孕中期血性羊水細(xì)胞改良培養(yǎng)法質(zhì)量分析

陳儉輝 趙連芳 景亞玲 李曉紅

【摘要】 目的：探索孕中期血性羊水細(xì)胞高效的培養(yǎng)方法。方法：采用普通培養(yǎng)瓶法對(duì)46例血性羊水細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并對(duì)培養(yǎng)情況進(jìn)行質(zhì)量分析。結(jié)果：46例血性羊水中45例一次培養(yǎng)成功，1例嚴(yán)重新鮮血性羊水培養(yǎng)失敗，培養(yǎng)成功率為97.8%。結(jié)論：提高羊水細(xì)胞培養(yǎng)成功率，優(yōu)化血性羊水的培養(yǎng)及收獲條件，能夠?yàn)榕R床提供準(zhǔn)確的產(chǎn)前診斷報(bào)告，對(duì)指導(dǎo)優(yōu)生優(yōu)育、預(yù)防出生缺陷具有重要意義。

【關(guān)鍵詞】 血性羊水;產(chǎn)前診斷;質(zhì)量控制

我國(guó)是出生缺陷大國(guó)，由于人口基數(shù)大，每年都有80～120萬(wàn)出生缺陷兒降生，目前沒(méi)有特異性的治療手段，只有通過(guò)實(shí)時(shí)的產(chǎn)前診斷和出生干預(yù)才能做到出生缺陷防控[1]。染色體病是出生缺陷最常見(jiàn)的原因，當(dāng)前診斷的金標(biāo)準(zhǔn)就是染色體核型分析。血性羊水標(biāo)本會(huì)嚴(yán)重影響羊水細(xì)胞的培養(yǎng)，所以提高血性羊水的培養(yǎng)成功率能有效地減輕孕婦重新穿刺的痛苦，也能提高產(chǎn)前診斷效率。本研究通過(guò)對(duì)46例血性羊水標(biāo)本培養(yǎng)方法進(jìn)行改良研究，提高了血性羊水的培養(yǎng)成功率。

1資料與方法

1.1研究資料

2017年1月至2018年12月，在本院產(chǎn)前診斷中心咨詢，因有各種高危產(chǎn)前診斷指征接受羊水穿刺的46例血性羊水孕婦，孕婦孕周17～25周。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本收集穿刺孕婦在了解羊水穿刺風(fēng)險(xiǎn)和相關(guān)注意事項(xiàng)后，簽署知情同意書，完成穿刺前檢查血常規(guī)、凝血功能、血型、乙肝、丙肝、梅毒、艾滋等。B超下觀察胎盤位置，羊水量及深度，確定穿刺部位，并做好記錄，無(wú)菌條件下穿刺取羊水細(xì)胞20mL，記錄羊水性狀（顏色、渾濁度等）分裝2瓶，送實(shí)驗(yàn)室。穿刺術(shù)后孕婦留院觀察30min，無(wú)異常反應(yīng)并告知術(shù)后注意事項(xiàng)后離院。

1.2.2培養(yǎng)新鮮血性羊水應(yīng)及時(shí)送往實(shí)驗(yàn)室，離心，去上清，剩約1.0～1.5mL，重懸細(xì)胞沉淀，接種到25cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d，換液處理，在原培養(yǎng)瓶加入2mL新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)加入新鮮羊水培養(yǎng)液2mL。同時(shí)將培養(yǎng)瓶中上清倒入新的標(biāo)記培養(yǎng)瓶中，加入2mL新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)靜置培養(yǎng)7d后觀察。對(duì)于克隆島較少的樣本，在無(wú)菌條件下，先將上清進(jìn)行換液處理，再用細(xì)胞刮刮取貼壁細(xì)胞，然后加入新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)。繼續(xù)培養(yǎng)1～2d后觀察。換液后每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，當(dāng)羊水細(xì)胞貼壁生

作者簡(jiǎn)介：陳儉輝（1988-），男，碩士，臨床檢驗(yàn)師。研究方向：產(chǎn)前診斷與遺傳病診斷

*趙連芳為本文通訊作者

長(zhǎng)旺盛，鏡下見(jiàn)多個(gè)克隆和適量圓形、雙圓形透明細(xì)胞時(shí)可收獲。收獲前1d換1次新鮮培養(yǎng)液，使細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)充足。加入濃度20μg/mL的秋水仙素100μL，混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4h后制備。

1.2.3制備將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到15mL的離心管中。用細(xì)胞刮刮取收集羊水細(xì)胞，再用0.9%的氯化鈉溶液清洗1～2次，并轉(zhuǎn)移到離心管中。1600r離心10 min，棄上清。加入0.075mol/L KCL溶液8mL，混勻，37℃低滲8min。然后加入固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）2mL，混勻預(yù)固定5min，1600r離心10min，棄上清。再加入固定液8mL，混勻，固定，1600r離心10min。重復(fù)固定1次。離心后根據(jù)細(xì)胞沉淀量加入新鮮固定液調(diào)懸，然后在25℃、55%濕度環(huán)境將細(xì)胞懸液滴于干凈的玻片上，放置30min。置60℃烤箱2h。

