鮮有報道。本研究從萌發(fā)露白花生種子中克隆到AhARF3基因，經(jīng)生物信息學(xué)分析證明AhARF3屬于ARF家族。ARF的非保守區(qū)域（MR）富含氨基酸種類的不同往往決定其轉(zhuǎn)錄活性，擬南芥ARF蛋白轉(zhuǎn)染試驗(yàn)證明，AtARF1～4和AtARF9蛋白非保守中間區(qū)域富含脯氨酸，具有轉(zhuǎn)錄抑制活性;而AtARF5～8和AtARF19非保守區(qū)富含谷氨酰胺，具有轉(zhuǎn)錄激活活性[ 17]。本研究中，花生AhARF3的非保守區(qū)含量最高的氨基酸為絲氨酸、甘氨酸和脯氨酸。并且，該蛋白與擬南芥中轉(zhuǎn)錄抑制子AtARF3的氨基酸序列都包含B3 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、Auxin_resp結(jié)構(gòu)域，缺失Aux/IAA結(jié)構(gòu)域，推測該轉(zhuǎn)錄因子可能具有轉(zhuǎn)錄抑制作用。

已有研究表明，ARF基因在多種植物組織、器官中表現(xiàn)出組成性和冗余性表達(dá)的特點(diǎn)[18]。以往對石榴、黃瓜ARF基因家族的組織表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)的ARF基因在不同組織中均有表達(dá)，說明它們在植物中具有廣泛的調(diào)控作用[19，20]。本研究中，AhARF3在花生根、莖、葉、花和不同發(fā)育時期種子中均有表達(dá)，暗示該基因在植物各組織器官形成與生長發(fā)育過程中起重要的調(diào)控作用。

生長素是重要植物激素之一，對向性生長、組織分化等過程的調(diào)控已有大量深入研究。另有研究證實(shí)，其對種子休眠也有重要影響。過量表達(dá)ARF10與ARF16的轉(zhuǎn)基因擬南芥種子休眠性比對照顯著增強(qiáng)[21]，而通過過量表達(dá)MIR160降低靶標(biāo)基因ARF10、ARF16和ARF17表達(dá)水平，轉(zhuǎn)基因種子休眠程度則比野生對照顯著降低[15]，表明種子內(nèi)生長素信號強(qiáng)度發(fā)生變化時，其休眠水平會受到影響。擬南芥中ARF3基因發(fā)生突變時，花器官形態(tài)畸形，表現(xiàn)為花被數(shù)目增多、雄蕊數(shù)目減少、雌蕊形態(tài)異常等，表明該基因在花芽分化及維持花器官形態(tài)方面起重要作用[22]。解剖學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)花生的花芽分化發(fā)生在種子萌發(fā)后期[23]，而本研究中，種子吸水萌發(fā)48～72 h時AhARF3的表達(dá)量急劇增加，與干種子相比提高幾十甚至上百倍，因此，花生AhARF3是否也參與了種子萌發(fā)后期花芽分化過程的調(diào)控，還需更加細(xì)致的表達(dá)分析與功能鑒定。

參 考 文 獻(xiàn)：

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收稿日期：2019-08-16

基金項目：山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程項目（CXGC2018E13）

作者簡介：唐桂英（1978—），女，碩士，副研究員，研究方向：植物分子遺傳。E-mail： guiyingtang88306@163.com

通訊作者：單雷（1965—），女，博士，研究員，研究方向：植物分子遺傳。E-mail： shlei1025@sina.com