1.2.4G顯帶配置0.025%胰酶溶液，37℃水浴30min后，消化染色體片（不同季節(jié)試片后確定消化時(shí)間）。0.9%的氯化鈉溶液內(nèi)漂洗后Giemsa染色，風(fēng)干。

1.2.5核型分析將顯帶染色體片置于全自動(dòng)掃描儀下掃描，統(tǒng)計(jì)中期數(shù)目。每例計(jì)數(shù)30個(gè)分裂相，分析5～10個(gè)核型。嵌合型核型加倍分析。根據(jù)《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制》（ISCN2013）的標(biāo)準(zhǔn)描述染色體異常核型。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，克隆數(shù)等計(jì)數(shù)資料以率表示。

2結(jié)果

2.1羊水細(xì)胞培養(yǎng)成功率

46例血性羊水中35例為新鮮血性，樣本占76.09%，11例為陳舊血性，樣本占23.91%。45例一次培養(yǎng)成功，1例嚴(yán)重新鮮血性羊水培養(yǎng)失敗，總成功率為97.8%（45/46）。

2.2培養(yǎng)細(xì)胞克隆數(shù)例

初次培養(yǎng)新鮮血性羊水長(zhǎng)勢(shì)較差，細(xì)胞克隆數(shù)較少;陳舊血性羊水長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)較好，克隆數(shù)稍多。換液轉(zhuǎn)種培養(yǎng)后出現(xiàn)相反的趨勢(shì)，新鮮血性羊水克隆數(shù)稍豐富，陳舊血性羊水克隆數(shù)稍少。生長(zhǎng)克隆數(shù)如表1所示。

3討論

羊水穿刺染色體核型分析是目前染色體病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但是一種創(chuàng)傷性的診斷方法，穿刺經(jīng)過(guò)胎盤，就容易使羊水受到血細(xì)胞的污染[23]，大量的血細(xì)胞容易包裹羊水細(xì)胞，使羊水細(xì)胞不易聚集貼壁生長(zhǎng)[4]，所以建立血性羊水細(xì)胞的培養(yǎng)和收獲標(biāo)準(zhǔn)也是診斷所需。

首先，對(duì)于新鮮血性羊水在采集到樣本后，一定要及時(shí)送往實(shí)驗(yàn)室離心，避免血液凝集過(guò)程中將活性羊水細(xì)胞包裹，如發(fā)現(xiàn)血液污染嚴(yán)重，可以加入1滴無(wú)菌肝素溶液，輕輕混勻。羊水接種培養(yǎng)7d后，觀察生長(zhǎng)情況，對(duì)于嚴(yán)重血性羊水進(jìn)行半量換液，其他樣本均全量換液，所有換出來(lái)的液體轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)瓶中加入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。細(xì)胞克隆豐富的樣本只需加入新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)，待處于分裂旺盛期時(shí)加入秋水仙素收獲。對(duì)于克隆島較少的樣本，換液后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。由于胰酶的消化時(shí)間不容易把握，且影響細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)，采用細(xì)胞刮輕輕刮取貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞[5]，然后加入新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)2d后，會(huì)有大量小的細(xì)胞克隆，然后換液處理，加速細(xì)胞生長(zhǎng)，則能收獲到大量羊水細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)新鮮血液羊水換液培養(yǎng)的長(zhǎng)勢(shì)比初次培養(yǎng)較好，可能是因?yàn)榧t細(xì)胞活性的降低和凝血因子等物質(zhì)活性下降，抑制作用降低，羊水細(xì)胞能夠進(jìn)行貼壁生長(zhǎng)所致[67]。

陳舊血性羊水主要是孕婦在穿刺之前出現(xiàn)過(guò)出血狀況，污染了羊水，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的吸收后會(huì)呈現(xiàn)出棕色或褐色，離心后能看到褐色紅細(xì)胞[8]。通過(guò)實(shí)驗(yàn)處理來(lái)看，陳舊血性羊水對(duì)羊水細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)影響稍小，初次培養(yǎng)后，羊水克隆普遍多于新鮮血性羊水，可能是因?yàn)槟蜃拥任镔|(zhì)活性下降的原因。而再次培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)勢(shì)稍差，可能是因?yàn)槌醮闻囵B(yǎng)活性細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，上清活性細(xì)胞少。

羊水培養(yǎng)染色體核型分析是一個(gè)相對(duì)較為繁瑣的實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟都可能影響最終的結(jié)果[9]。而血性羊水的處理會(huì)比常規(guī)處理更為繁瑣，培養(yǎng)時(shí)與環(huán)境交流更多，所以嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)的無(wú)菌操作也是保證成功的前提，把握實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的質(zhì)量控制，合理完善操作規(guī)程以及優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件是制作出高質(zhì)量的染色體片的保證，才能為臨床提供準(zhǔn)確的分析結(jié)果[10]。

綜上所述，改良的血性羊水培養(yǎng)方法和羊水細(xì)胞收獲流程，能夠有效地提高血性羊水的培養(yǎng)成功率，能夠避免孕婦二次穿刺的痛苦，具有較強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

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